徐煥文（河北三農農用化工有限公司. 河北省生物農藥工程技術研究中心，河北 石家莊051430）

隨著生物技術的發(fā)展，生物發(fā)酵的應用范圍越來越廣，從早期的發(fā)酵生產酒精到近百年前生產丙丁溶劑，再到現(xiàn)代的青霉素、潔霉素以及阿維菌素等等。產品不僅有基礎化工產品，還有人藥、獸藥和農藥等。在發(fā)酵生產的過程中程度不同的都存在染菌現(xiàn)象，同樣也存在怎么發(fā)現(xiàn)染菌的前兆，怎么把染菌后的損失降到最低等問題，本文結合某公司丙丁溶劑的生產進行說明。

1 染菌的原因以及對無菌概念的新認識

1.1 染菌的原因介紹

染菌的原因有培養(yǎng)基的消毒、無菌空氣的質量、種子罐和發(fā)酵罐的閥門汽封情況、物料系統(tǒng)泄漏、冷卻系統(tǒng)泄漏、操作失誤等很多因素；染菌的種類也由于不同的裝置、不同的地區(qū)和不同的環(huán)境，有桿菌、球菌和其他雜菌[1］。往往一套裝置總是習慣性的染某一種菌，這和人員操作、設備情況、使用原料、環(huán)境情況等都有直接關系。

1.2 對無菌概念的新認識

筆者認為對無菌的概念應該有一個新的認識，無菌是相對的，絕對的無菌是做不到的。主菌種生長旺盛時，雜菌處于劣勢位置顯現(xiàn)不出來；一旦主菌種有問題，雜菌很快就會成長起來占據(jù)優(yōu)勢地位。一個發(fā)酵周期就是主菌種與雜菌的博弈過程；生產過程的控制就是提供有利于主菌種生長的各種條件，采取抑制雜菌生長的各種措施。

2 裝置的正常運行指標

某套連續(xù)發(fā)酵的丙丁溶劑生產裝置，6個種子罐、2個育種罐、2 個一級罐、4 個后發(fā)酵罐。培養(yǎng)基的糖濃度在4.8%～5.5%，正常情況下培養(yǎng)基的打料速度控制在90～100m3/h。育種罐發(fā)酵醪液菌種活力（次甲基藍退色時間，下同）2min～20s，前發(fā)酵期的酸度4.5～6.5，罐糖小于2%；一級罐發(fā)酵醪液菌種活力20s～2min，主發(fā)酵期的酸度6.5～4.5，罐糖小于1.5%；末級發(fā)酵罐的酸度正常情況較低在3.0～1.5［2］，殘?zhí)切∮?.4%，菌種已經沒有活力或活力非常小。生產正常運行時，一個檢測周期為2 h。

3 染菌的前兆及處理方法

大生產中用顯微鏡做鏡檢是判斷發(fā)酵染菌與否的重要手段。可是這種判斷往往滯后，只有雜菌數(shù)量達到一定程度時鏡檢才能做比較明確的判斷。筆者總結了大裝置發(fā)酵生產的運行數(shù)據(jù)，認為通過觀察各級罐的降糖情況、酸度升降情況、種子活力的變化情況等生產運行指標能發(fā)現(xiàn)染菌的前兆，再結合鏡檢能對發(fā)現(xiàn)異?，F(xiàn)象做出及時的判斷，以便采取正確的處理方法。

3.1 根據(jù)各級罐的降糖情況判斷染菌的前兆及其處理方法

（1）由各級罐的降糖情況觀察，正常情況下糖度應該是育種罐小于2%，一級罐小于1.5%，末級罐小于0.4%，呈階梯形狀下降。如果一級罐的罐糖連續(xù)幾個檢測周期都超過1.5%，導致末級罐大于0.5%甚至更高，說明菌種的耗糖能力已經下降也就是活力已經下降，這時從鏡檢和種子活力的檢測上觀察的表現(xiàn)也并不一定明顯。首先采取的措施是減少蒸煮醪1/3 的進醪量，12 h 之后觀察育種罐和一級罐的罐糖是否恢復正常？24 h之后觀察前2個發(fā)酵罐的罐糖是否正常？36 h之后再觀察從育種罐到發(fā)酵罐的各級罐糖是否恢復到呈階梯形狀下降？如果恢復到了正常指標，運行一定時間后就逐漸提高進醪量，恢復正常生產。

（2）采取措施12 h 后所觀察的效果扔不明顯，就有可能是菌種活力已減弱，雜菌抑制了丙丁菌的生長，這就是染菌的前兆。應結合顯微鏡的觀察和種子活力的檢測來進行判斷，最后確定染菌情況。這時不應該再報僥幸心理，確定后應立即采取3.4的措施。

