李 蕾 張 彩

(山東大學藥學院免疫藥物學研究所，濟南 250012)

正常情況下，初始T細胞接受抗原刺激后快速增殖、分化成效應性T細胞，發(fā)揮免疫功能。病原體清除之后，大部分效應T細胞經歷凋亡，只有小部分(5%～10%)存活下來進而分化成記憶性T細胞，在機體再次接受相同病原體入侵時快速、高效產生免疫應答，發(fā)揮保護作用[1-3]。而在慢性病毒感染或腫瘤微環(huán)境中，由于抗原的持續(xù)刺激，T細胞獲得記憶表型的進程受到阻滯，并逐漸失去效應功能，呈現無應答的狀態(tài)，稱為免疫耗竭[3]。1998年，免疫耗竭的概念在小鼠淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus，LCMV)慢性感染中被首次提出[4,5]。隨后，這一現象在其他疾病類型中也逐漸被發(fā)現，例如HIV、HBV、HCV以及腫瘤[6-9]。與效應T細胞相比，耗竭的T細胞表現出功能損傷的狀態(tài)，通常表現為效應分子IFN-γ、TNF-α、IL-2等分泌水平下降，細胞表面多種抑制性受體持續(xù)性高表達，關鍵轉錄調控過程的改變以及能量代謝變化[3,10]。CD8+T細胞免疫耗竭是目前研究最為廣泛和深入的，除CD8+T細胞之外，CD4+T細胞、B細胞、NK細胞等免疫細胞也會發(fā)生免疫耗竭[11-13]。免疫細胞耗竭現象在腫瘤及慢性感染中普遍存在，不利于機體免疫系統殺傷腫瘤細胞及清除病毒感染，并且現已發(fā)現調控免疫細胞耗竭的途徑多樣且復雜。本文就目前對免疫細胞耗竭研究所取得的進展做一綜述，進而為逆轉免疫細胞耗竭、慢性感染及腫瘤研究和治療提供靶點。

1 耗竭免疫細胞的特點

耗竭的免疫細胞表現出與效應性細胞及記憶性細胞不同的特點。

1.1效應功能障礙 效應細胞功能障礙是耗竭的免疫細胞最重要的表現。有研究發(fā)現，在細胞耗竭的不同階段，其功能障礙的表現也不盡相同。在耗竭的初期，T細胞還具備分泌IFN-γ、TNF-α等細胞因子的能力，但此時，其細胞毒作用較弱；而在耗竭的晚期，T細胞逐漸失去分泌細胞因子的能力，但細胞毒作用與前期相比有一定程度的升高[14,15]。

1.2細胞表面抑制性受體持續(xù)性高表達 盡管在T細胞活化的過程中，抑制性受體如PD-1表達有短暫的升高，但在耗竭的T細胞表面則表現為多種抑制性受體的持續(xù)性高表達以及幾種抑制性受體共表達[3]。

1.3IL-7Rα及IL-2/15Rβ信號通路受損 急性感染中，隨著抗原的清除，效應性T細胞分化為記憶性T細胞，并逐漸上調IL-7Rα和IL-2/15Rβ表達，在IL-7和IL-15等細胞因子的作用下，記憶性T細胞可以不依賴于抗原而長期在體內存活[16,17]。而在慢性感染過程中，由于耗竭的T細胞上IL-7Rα和IL-2/15Rβ信號通路受損，IL-7和IL-15的作用受到抑制，反而抗原肽是維持耗竭T細胞存活所必需的[18]。

1.4代謝改變 正常情況下，免疫細胞受到抗原刺激后，代謝方式從氧化磷酸化轉變?yōu)橛醒跆墙徒?，為細胞增殖及分泌效應分子快速提供能量，而耗竭的T細胞中有氧糖酵解和氧化磷酸化等代謝途徑障礙，代謝通路中關鍵分子PGC1α及myc等表達受到抑制[19,20]。

