樊爽，趙建國，王震俠

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 肝膽胰脾外科A 區(qū)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050）

肝硬化是指由于不同病因長期作用引起的進(jìn)行性、彌漫性的終末期肝病。致病因素主要包括肝炎病毒，酗酒，藥物濫用以及肝臟物質(zhì)代謝紊亂，化學(xué)藥物損害等。肝硬化分為肝功能代償期和肝功能失代償期，其原因是肝纖維化進(jìn)程緩慢。由于反復(fù)持續(xù)的損傷和修復(fù)，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）過度沉積，使肝臟正常的結(jié)構(gòu)破壞，肝小葉和血管結(jié)構(gòu)改建，形成瘢痕組織的肝硬化[1]。在肝硬化組織修復(fù)損傷過程中，肝細(xì)胞雖然具有再生能力，但受到抑制，其再生的肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及生理功能均不完整[2]。肝卵圓細(xì)胞（hepatic oval cells，HOC）是具有多分化潛能的干細(xì)胞，可被激活后分化肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞，參與肝臟的結(jié)構(gòu)與功能的重建[3]。因此，分析肝卵圓細(xì)胞在肝硬化組織中活化的微環(huán)境及作用和修復(fù)肝臟損傷促進(jìn)肝再生的機(jī)制，為肝硬化的治療提供新的策略。

1 HOC 的概念與特征

在人肝臟中，HOC稱為“肝干細(xì)胞”[4]，其形態(tài)學(xué)特點(diǎn)為：體積小，核漿比例大，核呈卵圓形, 胞漿嗜堿性且淺染,細(xì)胞形態(tài)和免疫表型介于肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞之間。目前普遍認(rèn)為HOC主要位于Hering小管[5]。肝干細(xì)胞/祖細(xì)胞與肝臟中的基質(zhì)細(xì)胞，胞外基質(zhì)以及神經(jīng)系統(tǒng)共同組成微環(huán)境稱為肝干細(xì)胞/祖細(xì)胞小境[6]。卵圓細(xì)胞在肝干細(xì)胞/祖細(xì)胞小境中，通過微環(huán)境信號(hào)調(diào)控分化，在正常生理?xiàng)l件下處于休眠或靜止?fàn)顟B(tài)，抑制其分化，而在損傷程度超過成熟肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞代償修復(fù)肝臟的能力時(shí)激活促進(jìn)其分化[7]。

目前尚未發(fā)現(xiàn)特異性的HOC標(biāo)記物，可能與不同來源、階段性表達(dá)和多分化潛能有關(guān)。當(dāng)HOC向肝細(xì)胞方向分化時(shí)，可以表達(dá)肝細(xì)胞標(biāo)志物AFP、ALB、HepParl、G-6-P;當(dāng)HOC向膽管細(xì)胞方向分化時(shí)，可以表達(dá)膽管上皮細(xì)胞標(biāo)記物CK7、CK8、CK18、CK19、α-GTP；HOC還可以表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志物Thy-1、C-kit、CD34、SCF等。因此，HOC表面標(biāo)記物的研究十分必要，可以為鑒定和分離純化提供依據(jù)。

2 HOC 在肝硬化組織中激活的基本條件

HOC在肝硬化組織中激活的基本條件一是肝實(shí)質(zhì)損害，二是有肝再生的需求，三是殘存的肝細(xì)胞再生受阻。在肝硬化組織中，ECM過度沉積，形成不規(guī)則肝細(xì)胞團(tuán)和假小葉結(jié)構(gòu)導(dǎo)致形態(tài)結(jié)構(gòu)異常。肝硬化的異常形態(tài)結(jié)構(gòu)可以直接使肝血管床縮小、閉塞和扭曲，血管受肝再生結(jié)節(jié)擠壓，另外肝纖維化時(shí)肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞窗孔數(shù)減少或消失，內(nèi)皮下連續(xù)基底膜的形成導(dǎo)致肝竇毛細(xì)血管化[8]，阻斷了肝竇血液和肝細(xì)胞間的雙向交換，導(dǎo)致肝細(xì)胞缺血缺氧。同時(shí)肝硬化病理學(xué)改變呈進(jìn)行性發(fā)展，若早期干預(yù)是可逆的，但進(jìn)展期已很難逆轉(zhuǎn)，到后期假小葉形成時(shí)基本不可逆[9]。這些條件導(dǎo)致肝硬化肝細(xì)胞再生的過程緩慢，所需時(shí)間長，以及再生的肝細(xì)胞不能完全發(fā)育成正常的肝細(xì)胞，有些會(huì)發(fā)生變性壞死，喪失正常的功能，再生的結(jié)果仍然是肝硬化。

