王 勇 鮮靖蘋 王海龍 全永彪 劉 璐 馬暉玲

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心,甘肅蘭州 730070)

一氧化氮(NO)是存在于植物體內(nèi)可以調(diào)控植物基因表達(dá)的信號(hào)分子[1-2],其可以在植物細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移。植物體內(nèi)NO的產(chǎn)生有多條途徑,包括一氧化氮合成酶途徑、硝酸還原酶和亞硝酸還原酶途徑,以及光照下和類胡蘿卜素催化亞硝酸根離子等途徑[3-4]。重金屬元素鎘(Cd)容易被植物吸收和轉(zhuǎn)運(yùn),并在植物體積累[5-6]。田丹等[7]研究發(fā)現(xiàn)鎘離子影響生菜(Lactuca sativaL.)種子萌發(fā),抑制其胚根和胚芽生長,進(jìn)而影響幼苗根和葉的生長；何蕓雨等[8]和段瑞軍等[9]研究表明,鎘脅迫會(huì)降低植物葉綠素含量,影響光合作用；李慧芳等[10]研究發(fā)現(xiàn)鎘脅迫使植物體內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧自由基從而損傷植物組織。相對(duì)含水量和干物質(zhì)量可直觀反映植物在生長環(huán)境中的狀態(tài)。研究表明,鎘脅迫會(huì)抑制植物生長,降低干物質(zhì)量和相對(duì)含水量[11-12],減少丙二醛(malondialdehyde,MDA)和脯氨酸(proline,Pro)在植物體內(nèi)的累積[13-14]。大量研究發(fā)現(xiàn),在重金屬脅迫下,適宜濃度的外源NO可以通過提高抗氧化酶系統(tǒng)的活性來緩解脅迫[15],并通過促進(jìn)纖維素的合成來增加植物對(duì)重金屬的吸收和累積[16-17],增加葉綠素含量或者修復(fù)損傷的葉綠體從而增強(qiáng)植物光合作用。葉綠素中光合色素的含量直接決定其光合效率,葉綠素a/b能夠反映植物類囊體的垛疊程度,垛疊程度越高越難發(fā)生光抑制,植物抵御逆境的能力也就越強(qiáng)[18-20]。王芳等[21]和吳旭紅等[22]發(fā)現(xiàn)外源較低濃度NO可以增加植物干物質(zhì)量和相對(duì)含水量,促進(jìn)植物生長。

近年來,大量使用農(nóng)藥和工業(yè)發(fā)展對(duì)土壤造成了嚴(yán)重的鎘污染[23]。草地早熟禾是被廣泛應(yīng)用于草坪的多年生禾本科草本植物,具有根系發(fā)達(dá),耐踩踏等特性[24],是優(yōu)良的草坪草。研究表明,草地早熟禾既可作為觀賞植物[24],也可用于鎘污染土壤的修復(fù)[25]。然而,關(guān)于外源NO對(duì)鎘脅迫下草地早熟禾生理影響的研究尚鮮見報(bào)道。本研究外源NO處理鎘脅迫的草地早熟禾,通過測(cè)定種子萌發(fā)及葉片生理變化等指標(biāo),研究可緩解草地早熟禾鎘脅迫的最適硝普鈉(sodium nitroprusside dihydrate,SNP)濃度,以期為重金屬污染土壤的植物修復(fù)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試草地早熟禾品種為藍(lán)月,由北京克勞沃草業(yè)技術(shù)開發(fā)公司提供。CdCl2·2.5H2O購自。以硝普鈉(SNP)作為NO供體,化學(xué)式為Na2[Fe(CN)5NO]·2H2O。SNP在水中溶解產(chǎn)生NO和NO2-/NO3-以及Fe(CN)52-,除NO外,其他離子對(duì)植物生長均無顯著影響[20]。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 種子萌發(fā)試驗(yàn) 選取顆粒飽滿且大小一致的健康草地早熟禾種子若干,常溫下用蒸餾水浸泡6～8 h使種子吸水,幫助破除種子休眠。70%乙醇浸泡1 min,20%次氯酸鈉浸泡15 min,最后用滅菌水沖洗5～6次,晾干種子表面水分后,采用紙上發(fā)芽法[26],將用不同濃度的處理液潤濕濾紙。試驗(yàn)分成對(duì)照組(control,CK)和處理組,其中處理組包括6個(gè)小組,各小組處理液分別為 200 μmol·L-1CdCl2·2.5H2O 和不同濃度(0、50、100、200、400、600 μmol·L-1)SNP 的混合液；CK處理液為蒸餾水。將上述用不同處理液浸潤的濾紙平鋪分別在90 mm的玻璃培養(yǎng)皿中,在每個(gè)玻璃培養(yǎng)皿中播種50粒種子,每個(gè)處理4次重復(fù)。每個(gè)培養(yǎng)皿稱重記錄后置于25℃培養(yǎng)箱中,在光照2 000 Lux、光照/黑暗16 h/8 h、相對(duì)濕度65%條件下進(jìn)行培養(yǎng)。此后每天稱重并補(bǔ)齊蒸發(fā)的溶液。培養(yǎng)15 d后測(cè)定草地早熟禾胚芽長、胚根長等指標(biāo)。