1.5轉錄進程不同 研究發(fā)現，與效應性及記憶性CD8+T細胞相比，耗竭的CD8+T細胞具有不同的轉錄程序，盡管和效應性及記憶性CD8+T細胞存在相同的轉錄因子，但在表達量及關鍵轉錄因子間的作用網絡上有所不同[21]。

1.6表觀遺傳修飾存在差異 表觀遺傳學研究顯示，耗竭T細胞是表觀遺傳特征不同于效應性及記憶性T細胞的獨特細胞譜系，CD8+T細胞發(fā)生耗竭的過程伴隨著基因啟動子區(qū)域和轉錄因子結合區(qū)域的廣泛重建[22]。

2 調控免疫細胞發(fā)生耗竭的機制

2.1持續(xù)抗原刺激 如前所述，記憶性T細胞在抗原清除后可以在體內長期存活，而耗竭的T細胞則需依賴于抗原肽的持續(xù)刺激才能維持存活。而且，抗原的持續(xù)刺激也是免疫細胞發(fā)生耗竭的必要條件[3]。過繼轉輸實驗證明，慢性感染早期階段的CD8+T細胞轉輸至正常小鼠后可以發(fā)生耗竭逆轉并且可以向記憶性CD8+T細胞分化，而如果長期暴露于抗原刺激則耗竭狀態(tài)不可逆轉，反之，將急性感染早期病毒特異性CD8+T細胞轉輸至慢性感染小鼠體內則不能避免其耗竭的發(fā)生[23]。

2.2抑制性受體 免疫細胞表面表達多種共刺激和共抑制性受體，與相應的配體結合之后為細胞提供刺激信號，幫助細胞活化或者提供抑制信號削弱細胞的功能。耗竭的免疫細胞持續(xù)高表達多種抑制性受體，目前已有大量研究報道了抑制性受體在慢性病毒感染和腫瘤微環(huán)境中的作用，比如PD-1、CTLA-4、Tim-3、2B4、CD160、LAG-3、BTLA及TIGIT等[24,25]。研究發(fā)現，免疫細胞耗竭程度和細胞上抑制性受體表達情況有關，與單一抑制性受體高表達相比，兩種甚至多種抑制性受體共表達更能代表免疫細胞耗竭的狀態(tài)。比如在小鼠LCMV慢性感染中，PD-1+Tim-3+雙陽性病毒特異性CD8+T細胞功能耗竭程度要遠遠高于單陽性的CD8+T細胞[26]。黑色素瘤患者體內腫瘤抗原特異性BTLA+PD-1+Tim-3+CD8+T細胞分泌細胞因子IFN-γ、TNF-α及IL-2的能力明顯低于單陽性或雙陽性的CD8+T細胞[27]。除了上述免疫檢查點抑制性受體之外，新近的研究還發(fā)現多種耗竭相關的抑制性分子，例如，在腫瘤環(huán)境中高表達的細胞表面分子活化蛋白C受體(PROCR)和平足蛋白(PDPN)[28]，這些分子可能作為新的免疫檢查點來調節(jié)免疫細胞的效應功能。

2.3抑制性細胞因子 在病毒慢性感染和腫瘤發(fā)生時，機體免疫細胞處于一種免疫抑制的微環(huán)境中，多種因素向免疫細胞傳遞抑制性信號。抑炎因子IL-10在促進T細胞耗竭及維持病毒長期存活中發(fā)揮重要的作用，尤其是單核巨噬細胞和CD4+T細胞來源的IL-10是發(fā)揮免疫抑制作用的關鍵角色[29,30]。TGF-β是另一重要的免疫負調分子，TGF-β不僅可以抑制CD8+T細胞分泌IFN-γ、TNF-α等細胞因子，還可以通過上調促凋亡蛋白Bim的表達來促進病毒特異性CD8+T細胞的凋亡[31]。