3 HOC 在肝硬化微環(huán)境中的作用

肝硬化的發(fā)生機(jī)制是十分復(fù)雜的問題。主要是肝EMC的合成與降解的動(dòng)態(tài)平衡失調(diào),導(dǎo)致EMC的合成增多和（或）降解減少，造成EMC的過度沉積，形成肝纖維化，即肝硬化[10]。肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSC）是合成和分泌EMC的主要效應(yīng)細(xì)胞[11]。HSC激活包括兩個(gè)主要階段，即啟動(dòng)和持續(xù)階段。肝細(xì)胞損傷后，啟動(dòng)階段由鄰近細(xì)胞旁分泌刺激和受損肝細(xì)胞產(chǎn)物的存在，即肝臟受損導(dǎo)致肝細(xì)胞、庫普弗細(xì)胞、血小板、肝血管內(nèi)皮細(xì)胞等釋放TGF-β、PLT衍生生長因子、結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor，GTGF）、TNF-α、IL-6等細(xì)胞因子，激活HSC，生成必要的EMC，以便完成損傷后修復(fù)反應(yīng)。持續(xù)激活階段，由于損傷持續(xù)存在，上述體液因子不斷合成分泌，持續(xù)作用于已初始激活的HSC表型，已激活的HSC也可以通過自分泌方式可促進(jìn)新一輪HSC活化，導(dǎo)致肝纖維化反復(fù)進(jìn)行[12]。在HSC激活的過程中，HOC能夠通過合成GTGF，能夠促進(jìn)HSC的增殖和提高EMC分泌的能力[13]。但是，也有研究[14]表明在體外將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的HOC移植入肝纖維化的小鼠中，能夠減輕其肝纖維化的程度。因此，HOC在以HSC為主要效應(yīng)細(xì)胞的肝硬化微環(huán)境中，既能加重肝纖維化，也能抗肝纖維化，同時(shí)還肩負(fù)著促進(jìn)肝臟再生的使命。

4 肝硬化微環(huán)境對(duì)HOC 介導(dǎo)肝臟再生的調(diào)控

適當(dāng)?shù)母斡不h(huán)境是HOC活化的前提條件，并且HOC的數(shù)目與肝纖維化的程度成正相關(guān)[15]，主要是由肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，ECM，組織液，可溶性信號(hào)分子以及神經(jīng)系統(tǒng)構(gòu)成的，直接或間接影響肝卵圓細(xì)胞的活化，增殖和分化等過程。

4.1 肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞

在微環(huán)境中，炎癥細(xì)胞、H S C、成纖維細(xì)胞和庫普弗細(xì)胞等非實(shí)質(zhì)細(xì)胞通過分泌細(xì)胞因子或者直接調(diào)控卵圓細(xì)胞。炎癥細(xì)胞在卵圓細(xì)胞激活反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，分泌多種炎癥因子，如IFN-γ、腫瘤壞死因子樣凋亡微弱誘導(dǎo)劑（tumor necrosis factor like weak induce of apoptosis，TWEAK）、TNF-α、IL-6等能促進(jìn)卵圓細(xì)胞的活化和增殖[16-19]，另外炎癥細(xì)胞還可以通過影響金屬蛋白酶的產(chǎn)生來重塑EMC，這可能是延長對(duì)卵圓細(xì)胞作用反應(yīng)的必要過程[20]。