1.2.2 幼苗培養(yǎng)試驗(yàn) 選取顆粒飽滿,大小一致的草地早熟禾種子若干,進(jìn)行種子消毒,常溫下用蒸餾水浸泡6～8 h使種子吸水,幫助破除種子休眠。70%乙醇浸泡1 min,20%次氯酸鈉浸泡15 min,最后用滅菌水沖洗5～6次,晾干種子表面水分后進(jìn)行播種。將種子均勻撒播在填裝蛭石的育苗缽(直徑8 cm,高10 cm)中,每天用蒸餾水噴灑澆灌,以保持水分充足,室溫培養(yǎng),發(fā)芽后間苗至每缽20株,且幼苗大致分布均勻,不集中。用1/2 Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)至幼苗3～4片葉時(shí),將CdCl2·2.5H2O加入營養(yǎng)液中,配制成鎘離子濃度為200 μmol·L-1營養(yǎng)液培養(yǎng)幼苗,對(duì)照組(control,CK)全過程用1/2 Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)。同時(shí)配制0、50、100、200、400、600 μmol·L-1SNP 溶液,采用葉面噴施的方法將不同濃度SNP均勻噴灑在早熟禾幼苗葉片上,CK葉片表面噴灑蒸餾水。處理15 d后進(jìn)行采樣,采樣時(shí)剪掉葉尖和莖,采用去除葉尖和莖稈的葉片作為試驗(yàn)材料。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 種子萌發(fā)指標(biāo)的測(cè)定

式中,Gt:第t天的發(fā)芽種子數(shù)；Dt:對(duì)應(yīng)的種子發(fā)芽天數(shù)。

1.3.2 幼苗生理指標(biāo)的測(cè)定 葉綠素含量的測(cè)定:采用95%乙醇在避光條件下浸泡草地早熟禾幼苗葉片48 h,然后分別在470、649和665 nm波長下測(cè)定吸光度值。

干物質(zhì)量的測(cè)定:采用烘干法,將10株新鮮草地早熟禾葉片55℃烘4 h,再于105℃烘至恒重,稱重。按照公式計(jì)算干物質(zhì)量:

相對(duì)含水量的測(cè)定:100℃殺青15 min后,70℃烘至恒重；SOD活性采用NBT光還原法測(cè)定[27]；POD活性采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定[27]；CAT活性采用過氧化氫還原法測(cè)定[28]；MDA含量采用TBA顯色法測(cè)定[27]；抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)活性參照陳建勛[29]的方法測(cè)定；游離脯氨酸含量采用酸性茚三酮顯色法測(cè)定[27]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Office Excel 2016整理數(shù)據(jù)和作圖；SPSS 19.0分析數(shù)據(jù),Duncan法進(jìn)行多重比較。本研究數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源NO對(duì)鎘脅迫下草地早熟禾種子萌發(fā)特性的影響

2.1.1 外源NO對(duì)鎘脅迫下草地早熟禾種子發(fā)芽率、胚根胚芽長度的影響 由表1可知,50和100 μmol·L-1SNP處理下,草地早熟禾種子發(fā)芽率較CK分別顯著提高 36.60%和 50.89%,而 0、200 μmol·L-1SNP 處理時(shí)其發(fā)芽率較CK降低了9.82%,但這兩處理間無顯著差異(P＞0.05)；SNP 濃度為 400 和 600 μmol·L-1時(shí),發(fā)芽率分別較CK顯著降低了83.92%和95.53%。與CK相比,不同SNP處理對(duì)草地早熟禾種子胚芽長度具有顯著抑制作用。50和100 μmol·L-1SNP處理的胚芽長度較 0 μmol·L-1SNP分別顯著增加了40.70%和64.60%(P＜0.05)。CK的胚根長顯著高于其他處理(P＜0.05),但 50 和 100 μmol·L-1SNP 處理能夠明顯促進(jìn)鎘脅迫下種子胚根的生長,分別較0 μmol·L-1SNP處理增加了4.58倍和6.76倍。

