王 艷 劉純宏 譚 曇 雷 茗 黃艷云 藍(lán) 艷 韋葉生

(右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，百色 533000)

長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA，lncRNA)是長度超過200個(gè)核苷酸，無編碼蛋白能力的RNA分子，但參與細(xì)胞增殖，分化、代謝、凋亡和免疫。轉(zhuǎn)移相關(guān)的肺腺癌轉(zhuǎn)錄物1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript-1,MALAT1)是位于染色體11q13.1，長度約為8 kb的lncRNA。研究證實(shí)MALAT1廣泛參與基因剪切和表達(dá)調(diào)控，與突觸形成、血管生長等各類生理功能緊密相關(guān)[1]。最新研究發(fā)現(xiàn)，MALAT1參與免疫反應(yīng)的多種生物學(xué)過程。例如，MALAT1海綿miR-195誘導(dǎo)細(xì)胞程序死亡-配體1的表達(dá)從而抵抗CD8 T細(xì)胞毒性作用[2]。此外，作為 miR-155的競爭性內(nèi)源性RNA調(diào)節(jié)炎癥因子分泌，可促進(jìn)樹突狀細(xì)胞向耐受表型的轉(zhuǎn)變，并與免疫耐受密切關(guān)聯(lián)[3]。據(jù)報(bào)道MALAT1的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)與疾病風(fēng)險(xiǎn)有相關(guān)性，且相關(guān)性受到人口環(huán)境因素影響[4,5]。截至目前，MALAT1基因rs3200401、rs664589多態(tài)性在廣西人群與其它地區(qū)人群的比較尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過SNPscan 高通量分型技術(shù)檢測兩位點(diǎn)多態(tài)性，并與HapMap數(shù)據(jù)庫比較，有助于認(rèn)識不同地區(qū)人群MALAT1基因多態(tài)性的分布差異，為后續(xù)MALAT1相關(guān)疾病提供遺傳學(xué)參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1一般資料 2018年6月至11月，從本院體檢中心隨機(jī)納入男104例、女91例，共195例體檢人員，年齡20～79歲，平均年齡(41.79±12.13)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：樣本居住地與籍貫均為廣西，彼此間無親緣關(guān)系；各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)合格。排除標(biāo)準(zhǔn)：心、肝、腎、腫瘤以及遺傳免疫等疾病被排除。研究方案獲得本院倫理委員會(huì)審批備案，研究對象均同意采集血液樣本參與實(shí)驗(yàn)。

1.1.2主要儀器與試劑 JYO2S型紫外分析儀(北京君意東方公司)； S100型Thermal Cycler擴(kuò)增儀(美國Bio-Rad公司)；ABI3500型Genetic Analyzer分析儀(美國ABI公司)；人類基因組DNA提取試劑盒(中國北京天根生化科技有限公司)；人86SNP位點(diǎn)SNPscan 檢測試劑盒(中國上海天昊生物科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1樣本DNA制備 實(shí)驗(yàn)對象需要空腹8 h以上，于次日早上8點(diǎn)采集靜脈血3 ml于EDTA-K2抗凝管。按照北京天根公司離心柱法說明書規(guī)范提取DNA，并分裝儲存，放置-20℃?zhèn)溆谩＿x取DNA樣本OD260/280值1.7～2.0、濃度20～50 ng/μl的合格樣本用于后續(xù)基因分型實(shí)驗(yàn)。

1.2.2引物設(shè)計(jì)與合成 在NCBI 選取包含人rs32-00401、rs664589適宜長度的DNA序列，輸入 Primer Premier 3.0 在線軟件設(shè)計(jì)引物，并交給上海天昊公司合成引物序列。目標(biāo)位點(diǎn)rs3200401C/T的等位基因鑒別引物長度27 bp,序列為5′-GCATTTACTTGCCAACAGAACAGAGAG-3′，5′-GCATTTACTTGCCAACAGAACAGAGAA-3′，通用引物長度25 bp，序列為5′-ACCTGAAGTCAAGACAACTGCATTC-3′。rs664589位點(diǎn)等位基因引物鑒別長度為22 bp，序列為5′-TGGCAATTAGTTGGCAGTGTCC-3′，5′-TGGCAATTAGTTGGCAGTGTCG-3′，通用引物長度21 bp，序列為5′-TGTTACGGTTGGGATTGGTGG-3′。

