劉志高 邵偉麗 申亞梅 季夢成 葉 盈

(浙江農(nóng)林大學風景園林與建筑學院,浙江杭州 311300)

鐵線蓮屬(Clematis)植物被譽為“藤本皇后”,花色艷麗、花型多樣,是家庭園藝和城市綠化的優(yōu)良材料。觀賞鐵線蓮品種多以歐洲為育種起源地,適宜在冷涼干燥的環(huán)境下栽培,目前已有超過400個品種在世界各地廣泛種植[1]。我國上海市和浙江省自本世紀初開始引進觀賞鐵線蓮品種,深受園藝愛好者喜愛。相對于地理緯度較高的歐洲,江南地區(qū)的氣候更加溫暖,夏季高溫易引發(fā)鐵線蓮莖葉熱害。如杭州夏季常出現(xiàn)40℃高溫天氣,致使植株葉片萎蔫脫落、莖稈枯萎,甚至整株死亡,觀賞價值大打折扣,同時造成光合效率下降,有機產(chǎn)物積累受阻,影響翌年營養(yǎng)生長和開花。目前有關(guān)鐵線蓮耐熱生理及耐熱品種選育的研究較少,僅限于對皇帝、落日等少數(shù)幾個品種耐熱性的比較[2],評價體系尚有待完善。此外,植物耐熱能力是一個復雜的綜合性狀,僅靠少量通用指標難以對耐熱性強弱進行準確評判[3-4],因而借助多元統(tǒng)計方法對植物耐熱性進行綜合評價更為科學合理[5]。

浙江農(nóng)林大學觀賞鐵線蓮育種課題組在品種耐熱栽培適應(yīng)性研究方面進行了多年實踐,本次選取11項典型生理生化指標,采用主成分、隸屬函數(shù)和逐步回歸等分析方法,對20個常見鐵線蓮品種的耐熱性進行比較,篩選出6個適宜的耐熱性評價指標,并據(jù)此建立評價體系,旨在為鐵線蓮品種栽培適應(yīng)性評價體系的建立和耐熱型鐵線蓮品種選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的20個鐵線蓮栽培品種均為江浙地區(qū)廣泛銷售的種類。 采用由波蘭 CLEMATIS Z'ród?o Dobrych Pn?czy公司進口的3年生扦插苗,每個品種6株,共120株。試驗開始前在國際鐵線蓮協(xié)會(International Clematis Society,http://www.clematisinternational.com)數(shù)據(jù)庫中對所購買品種主要信息逐一進行核對(表1)。

1.2 試驗方法

1.2.1 高溫半致死溫度測定 為避免自然高溫對葉片的影響,于2015年5月14-16日(日最高溫度26～27℃)采集葉樣。選用健康、成熟葉片作為試驗材料,每個品種采集3個植株,每株2～3片復葉。葉片高溫半致死溫度測定參照李謙盛等[6]的方法,采用Logistic方程進行擬合計算:

表1 20個供試鐵線蓮品種基本信息Table 1 The information of 20 Clematis cultivars

式中,y:葉片相對電導率；k:相對電導率的飽和容量；t:處理溫度。方程經(jīng)線性化處理后采用直線回歸法計算a、b值。

1.2.2 高溫處理與觀測采樣 2015年7月23日傍晚將供試植株放入溫室,利用溫室內(nèi)加小棚(高1.5 m、底寬2.2 m、長16 m)的方式獲取高溫對試驗材料進行處理。于7月24日、7月31日和8月7日分3次進行形態(tài)觀測和葉片樣品采集,形態(tài)觀測包括每個品種的6個植株莖、葉生長情況并記錄,葉片采集方法同1.2.1。試驗期間進行正常水分管理,小棚內(nèi)溫度變化見圖1。

1.2.3 高溫下植株熱害指數(shù)的測定 熱害指數(shù)(heat injury indexes,HII)的量化參考楊寅桂[7]的方法,并稍加改進。根據(jù)葉片在高溫下的表現(xiàn),將熱害分為:0級,植株長勢旺盛,成熟葉片和新葉正常,無熱害表現(xiàn)；1級,植株長勢較好,新葉和成熟葉片發(fā)黃、下垂占比1/3以下；2級,植株長勢一般,新葉和成熟葉片發(fā)黃、葉片邊緣發(fā)黑、出現(xiàn)焦枯斑點、下垂占比1/2～2/3；3級,植株長勢較差,新葉和成熟葉片發(fā)黃、葉片大面積焦枯、下垂占比2/3以上；4級,整個植株枯萎死亡。按照公式計算熱害指數(shù):