3.2 根據(jù)各級罐的酸度變化來判斷染菌的前兆及其處理方法

育種罐是前發(fā)酵期，是升酸期，升到6.5是正常的。一級罐及之后是主發(fā)酵期和后發(fā)酵期，是降酸期；一級罐到末級罐的酸度應該從6.5降到3左右，甚至達到1.5以下也是正常的。

（1）如果育種罐和一級罐的酸度達到了7以上，并且后面的罐降酸現(xiàn)象不明顯，說明育種罐或種子罐已經染菌，應馬上停止進培養(yǎng)基采取3.4的措施。

（2）如果育種罐和一級罐的酸度正常，末級或其前一個罐的酸度超過5，說明后面幾個發(fā)酵罐已經染菌的可能性非常大，這時應采取一級罐后“隔斷”措施來進行補救。所謂“隔斷”措施就是：將一級罐后的第一個和第二個罐進行清空、消毒之后再進料的處理方法，如果此方法沒有效果說明雜菌是從前面帶來的，仍要采取3.4的措施。

3.3 根據(jù)各級罐菌種活力的變化來判斷染菌的前兆及其處理方法

首先，觀察育種罐的菌種活力情況。育種罐從補充培養(yǎng)基開始到移到移種一級罐，這1 個周期一般不超過3 個次檢測周期。這3個檢測周期的活力應該是從弱到強，次甲基藍退色時間從幾十分鐘或幾分鐘，再到幾十秒甚至幾秒。如果育種罐的一個培養(yǎng)周期內的幾次檢測活力都在幾分鐘以上說明菌種活力變差，應該采用多留種少補培養(yǎng)基的辦法來調整菌種活力；如果采取措施后仍沒有效果，連續(xù)一到兩天菌種活力都是幾分鐘以上，應該是育種罐染菌的前兆。雜菌來自本育種罐或者是種子罐，確認后應該采取3.4的處理措施。

其次，觀察一級罐的菌種活力情況。一級罐里發(fā)酵的這段時間是整個發(fā)酵過程中的主發(fā)酵期，也是菌種生長最旺盛、活力最強的時期。菌種活力正常都是幾十秒，最長也不超過2min，如果連續(xù)幾個檢測周期菌種活力都大于2min，應該是一級罐染菌的前兆。雜菌來自本一級罐或者是育種罐，確認后應該采取3.4的處理措施。

第三，觀察后發(fā)酵期發(fā)酵罐的菌種活力情況。五號罐后一直到末級罐菌種的活力逐漸減弱，從幾十秒到幾分鐘，末級罐基本上檢測不到活力。這段時間由于菌種活力逐漸減弱，也是極易染菌的時段。如果五號罐連續(xù)幾個檢測周期的活力都變長，超過了2min甚至更長，后面幾個罐的酸度或罐糖也升了起來，就是后發(fā)酵期染菌的前兆。采取3.2.(2)的處理方法，沒有效果后應果斷采取3.4的處理措施。

3.4 確定染菌后的處理方法

如果確定是一級罐之前的發(fā)酵罐或種子罐發(fā)生了染菌現(xiàn)象，或者是五號罐之后出現(xiàn)染菌前兆采取3.2.(2)的方法處理后沒有作用，就應該將本條線徹底清空，進行消毒處理。①停止進培養(yǎng)基，從蒸煮系統(tǒng)開始整個物料系統(tǒng)按照走料順序依次消毒。②用無菌空氣從種子罐開始往后壓料，根據(jù)后發(fā)酵罐的酸度、糖度以及溶劑含量的變化情況來決定壓料速度，原則上是盡快把染菌發(fā)酵液處理完。爭取在酸度基本沒有升高、溶劑含量沒有下降的情況下將發(fā)酵液依次壓入成熟醪罐盡快蒸餾，試想一條發(fā)酵線有2500m3發(fā)酵醪液，溶劑含量從初始的1.8 g/100 mL降到壓完料時的1.6g/100 mL，只是損失了約2.5t的溶劑；如果沒有采取措施，壓完料時降到了0.5 g/100 mL，實際上損失了約16.25t 的溶劑。③從種子罐到所有的發(fā)酵罐依次全部進行消毒處理，包括罐體內部、物料管線、移種管線、汽封閥門等。④空氣系統(tǒng)進行消毒，包括過濾器、濾芯、空氣管線等。

4 結語

大裝置的發(fā)酵生產中，“染菌”是一個繞不開的話題，也是一個很難杜絕的現(xiàn)象。我們除了加強檢查、加強操作、定期的對設備和環(huán)境來進行消毒等管理措施以盡量減少染菌次數(shù)外；再就是通過上述方法發(fā)現(xiàn)染菌的前兆，采取合適的處理方法將染菌后的損失降到最低。

文章是根據(jù)使用上海生命科學院代號為2018菌種，丙丁溶劑連續(xù)發(fā)酵來做的總結，間歇發(fā)酵及其他產品的發(fā)酵生產也自然有其本身的規(guī)律。