1.2.3SNPscan分型檢測 嚴(yán)格按照人86 SNP位點(diǎn)SNPscan檢測定制試劑盒的使用說明書操作，目標(biāo)位點(diǎn)基因型由Gene Mapper軟件質(zhì)量控制并讀取。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 Hardy-Weinberg分析樣本群體的遺傳代表性(P>0.05提示群體遺傳平衡)。直接計(jì)數(shù)法表達(dá)統(tǒng)計(jì)兩位點(diǎn)的基因型與等位基因頻率，利用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析，其中(組間基因型和等位基因)采用χ2檢驗(yàn)和Fisher精確概率法，P<0.05提示兩地人群的遺傳變異差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1MALAT1基因rs3200401、rs664589位點(diǎn)多態(tài)性 測序表明，rs3200401位點(diǎn)存在CC(74.9%)、CT(23.6%)和TT(1.5%)3種基因型，等位基因C、T頻率為86.7%、13.3%。rs664589位點(diǎn)基因分型為CC (62.6%)、CG(35.4%)以及GG(2.0%)，等位基因C、G頻率為80.3%、19.7%?；驕y序圖如圖1、2。

圖1 MALAT1基因rs3200401C/T測序圖Fig.1 Sequencing map of genotype for MALAT1 gene rs3200401C/TNote:A.CC genotype;B.CT genotype;C.TT genotype.

圖2 MALAT1基因rs664589C/G測序圖Fig.2 Sequencing map of genotype for MALAT1 gene rs664589C/GNote:A.CC genotype;B.CT genotype;C.TT genotype.

2.2廣西人群MALAT1基因rs3200401、rs664589位點(diǎn)多態(tài)性分布 樣本人群目標(biāo)位點(diǎn)基因型數(shù)據(jù)滿足哈迪-溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium,HWE)，P為0.772、0.104均大于0.05，表明所選樣本遺傳平衡，見表2。rs3200401C/T和rs664589C/G的基因型在男女樣本的分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

表1 廣西人群MALAT1基因rs3200401、rs664589位點(diǎn)的多態(tài)性分布[例(%)]Tab.1 Polymorphism distribution of rs3200401 and rs664589 of MALAT1 gene in Guangxi population[n(%)]

2.3廣西人群MALAT1基因rs3200401、rs664589位點(diǎn)多態(tài)性與其他區(qū)域人群的比較 廣西健康人群MALAT1 rs3200401位點(diǎn)基因型、等位基因分布頻率同HapMap-JPT、HapMap-CEU人群的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；rs664589位點(diǎn)基因型與等位基因分布同HapMap-CHB、HapMap-JPT、HapMap-CEU和HapMap-YRI的分布差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2、3。

表2 不同區(qū)域人群MALAT1基因rs3200401、rs664589位點(diǎn)基因型分布比較[例(%)]Tab.2 Comparison of genotype distribution of rs3200401 and rs664589 of MALAT1 gene in different populations[n(%)]

表3 不同區(qū)域人群MALAT1基因rs3200401、rs664589位點(diǎn)等位基因頻率的比較[例(%)]Tab.3 Comparison of allele frequencies of rs3200401 and rs664589 of MALAT1 gene in different populations[n(%)]