HSC和成纖維細(xì)胞密切合作，分泌TGF-α和β、肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor，H G F）、酸性成纖維細(xì)胞生長因子（acid IC fibroblast growth factor，aFGF）和表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF），能激活卵圓細(xì)胞并促進(jìn)其增殖[21]。有研究[22]表明HSC能表達(dá)Jagged1，能激活卵圓細(xì)胞Jag/Notch通路誘導(dǎo)分化膽管上皮細(xì)胞。此外，在體外將HSC和卵圓細(xì)胞共同培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)HSC能夠直接誘導(dǎo)卵圓細(xì)胞向肝細(xì)胞方向分化，除了通過細(xì)胞因子等可溶性因子途徑發(fā)揮作用外,與卵圓細(xì)胞的直接接觸也有著重要作用[23]。

庫普弗細(xì)胞是定居于肝內(nèi)的巨噬細(xì)胞，分泌炎癥因子能激活卵圓細(xì)胞，同時(shí)也能影響其分化。有研究[22]表明肝內(nèi)巨噬細(xì)胞吞噬肝細(xì)胞碎片后表達(dá)wnt3a，激活卵圓細(xì)胞上的wnt信號(hào)通路，誘導(dǎo)其向肝細(xì)胞方向分化。

4.2 ECM

是一個(gè)動(dòng)態(tài)的大分子復(fù)合物，包括膠原、非膠原結(jié)構(gòu)糖蛋白以及蛋白多糖，影響著卵圓細(xì)胞的活化與分化。卵圓細(xì)胞需要ECM的沉積以及激活產(chǎn)生基質(zhì)的細(xì)胞，才能夠遷移和分化修復(fù)受損的肝臟[24]。Van Hul等[25]的研究證明了在肝纖維化的小鼠中成纖維細(xì)胞活化和ECM沉積在時(shí)間上要先于祖細(xì)胞擴(kuò)增。層粘連蛋白是糖蛋白家族中的一員，其沉積與卵圓細(xì)胞增殖呈正相關(guān)[26]。層粘連蛋白和纖維連接蛋白在早期肝再生階段可以為卵圓細(xì)胞的增殖提供必要的生長因子和影響卵圓細(xì)胞的分化狀態(tài)[27]。增殖的卵圓細(xì)胞與周圍含有層粘連蛋白的基底膜有關(guān)聯(lián)，隨著卵圓細(xì)胞向肝細(xì)胞方向分化,基底膜逐漸片段化最后消失[27-28]。Matrilin-2是非膠原型細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的家族成員之一，用2-AAF/PH建立卵圓細(xì)胞增殖模型研究發(fā)現(xiàn)Matrilin-2的表達(dá)參與由卵圓細(xì)胞介導(dǎo)的肝臟再生[29]。此外，在體外建立ECM特異性效應(yīng)的研究中與膠原蛋白I共培養(yǎng)的卵圓細(xì)胞會(huì)向膽管細(xì)胞方向分化[30]。

4.3 信號(hào)分子與通路

HOC介導(dǎo)肝臟再生過程需要適當(dāng)?shù)奈h(huán)境，涉及多種的因子參與，激活多條信號(hào)通路促使HOC向肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞方向分化。主要有以下幾條信號(hào)通路：(1) Wnt/β-catenin信號(hào)通路，在體外研究發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)卵圓細(xì)胞向肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞分化[31]。Williams等[32]發(fā)現(xiàn)在2-AAF/PH肝再生動(dòng)物模型中，肝細(xì)胞高度表達(dá)Wnt1蛋白與卵圓細(xì)胞高度表達(dá)Fzd2受體結(jié)合，可以促進(jìn)卵圓細(xì)胞增殖分化為肝細(xì)胞。(2) HGF/c-Met通路是卵圓細(xì)胞激活與分化的關(guān)鍵通路。在c-Met基因敲除小鼠模型，同時(shí)誘導(dǎo)肝臟損傷，體內(nèi)卵圓細(xì)胞增殖出現(xiàn)顯著下降[33]。HGF/c-Met通路不但能促進(jìn)肝卵圓細(xì)胞的活化與增殖，還能誘導(dǎo)卵圓細(xì)胞向肝細(xì)胞方向分化[34]。(3)EGF/EGFR信號(hào)通路能夠誘導(dǎo)卵圓細(xì)胞向膽管上皮細(xì)胞分化，其機(jī)制也是通過Notch信號(hào)分子完成的[34-35]。 (4) OSM/OSM-R信號(hào)通路促進(jìn)卵圓形細(xì)胞分化為肝細(xì)胞，從而促進(jìn)肝臟再生[36]。