表1 外源NO對(duì)鎘脅迫下草地早熟禾種子萌發(fā)及胚根和胚芽長度的影響Table 1 Effects of exogenous NO on seed germination,radicle length and germ length ofPoa pratensis under Cd stress

2.1.2 外源NO對(duì)鎘脅迫下草地早熟禾種子發(fā)芽勢(shì)、活力指數(shù)、發(fā)芽指數(shù)的影響 由表2可知,50和100 μmol·L-1SNP處理顯著提高了早地早熟禾種子發(fā)芽勢(shì),分別較CK顯著增加68.52%和79.63%,而其他處理顯著降低了種子發(fā)芽勢(shì)。50和100 μmol·L-1SNP處理的活力指數(shù)分別較CK增加3.98%和25.43%(P＞0.05),較 0 μmol·L-1SNP 處理分別顯著增加了 1.25倍和 1.71 倍(P＜0.05)；200 μmol·L-1SNP 處理的種子活力指數(shù)較0 μmol·L-1SNP處理增長34.39%,但差異不顯著(P＞0.05)。 400 和600 μmol·L-1SNP 處理的草地早熟禾種子萌發(fā)受到抑制。50和100 μmol·L-1SNP處理對(duì)發(fā)芽指數(shù)緩解效果最明顯,分別較CK顯著增加 52.93%和 59.35%(P＜0.05),CK、0和 200 μmol·L-1SNP處理間發(fā)芽指數(shù)、差異不顯著(P＞0.05),400和600 μmol·L-1SNP 處理顯著降低了草地早熟禾種子發(fā)芽指數(shù),抑制了種子萌發(fā)。

表2 外源NO對(duì)鎘脅迫下草地早熟禾種子發(fā)芽勢(shì)及活力指數(shù)和發(fā)芽指數(shù)的影響Table 2 Effects of exogenous NO on germination potential,vigour index and germination index of Poa pratensis seedlings under Cd stress

2.2 外源NO對(duì)鎘脅迫下草地早熟禾幼苗葉片生長的影響

由圖1可知,除CK的草地早熟禾幼苗干物質(zhì)量和相對(duì)含水量顯著高于其他處理外,隨著SNP濃度的增大,草地早熟禾幼苗干物質(zhì)量和相對(duì)含水量均呈先增加后減少的趨勢(shì)。50和100 μmol·L-1SNP處理的干物質(zhì)量較0 μmol·L-1處理分別顯著增加20.11%和37.90%(P＜0.05)；50 和 100 μmol·L-1SNP 處理的相對(duì)含水量較0 μmol·L-1處理分別顯著增加18.17%和31.70%(P＜0.05)。 而200、400 和 600 μmol·L-1SNP 處理顯著抑制了干物質(zhì)的積累和相對(duì)含水量(P＜0.05)。

圖1 外源NO對(duì)鎘脅迫下草地早熟禾葉片干物質(zhì)量和相對(duì)含水量的影響Fig.1 Effect of exogenous NO on dry matter content and relative water content of Poa pratensis leaves under Cd stress

2.3 外源NO對(duì)鎘脅迫下草地早熟禾幼苗葉片光合色素含量的影響

由表 3 可知,200 μmol·L-1鎘脅迫下施加 50、100 μmol·L-1SNP能夠顯著提高草地早熟禾幼苗葉片的葉綠素a、b和類胡蘿卜素含量,其中葉綠素a含量較0 μmol·L-1SNP處理分別顯著增加22.51%和50.21%(P＜0.05),葉綠素 b含量分別顯著增加5.30%和23.11%(P＜0.05),類胡蘿卜素含量分別顯著增加28.92%和 58.86%(P＜0.05)。200、400和 600 μmol·L-1SNP處理對(duì)草地早熟禾幼苗葉片各色素含量影響顯著,能夠抑制植物光合作用。50和 100 μmol·L-1SNP處理葉綠素a/b值與CK間均無顯著差異(P＞0.05),而較0 μmol·L-1SNP 處理分別顯著增加16.30%和 21.85%(P＜0.05)；200 μmol·L-1SNP 處理葉綠素a/b值較0 μmol·L-1SNP略有降低,但差異不顯著(P＞0.05)；400 和 600 μmol·L-1處理葉綠素 a/b值則顯著低于其他SNP處理。