熱害指數(shù)越大,植株受害越嚴重,耐熱性越弱。

1.2.4 高溫下葉片生理生化指標測定 葉片萎蔫程度(wilting degree,WD)的測定參照劉少卿等[8]的方法。分別在6:00～7:00和14:00～15:00期間采葉樣并稱取鮮重,再將葉片放入105℃烘箱,5 h后稱葉片干重。分別計算早上和中午的葉片含水量,兩者差值即可量化為葉片萎蔫程度。參照李合生[9]的方法分別測定相對電導率(relative electrical conductivity,REC)、葉綠素含量(chlorophyll content,CC)、可溶性蛋白含量(soluble protein content,SPC)、可溶性糖含量(soluble sugar content,SSC)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量；參照Zhu等[10]的方法測定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化物酶(peroxidase,POD)和抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)活性。每個指標3次重復。

圖1 試驗期間氣溫變化Fig.1 The variation of temperature during the test

1.2.5 數(shù)據(jù)分析與耐熱性評價 選取8月7日測定的數(shù)據(jù)用于鐵線蓮品種耐熱性評價分析。采用Microsoft Office Excel 2007進行數(shù)據(jù)整理與作圖；SPSS 19.0和DPS V7.05進行相關(guān)性、主成分、隸屬函數(shù)[11]、逐步回歸[12]和系統(tǒng)聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同鐵線蓮品種高溫半致死溫度

高溫半致死溫度(lethal temperature 50,LT50)是指在該溫度下,植物達到半致死狀態(tài),若溫度繼續(xù)升高,植物所受的傷害將不可恢復甚至死亡。以Logistic Equation擬合計算不同品種的高溫半致死溫度,擬合度R2在0.889～0.934之間(表2),擬合效果理想。如古、羅曼蒂克和浪子的LT50均超過40℃,其中如古最高,達到42.17℃,表現(xiàn)出較強的高溫適應(yīng)性。蘇珊夫人、維辛斯基主教、藍焰和藍光的LT50均在35℃以下,對高溫的耐受能力較弱。

表2 不同樣本高溫半致死溫度Table 2 The semi-lethal high temperature of different samples

2.2 熱害指數(shù)觀測

7月24日-8月7日均為晴熱天氣,外界日最高氣溫達39℃,溫室小棚內(nèi)最高氣溫達到41℃(圖1),日平均最高和最低氣溫分別為38.4和27.2℃。試驗期間最高氣溫超過37℃有12 d(80.0%),為鐵線蓮耐熱指標觀測創(chuàng)造了良好條件。持續(xù)高溫對鐵線蓮莖葉長勢影響顯著,各品種的熱害指數(shù)均有所升高(圖2)。至8月7日,藍光、藍焰、水晶噴泉、蘇珊夫人和小鴨等表現(xiàn)出葉片失綠、邊緣卷曲、葉片萎蔫干枯等較嚴重的熱害癥狀；羅曼蒂克、如古、浪子和里昂村莊等種類受害程度較輕,顯示出較強的耐熱能力。

2.3 高溫下生理生化指標的變化

由圖2可知,高溫狀態(tài)下,不同鐵線蓮品種的HII、WD、REC、SSC、MDA 含量,以及POD 和APX 活性均呈上升趨勢；除蘇珊夫人SOD活性略有反復外,其他品種SOD活性均呈上升趨勢；CC和SPC隨著熱害時間的延長均呈下降趨勢?？傮w而言,各單項指標中不同品種的測定值變化方向趨于一致,高溫脅迫對鐵線蓮品種的生理代謝過程產(chǎn)生了顯著影響,所選取的各項指標較為合理。此外,不同品種在同一指標內(nèi)的變化幅度差異較大,以7月24日和8月7日的HII、WD和REC數(shù)據(jù)為例,羅曼蒂克、如古和浪子的HII增幅最小,均在1.0以下,藍光、藍焰和水晶噴泉增幅較大,都在2.0以上；羅曼蒂克和如古的WD增幅較小,均在0.35以下,藍光和水晶噴泉的WD增幅較大,均高于0.81。羅曼蒂克、如古和浪子的 REC增幅均小于0.331,藍焰、維辛斯基主教和水晶噴泉的REC增幅均大于0.90。對上述3項指標而言,數(shù)值增幅或絕對值越大均表明此種類耐熱性越弱,反之則耐熱性越強,但依據(jù)其中任意一項指標都將得到不同的耐熱性評價結(jié)果,采用多指標的綜合評價方法才能避免此類問題。