2.4抑制性細胞 在慢性病毒感染或者腫瘤存在時，機體內的一些免疫負調細胞如調節(jié)性T細胞(Treg)、骨髓來源的抑制性細胞(MDSC)及腫瘤相關巨噬細胞(TAM)比例升高，這些細胞可以通過多種途徑參與免疫抑制。Treg細胞不僅可以通過分泌TGF-β發(fā)揮免疫抑制作用，還可以通過控制效應T細胞中IL-2的轉錄來抑制效應T細胞的增殖，并且通過抑制性受體CTLA-4與效應T細胞上CD80/CD86結合而直接抑制T細胞活化，或者和抗原遞呈細胞(APC)上CD80/CD86分子結合，引起吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)的活化進而影響必需氨基酸——色氨酸的代謝，進而抑制T細胞的活化[32,33]。同樣，MDSC也是TGF-β的來源之一，并且還可以通過精氨酸損耗發(fā)揮抑制功能。精氨酸不足可導致T細胞、NK細胞增殖受阻和細胞周期阻滯，抑制NK細胞IFN-γ分泌，影響效應細胞的功能。此外，MDSC還能升高體內活性氧(ROS)及誘導型一氧化氮合酶(iNOS)的水平進而促進NO產生增多[34]。研究發(fā)現，NO可以通過Jak/Stat信號通路、誘導T細胞凋亡以及降低MHC表達水平等多種途徑來發(fā)揮免疫抑制作用[35-37]。TAM細胞主要由M2型巨噬細胞組成，與正常巨噬細胞相比抗原提呈能力較弱，并且可以分泌IL-10、TGF-β等抑制性細胞因子來削弱T細胞對腫瘤細胞的殺傷功能[38]。

2.5轉錄因子 轉錄因子在免疫細胞的分化過程中發(fā)揮重要作用，在慢性感染的小鼠和人體內存在兩種不同狀態(tài)的病毒特異性CD8+T細胞，轉錄因子T-bet和Eomes的表達高低在維持和促進這兩種細胞狀態(tài)的轉化過程中至關重要。持續(xù)的抗原刺激使得T-bethiPD-1mid細胞群逐漸喪失T-bet表達進而向EomeshiPD-1hi細胞群轉化，后者對PD-1抗體阻斷療法反應不明顯[3,39]。轉錄因子NFAT在T細胞活化過程中起著關鍵的調節(jié)作用[40]，細胞因子IL-2、IL-3、IL-4以及集落刺激因子(GM-CSF)的表達依賴于NFAT和Fos-Jun(AP-1)結合所形成的復合體[41]，而NFAT不與AP-1結合則減弱TCR信號傳導并且誘導抑制性受體升高，促進T細胞的失能以及耗竭[42]。Blimp-1被證明在小鼠慢性LCMV感染病毒特異性CD8+T細胞中表達升高，并且促進多種抑制性受體表達和共表達[43]。在人急性髓系白血病中，Blimp-1直接結合抑制性受體PD-1和TIGIT的啟動子區(qū)域，促進兩者表達，抑制T細胞的效應功能[44]。除了Blimp-1可以單獨調控多種抑制性受體表達之外，在黑色素瘤和結腸癌小鼠模型中，轉錄因子c-MAF可以與Blimp-1協同作用，在T細胞中同時缺失這兩種轉錄因子能夠明顯提高T細胞的效應功能，有效抑制腫瘤的生長[28]。有文獻報道，在黑色素瘤中，CD8+T細胞內Maf的過表達可抑制其抗腫瘤功能，使其向耗竭表型極化[45]。在腫瘤浸潤的效應T細胞中，轉錄因子Foxp1表達明顯上調，高表達的Foxp1通過與Smad家族成員相互作用來介導腫瘤微環(huán)境中TGF-β的免疫抑制作用，或者直接介導TGF-β誘導的c-Jun轉錄抑制作用，使T細胞活性受損，最終導致CD8+T細胞增殖、分泌IFN-γ和Granzyme B的能力下降[46]。LCMV慢性感染中，病毒特異性CD8+T細胞轉錄因子IRF4、BATF高表達，抑制或缺失IRF4表達后，抑制性受體PD-1、Tim-3、LAG-3、2B4、TIGIT和CTLA-4等表達均隨之降低，減少或缺失BATF后存在同樣的現象，而且，IRF4的高表達還可抑制效應性CD8+T細胞向記憶性CD8+T的分化[47]。