表3 外源NO對(duì)鎘脅迫下草地早熟禾葉片光合色素含量的影響Table 3 Effect of exogenous NO on photosynthetic pigment contents of Poa pratensis leaves under Cd stress

2.4 外源NO對(duì)鎘脅迫下草地早熟禾幼苗葉片抗氧化酶活性的影響

2.4.1 外源NO鎘脅迫下草地早熟禾幼苗葉片SOD活性的影響 由圖2可知,施加不同濃度SNP顯著影響了SOD活性,CK的SOD活性顯著高于其他處理(P＜0.05)。 50和100 μmol·L-1SNP 處理的SOD 活性較0 μmol·L-1SNP處理分別顯著增加 27.70%和58.61%,200、400 和 600 μmol·L-1SNP 處理則顯著降低了SOD活性(P＜0.05)。

2.4.2 外源NO對(duì)鎘脅迫下草地早熟禾幼苗葉片CAT活性的影響 由圖3可知,CK的POD活性顯著高于不同濃度SNP處理,施加50和100 μmol·L-1SNP處理的CAT活性較0 μmol·L-1SNP處理分別顯著增加57.38%和 83.51%(P＜0.05)。 200、400和 600 μmol·L-1SNP處理均不同程度地降低了CAT活性,對(duì)草地早熟禾幼苗造成了一定傷害。

圖2 外源NO對(duì)鎘脅迫下草地早熟禾葉片SOD活性的影響Fig.2 Effect of exogenous NO on SOD activity ofPoa pratensis leaves under Cd stress

圖3 外源NO對(duì)鎘脅迫下草地早熟禾葉片CAT活性的影響Fig.3 Effect of exogenous NO on CAT activity of Poa pratensis leaves under Cd stress

2.4.3 外源NO對(duì)鎘脅迫下草地早熟禾幼苗葉片POD活性的影響 由圖4可知,50和100 μmol·L-1SNP處理的POD活性比0 μmol·L-1SNP處理分別顯著增加14.76%和46.28%(P＜0.05)。200、400和600 μmol·L-1SNP處理顯著低于其他處理,其中 CK的POD活性最高,100 μmol·L-1SNP處理的緩解鎘脅迫影響效果最顯著。結(jié)果表明,低濃度SNP處理通過增強(qiáng)草地早熟禾過氧化物酶活性來緩解鎘脅迫,但過量SNP會(huì)降低POD活性,對(duì)植物造成傷害。

2.4.4 外源對(duì)鎘脅迫下草地早熟禾幼苗葉片APX活性的影響 由圖5可知,鎘脅迫下,隨著SNP濃度的增加,APX活性呈先上升后下降的趨勢(shì)。SNP濃度為100 μmol·L-1時(shí),APX 活性顯著高于其他處理(P＜0.05)；50 μmol·L-1SNP 處理的 APX 活性較 CK 增加6.75%,但兩者差異不顯著(P＞0.05)；100 μmol·L-1SNP處理的APX活性較CK顯著增加36.71%(P＜0.05),較 50 μmol·L-1SNP 處理顯著增加 28.06%(P＜圖4 外源NO對(duì)鎘脅迫下草地早熟禾葉片POD活性的影響Fig.4 Effect of exogenous NO on POD activity ofPoa pratensisleaves under Cd stress 0.05)；200 μmol·L-1SNP 處理的 APX 活性較 CK 降低5.58%,但兩者差異不顯著(P＞0.05)。而400和600 μmol·L-1SNP處理顯著降低了草地早熟禾幼苗葉片的APX活性(P＜0.05)。

2.5 外源NO對(duì)鎘脅迫下草地早熟禾幼苗MDA、Pro含量的影響

由圖6可知,鎘脅迫下,隨著SNP濃度的增加,MDA和Pro含量呈先減少后增加的趨勢(shì)。50 μmol·L-1SNP處理的MDA和Pro含量較0 μmol·L-1SNP處理分別減少了0.63倍和0.27倍；100 μmol·L-1SNP處理的MDA和Pro含量分別較0 μmol·L-1SNP處理減少了1.51倍和0.46倍,且差異顯著(P＜0.05)。 200、400和600 μmol·L-1SNP處理的MDA和Pro含量顯著高于其他SNP處理濃度,表現(xiàn)出明顯的抑制作用。