3 討論

MALAT1又被稱為復(fù)核集常染色體轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2(nuclear-enriched abundant transcript 2，NEAT2)，包括定位于核內(nèi)的RNA和胞質(zhì)的tRNA樣小RNA即mascRNA，成熟的MALAT1轉(zhuǎn)錄本定位在細(xì)胞核的核斑區(qū)。盡管其5′ 端無帽子結(jié)構(gòu)， 3′ 端 無 ploy(A)尾，但在哺乳動(dòng)物中保守穩(wěn)定，研究表明這與3′端的三螺旋結(jié)構(gòu)緊密相關(guān)[6]。最初，MALAT1作為肺癌標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)，后續(xù)研究表明在其他癌癥中也扮演重要角色，影響腫瘤細(xì)胞的增殖、分化和轉(zhuǎn)移[7,8]。而新的證據(jù)表明MALAT1的表達(dá)失調(diào)影響宿主免疫穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而影響免疫相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展。Zhao等[9]證實(shí)脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中MALAT1表達(dá)上調(diào)，并與NF-κB相互作用，抑制TNFα和IL-6的表達(dá)，參與微調(diào)天然免疫反應(yīng)。而NF-κB信號級聯(lián)反應(yīng)涉及多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)以及實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎的發(fā)展[10]。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的單核細(xì)胞中，顯著升高的MALAT1促進(jìn)IL-21表達(dá)，并調(diào)控SIRT1途徑參與狼瘡發(fā)生與維持[11]。此外，MALAT1通過促進(jìn)CTNNB1啟動(dòng)子甲基化抑制Wnt信號傳導(dǎo)，繼而抑制成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞的增殖和炎癥，參與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疾病[12]。提示MALAT1有潛力成為免疫相關(guān)疾病的調(diào)節(jié)因子。SNPs即單個(gè)核苷酸發(fā)生轉(zhuǎn)換或顛換，已成為探究疾病機(jī)制的重要途徑。在遺傳學(xué)中近距離的基因易形成連鎖，標(biāo)簽SNP(Tag SNP)即代表著同一片段內(nèi)所有SNP的類型，rs3200401、rs664589作為MALAT1基因的關(guān)鍵Tag SNP，有重要研究價(jià)值。目前，MALAT1在免疫反應(yīng)中的重要功能逐漸顯現(xiàn)，但其多態(tài)性與免疫疾病的關(guān)聯(lián)研究仍然甚少。埃及學(xué)者探索了rs3200401變異與MS的風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系，但在遺傳模型中均未發(fā)現(xiàn)兩者的相關(guān)性。值得注意的是，部分涉及MALAT1多態(tài)性與癌癥的研究表明rs3200401、rs664589是重要功能性位點(diǎn)[13]。如rs664589突變子G可改變MALAT1與miR-194-5p的結(jié)合，促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生[14]。但rs3200401 C>T突變與肝癌風(fēng)險(xiǎn)的研究存在不一致的結(jié)論。針對臺灣人群的研究顯示攜帶 rs3200401突變型CT、TT 的吸煙者感染乙型肝炎病毒(HBV)的頻率較高，而rs3200401C>T 變異、環(huán)境因素以及HCC風(fēng)險(xiǎn)的交互分析在廣東人群中沒有發(fā)現(xiàn)相關(guān)性[15，16]。上述樣本來自不同地方，可能存在遺傳背景差異，使得該位點(diǎn)與同種疾病風(fēng)險(xiǎn)不同。因此有必要研究MALAT1基因rs3200401、rs664589多態(tài)性在廣西人群的分布征，為進(jìn)一步探究本地相關(guān)疾病奠定基礎(chǔ)。

本研究顯示，MALAT1基因rs3200401、rs664589位點(diǎn)SNPs在廣西人群性別間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。進(jìn)一步將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與HapMap 數(shù)據(jù)庫對比得出：rs3200401位點(diǎn)的C>T突變頻率與北京和非洲人群的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，突變頻率明顯低于日本和歐洲，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這可能與遺傳背景相關(guān)，廣西與北京、日本雖同屬亞洲人群，但在飲食結(jié)構(gòu)，生活習(xí)性以及海拔高度等方面與日本的差異更為明顯，可能是造成與日本rs3200401位點(diǎn)多態(tài)性差異顯著的原因之一。廣西同歐洲、非洲地理位置相隔較遠(yuǎn)，遺傳背景差異大易影響多態(tài)性分布。而非洲的經(jīng)濟(jì)相對落后，人口內(nèi)流少，可能阻隔基因交流，使其與廣西在rs3200401的C>T突變頻率均相對較低，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。rs664589位點(diǎn)C>G突變普遍，且在廣西地區(qū)檢測出少量突變純合子GG基因型，HapMap公布的北京、日本、歐洲以及非洲地區(qū)未見純合子突變型GG，廣西與上述地區(qū)的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這可能是由于基因突變存在累積效應(yīng)，除上述地理位置以及飲食結(jié)構(gòu)等遺傳背景外，廣西是多民族聚居之地，各民族間通婚普遍，這種區(qū)域特性可能使rs664589位點(diǎn)C到G的突變明顯高于其他地區(qū)，加速了GG純合子突變型的出現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了遺傳背景不同，基因突變的累積效應(yīng)也存在差異，提示研究者遺傳相關(guān)疾病的研究宜選取本土人群[17,18]。

綜上，本次針對廣西本土健康人群的研究發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)MALAT1 rs3200401、rs664589位點(diǎn)突變程度不同。這為解釋同種疾病的發(fā)病率、臨床表現(xiàn)不同提供了數(shù)據(jù)支持，也為進(jìn)一步探究MALAT1基因SNPs 在免疫疾病中的作用奠定基礎(chǔ)。然而本研究屬于小樣本研究，可能存在選擇偏倚。今后應(yīng)增加樣本量，進(jìn)行年齡、民族等環(huán)境人口因素的多中心、前瞻性的研究，進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果。