反過來，抑制性受體也可以上調某些轉錄因子的表達，比如，HIV特異性CD8+T細胞上PD-1的表達升高可以上調轉錄因子BATF的表達，進而損傷T細胞增殖和分泌細胞因子的能力[48]。在慢性病毒感染過程中，AKT-mTOR信號通路的活化受到抑制，導致轉錄因子FoxO1的活性升高，FoxO1可以誘導抑制性受體PD-1的表達，進而降低抗原特異性T細胞對抗原的敏感性[49]，同時FoxO1可以抑制T-bet表達，促進抗原特異性T細胞向記憶性表型分化，維持細胞存活[50]。

2.6表觀遺傳修飾 表觀遺傳修飾是指在DNA序列不改變的情況下，基因功能的可遺傳變化。修飾途徑主要包括：DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA介導的轉錄及轉錄后調控[51]。

在慢性LCMV感染中，病毒特異性CD8+T細胞中二乙?；M蛋白H3表達下調，無法產生效應分子IFN-γ和IL-2，其功能呈現耗竭狀態(tài)[52]。在初始T細胞接受抗原刺激分化為效應T細胞的過程中，Pdcd1基因啟動子區(qū)域去甲基化，隨著病毒清除，效應T細胞分化為記憶細胞，Pdcd1基因座發(fā)生再甲基化。相反，在慢性LCMV感染中Pdcd1基因則完全去甲基化，病毒特異性CD8+T細胞持續(xù)高表達PD-1[51,53]。DNA甲基轉移酶抑制劑與組蛋白去乙酰化酶抑制劑的聯合使用可逆轉非小細胞肺癌模型鼠中耗竭的T細胞向效應和記憶表型轉化，從而促進抗腫瘤免疫[54]。

非編碼RNA如microRNA和lncRNA在調控T細胞功能的過程中也扮演著重要的角色。miR-155通過抑制Ⅰ型干擾素作用促進抗病毒CD8+T細胞的增殖[55]，另一方面miR-155又可促進CD8+T細胞上多種抑制性受體表達和共表達，驅動CD8+T細胞向耗竭表型轉化[14]。miR-31通過靶向Ppp6c促進Ⅰ型干擾素信號，上調耗竭相關基因，抑制效應分子表達來促進CD8+T細胞耗竭[56,57]。在HCC患者CD8+T細胞中，Lnc-tim3表達上調，其和Tim-3特異性結合，促進Bat3核轉位，促進CD8+T細胞耗竭[58]。同樣，Lnc-EGFR在HCC患者中也存在高表達的現象，高表達的Lnc-EGFR促進Treg細胞生成并且抑制CD8+T細胞效應功能，加劇腫瘤的發(fā)生發(fā)展[59]。