3 討論

圖6 外源NO對(duì)鎘脅迫下草地早熟禾葉片MDA(A)和游離脯氨酸(B)含量的影響Fig.6 Effect of exogenous NO on MDA(A)and free proline(B)content in Poa pratensis leaves under Cd stress

本研究結(jié)果表明,較高濃度的鎘脅迫對(duì)草地早熟禾種子的發(fā)芽率影響相對(duì)較弱,但鎘脅迫對(duì)胚根和胚芽的生長有明顯的抑制作用。這可能是因?yàn)榉N皮阻擋了鎘離子進(jìn)入種子,隨著種子開始萌發(fā),胚根開始生長,鎘離子會(huì)在生長點(diǎn)附近累積,傷害根部。此外,外源NO在很大程度上促進(jìn)了種子萌發(fā),提高了種子活力。其中以100 μmol·L-1SNP處理的效果最為明顯。這可能是由于NO能夠提高胚根、胚芽中的抗氧化酶活性或者增加纖維素含量,從而降低了重金屬鎘對(duì)細(xì)胞膜脂的損傷。這與研究外源NO對(duì)黃瓜(Cucumis sativusL.)[30]、紫花苜蓿(Medicago sativa)[31]、玉竹(Polygonatumodoratum(Mill.)Druce)[32]、辣椒(Capsicum annuumL.)[33]等影響的結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn),施加100 μmol·L-1SNP 可以有效緩解鎘脅迫,增加早地早熟禾幼苗葉片相對(duì)含水量和干物質(zhì)量,改善其生長狀態(tài)。

本研究中,添加200 μmol·L-1鎘離子會(huì)嚴(yán)重影響植物光合色素的含量,可能是鎘脅迫降低了合成葉綠素所需酶的活性[34],也可能是PSⅡ反應(yīng)中心的鈣離子被鎘離子取代從而降低了光能轉(zhuǎn)化效率[35]。添加100 μmol·L-1SNP可有效緩解鎘脅迫對(duì)光合作用的影響,增加葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量,增強(qiáng)植物抗性,這可能是因?yàn)橥庠碞O促進(jìn)了類囊體膜蛋白的組裝并提高了其穩(wěn)定性[36]。

逆境脅迫使植物體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)平衡被破壞而產(chǎn)生過量的活性氧,從而造成膜脂過氧化[37]。膜脂過氧化產(chǎn)生的MDA越多表示脅迫越嚴(yán)重。Pro作為理想的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和自由基清除劑用來調(diào)節(jié)植物細(xì)胞的滲透平衡和清除自由基,在一定逆境條件下其含量越多表示受到的逆境脅迫越強(qiáng)。POD、SOD、CAT、APX可維持活性氧(reactive oxygen species,ROS)清除和產(chǎn)生的平衡[38],較高濃度的鎘脅迫會(huì)使 POD、SOD、CAT、APX活性降低,可能是因?yàn)檫@些酶活性中心被鎘離子占據(jù),使得酶失去了原有的功能[39],導(dǎo)致ROS累積,造成氧化脅迫。鎘脅迫下早熟禾體內(nèi)產(chǎn)生大量脯氨酸,主要原因可能是脯氨酸可作為抗氧化劑清除自由基或者與重金屬形成重金屬螯合物減輕重金屬活性[40]。 本研究中,施加 100 μmol·L-1SNP 可顯著提高鎘脅迫下草地早熟禾幼苗葉片中的POD、SOD、CAT和APX活性,降低脯氨酸的累積。這可能是由于外源NO一方面會(huì)提高POD、SOD、CAT和APX活性[41],另一方面外源NO可直接參與清除ROS[42]。

4 結(jié)論

適宜濃度的外源NO可以有效緩解鎘脅迫對(duì)草地早熟禾造成的傷害,促進(jìn)種子萌發(fā),增加葉綠素光合色素含量,減少M(fèi)DA和游離脯氨酸的累積,提高POD、SOD、CAT和APX活性,減輕細(xì)胞膜脂損傷,增加干物質(zhì)含量和相對(duì)含水量,進(jìn)而促進(jìn)草地早熟禾生長。