圖2 高溫下20個鐵線蓮品種的生理生化指標變化情況Fig.2 Changing of physiological and biochemical index of 20 Clematis cultivars under heatshock

2.4 耐熱性評價

2.4.1 各生理生化指標的相關(guān)性分析 由表3可知,HII、WD、MDA含量以及 SOD、POD活性與 REC呈正相關(guān),CC、SPC、SSC以及APX活性與REC呈負相關(guān),其中SPC、MDA含量和SOD活性與REC的相關(guān)性均達到極顯著或顯著水平。各指標之間的相關(guān)性會使它們提供的信息產(chǎn)生不同程度的重疊,需要進一步分析,以明確不同指標在鐵線蓮耐熱性中的貢獻率,構(gòu)建綜合評價體系,并據(jù)此篩選耐熱性評價的關(guān)鍵指標。

表3 10個生理生化指標相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of 10 physiological biochemical indices

2.4.2 耐熱性評價 主成分分析可以通過降維的方法精簡指標數(shù)量,將多個相互關(guān)聯(lián)的指標轉(zhuǎn)化為少數(shù)幾個包含原有變量絕大多數(shù)信息,且互不干擾的綜合指標。由表4可知,原有10個生理生化指標可簡化為累計貢獻率85.513%的4個綜合指標,其特征值分別為4.735、1.551、1.150 和 1.115；貢獻 率 分別為47.353%、15.510%、11.504%和 11.146%。4個綜合指標能夠反映原有10項指標的絕大部分信息,便于更準確地評價不同鐵線蓮品種的耐熱性強弱。

表4 高溫脅迫下不同鐵線蓮種類生理生化指標主成分分析結(jié)果Table 4 Result of principal component analysis of physiological-biochemical indexes of different species in Clematis under high temperature stress

以4個主因子綜合指標值(comprehensive index,CI)為基礎(chǔ)數(shù)據(jù),利用隸屬函數(shù)公式進行標準化轉(zhuǎn)換得到其隸屬函數(shù)值(subordinate function value,U)(表5),根據(jù)4個主成分的貢獻率和累積貢獻率,可以計算出其綜合指標權(quán)重,分別為0.505、0.270、0.125和0.100。依據(jù)綜合指標的隸屬函數(shù)值和權(quán)重,計算得出20個鐵線蓮品種的耐熱性綜合評價值(comprehensive evaluation value,D)。得分越高者耐熱能力越強,反之耐熱能力越弱。因此,20個鐵線蓮品種的耐熱性由強到弱依次為羅曼蒂克＞如古＞浪子＞烏托邦＞里昂村莊＞戴安娜公主＞總統(tǒng)＞靈感＞包查德女伯爵＞蘇珊夫人＞如夢＞東方晨曲＞狂想曲＞小鴨＞藍天使＞茱莉亞夫人＞維辛斯基主教＞水晶噴泉＞藍焰＞藍光。

2.4.3 耐熱性聚類分析 以8月7日數(shù)據(jù)分析結(jié)果為依據(jù)進行聚類分析,可以將20個鐵線蓮品種分為4組(圖3-C)。由表5可知,第一組為耐高溫型,包括羅曼蒂克、如古和浪子共3種(15.0%)；第二組為較耐高溫型,包括烏托邦、里昂村莊、戴安娜公主、總統(tǒng)、靈感、包查德女伯爵、蘇珊夫人、如夢、東方晨曲、狂想曲、小鴨和藍天使共12種(60.0%)；第三組為高溫較敏感型,包括水晶噴泉、維辛斯基主教和茱莉亞夫人3種(15.0%)；第四組為高溫敏感型,包括藍焰和藍光2種(10.0%)。將基于7月24和31日數(shù)據(jù)計算所得綜合評價值D各自進行聚類,所得結(jié)果存在一定差異(圖3-A、B)。隨著高溫脅迫時間的延長,耐高溫型(Ⅳ)與高溫敏感型種類(Ⅰ)的熱適應(yīng)性差異逐步顯現(xiàn),從群體中(圖3-A)分離出來。8月7日與7月31日的聚類結(jié)果中耐高溫型與高溫敏感型種類保持一致,高溫較敏感型(Ⅱ)與較耐高溫型(Ⅲ)品種的D值排序仍有小幅變動(圖3-B、C),表明自然高溫處理條件下,供試鐵線蓮品種間的耐熱能力差異必須經(jīng)歷一定時間(1～2周)的持續(xù)脅迫才能顯現(xiàn),這與耐熱指標隨時間的顯著性改變(圖2)相互呼應(yīng)。