2.7細胞代謝 除了抑制性受體和其配體結合、抑炎因子(IL-10、TGF-β等)、免疫抑制細胞(Tregs、MDSC、TAM等)抑制免疫細胞的效應功能之外，腫瘤微環(huán)境還能抑制免疫細胞的代謝活動。腫瘤細胞不僅可以競爭性剝奪免疫細胞代謝所需要的營養(yǎng)物質，而且其產生的有害代謝產物堆積也可以抑制免疫細胞功能[20,60]。活化的NK細胞需要劇烈的代謝活動來支持效應功能，抑制細胞代謝可削弱NK細胞產生IFN-γ以及殺傷能力[61]。在腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中，NK細胞逐漸喪失抗腫瘤功能呈現耗竭狀態(tài)，研究發(fā)現，在小鼠肺癌模型中NK細胞中FBP1的異常表達通過損傷NK細胞的糖代謝活動來抑制NK細胞的抗腫瘤功能而呈現耗竭的狀態(tài)[62]。和NK細胞一樣，T細胞的功能耗竭與細胞代謝活動同樣密不可分。慢性乙肝患者體內病毒特異性CD8+T細胞存在線粒體代謝失調的現象，具體表現為線粒體去極化以及大量ROS的產生，這就使得HBV特異性CD8+T細胞無法有效地進行氧化磷酸化來提供能量，而使用靶向線粒體的抗氧化劑可以顯著改善線粒體和耗竭的病毒特異性CD8+T細胞功能，說明線粒體代謝活動在耗竭的CD8+T細胞中的重要作用[63,64]。

2.8其他 除了上述調控因素以外，近年來的研究工作還不斷揭示出在免疫耗竭過程中發(fā)揮作用的新機制。例如，在黑色素瘤中，P-選擇素糖蛋白配體-1(PSGL-1)可以上調多種抑制性受體，如PD-1、Tim-3及LAG-3表達，從而作為免疫檢查點調控分子促進效應T細胞的功能耗竭[65,66]。SLAM家族成員CD84不僅可以上調腫瘤細胞及其微環(huán)境中基質細胞上PD-L1，還可以促進CD8+T細胞上PD-1及其他抑制性受體表達，極大程度上削弱了CD8+T細胞的效應功能[67]。

3 結語與展望

在慢性感染或腫瘤存在的情況下，抗原特異性T細胞發(fā)生耗竭的調控機制是多樣且復雜的。多種轉錄因子可以調控抑制性受體表達和共表達，而且轉錄因子之間可以相互調控，比如，IRF4啟動子區(qū)域存在NFAT家族的結合位點，NFAT缺失之后，IRF4的表達受到抑制。除此之外，耗竭的T細胞中IRF4抑制了合成代謝和線粒體功能，影響了能量代謝為免疫細胞發(fā)揮效應功能提供所需的能量供應[47]。免疫耗竭機制的揭示可為慢性感染和腫瘤治療提供眾多潛在的研究靶點和策略。目前免疫檢查點阻斷治療已在病毒感染和腫瘤治療中取得了有目共睹的效果。阻斷PD-1信號通路可以有效恢復LCMV慢性感染模型中耗竭的T細胞功能，降低病毒載量，因此，以抑制性受體為靶點成為恢復耗竭T細胞效應功能的有效策略[68]。的確，臨床前研究表明，免疫檢查點阻斷可以明顯增強免疫細胞的功能，有效控制腫瘤生長、降低病毒載量。PD-1單抗Pembrolizumab和Nivolumab通過FDA批準，標志著免疫檢查點阻斷在腫瘤臨床治療上的重大進展[69]。在慢性感染和腫瘤模型中，干擾調控抑制性受體的關鍵轉錄因子(例如Blimp-1及IRF4等)表達同樣觀察到了明顯的效果[44,47]。隨著細胞代謝在免疫耗竭領域成為研究熱點，靶向耗竭免疫細胞代謝異常成為一種潛在的治療靶點。PGC-1α為轉錄共激活因子，在線粒體生物合成、葡萄糖代謝等方面具有重要作用，在LCMV慢性感染中，過表達PGC-1α可以增強耗竭T細胞的功能，增強免疫檢查點阻斷的治療效果[19]。在HBV慢性感染中利用靶向線粒體抗氧化劑，調控ROS生成，可以顯著改善線粒體和CD8+T細胞抗病毒的功能[64]。這些研究逐漸確定了在腫瘤及病毒慢性感染中免疫細胞耗竭的特征及發(fā)生發(fā)展的機制，并在一些模型中取得了比較顯著的效果，為臨床治療提供了更多、更新穎的靶點，給腫瘤和慢性感染患者痊愈帶來了新的希望。