4.4 神經(jīng)系統(tǒng)

神經(jīng)調(diào)控機(jī)制也參與了HOC調(diào)控過程。Oben等[37]研究發(fā)現(xiàn)利用α-腎上腺素受體拮抗劑抑制交感神經(jīng)系統(tǒng)后，肝內(nèi)卵圓細(xì)胞增生積聚，同時(shí)肝細(xì)胞的壞死和脂肪變性程度減輕、血清轉(zhuǎn)氨酶降低、肝臟體積增大及重量增加。另外，在大鼠迷走神經(jīng)切斷和人肝移植去神經(jīng)支配后，卵圓細(xì)胞數(shù)目減少，并且發(fā)現(xiàn)在人肝中的肝臟祖細(xì)胞、不典型反應(yīng)性小管和中間型肝細(xì)胞表達(dá)毒蕈堿M3型受體[38]。所以迷走神經(jīng)可能通過乙酰膽堿與卵圓細(xì)胞上的毒蕈堿M3受體結(jié)合激活卵圓細(xì)胞從而促進(jìn)增殖。

5 肝硬化的治療與細(xì)胞移植

對(duì)于肝硬化患者治療應(yīng)提倡早預(yù)防早發(fā)現(xiàn)早治療，延緩疾病進(jìn)展，避免進(jìn)入肝功能失代償期。對(duì)于肝硬化失代償期，傳統(tǒng)的藥物治療不能延長患者生存期，肝移植是唯一行之有效的方法，但是肝移植受到供肝資源，免疫排斥及費(fèi)用等問題限制。因此，干細(xì)胞移植治療失代償期的肝硬化，可以有效改善肝功能和臨床癥狀[39]。HOC作為干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞移植的優(yōu)勢(shì):首先，HOC移植可以克服肝移植的多種不利因素以及移植后發(fā)生的副作用。它可以直接來源于患者，無免疫排斥反應(yīng)，并且可以在體外培養(yǎng)和增殖以及具有雙向分化的能力。其次，HOC體積小，在到達(dá)肝臟實(shí)質(zhì)后更易分散，避免肝血竇的堵塞引起門靜脈高壓。但是HOC移植應(yīng)用臨床尚有許多問題，目前還沒有一種完全有效的分離純化以及鑒別HOC的方法，從而限制了細(xì)胞移植的細(xì)胞來源。另外，HOC的異常分化可能與肝臟腫瘤的發(fā)生有關(guān)[40]。所以, HOC移植應(yīng)用于肝硬化的臨床治療還需要大量理論的闡述和技術(shù)的改進(jìn)。

6 總結(jié)與展望

在肝硬化組織中隨著肝細(xì)胞再生能力不斷的受到抑制，HOC作為干細(xì)胞能夠有效修復(fù)受損的肝組織，其介導(dǎo)肝臟再生的過程與微環(huán)境密切相關(guān)，同時(shí)HOC在肝硬化中具有促進(jìn)或抑制肝纖維化雙重特性，筆者認(rèn)為HOC被激活介導(dǎo)肝再生的過程，同時(shí)可能也對(duì)HSC進(jìn)行激活，兩者相互作用可能會(huì)加重肝硬化的發(fā)展。隨著針對(duì)HOC更多更深入的研究，相信在以闡明HOC介導(dǎo)肝臟再生機(jī)制的背景下，以抗纖維化的HOC為研究方向，可以為細(xì)胞移植治療肝硬化開辟嶄新的途徑。