表5 20個鐵線蓮品種綜合指標值、隸屬函數(shù)值及綜合評價值Table 5 The values of CI,U and D of 20 Clematis cultivars

圖3 依據(jù)高溫下3次采樣數(shù)據(jù)的耐熱綜合評價值進行聚類分析。Fig.3 Cluster analysis based on the comprehensive evaluation value of three sampling data under high temperature stress

2.4.4 耐熱鑒定指標篩選 本試驗涉及的耐熱評價單項指標較多,通過逐步回歸分析可以在保證耐熱評價準確度的前提下精簡評價指標,從而減少工作量,建立準確、高效的鐵線蓮品種耐熱評價體系。以耐熱綜合評價值D為因變量,各單項指標數(shù)據(jù)作為自變量,進行逐步回歸分析,建立如下回歸方程:

y=-0.007 2+0.015 1x1+0.008 5x2-0.178 9x4+0.003 2x7+0.032 6x8-0.005 1x10(F=136.450,R=0.989,P=0.000 1)。

原有10個單項評價指標可以精簡為x1、x2、x4、x7、x8和x106項,它們分別代表了相對電導率、熱害指數(shù)、葉綠素、MDA含量、SOD活性和APX活性。此外,將耐熱綜合評價值D與高溫半致死溫度LT50進行相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)兩者呈極顯著正相關(guān)(R=0.83**),即LT50也可以作為鐵線蓮耐熱性評價的指標。

3 討論

3.1 鐵線蓮品種的耐熱性及其與高溫半致死溫度指標的關(guān)系

植物原產(chǎn)地氣候條件對其生態(tài)適應(yīng)性影響很大。本研究所選用的20個品種中有16個(80%)源自英國、法國、波蘭等氣候冷涼的歐洲國家,這些品種在耐寒、耐旱性方面都有不錯的表現(xiàn),但高溫耐受性是其適應(yīng)能力的短板[13]。本次篩選出的耐熱種類僅有羅曼蒂克、如古和浪子3種(15.0%),也印證了這一觀點。研究表明,植物細胞膜穩(wěn)定性與其抗逆性密切相關(guān),以電導率擬合Logisitic方程可以簡單、準確地估算高溫半致死溫度,也能較準確地反映植物耐熱性差異[14]。這種高/低溫半致死溫度與植物抗逆能力的相關(guān)性同樣出現(xiàn)在生菜(Lactuca sativa)[15]、景天屬(Sedum)植物[16]的耐熱和葡萄(Vitis vinifer)[17]、油橄欖(Olea europaea)[18]等植物的耐寒性研究結(jié)論中。但也有學者認為,離體測定植物葉片細胞的電導率并不能真實反映植株受害程度[19]。本研究中,鐵線蓮供試樣本耐熱綜合評價結(jié)果與高溫半致死溫度呈極顯著正相關(guān),驗證了其作為鐵線蓮耐熱評價指標的可靠性,值得注意的是,在杜鵑(Rhododendron simsii)[20]、金花茶(Camellia nitidissima)[21]、黃瓜(Cucumis sativus)[22]等植物中,耐熱類型的LT50都在50.0℃以上,本次篩選出的3個耐熱型鐵線蓮品種中LT50最高為42.17℃(如古),這與五葉地錦、凌霄等常見觀賞藤本植物60℃以上的LT50[23]相比,耐熱能力差距明顯。這一方面反映了不同植物間的耐熱性差異,另一方面表明供試鐵線蓮品種耐熱能力總體水平較低。

3.2 高溫對鐵線蓮形態(tài)和生理生化指標的影響

持續(xù)高溫會造成耐熱性較差的鐵線蓮品種葉片變黃、萎蔫下垂,這是葉綠素降解、葉片細胞失水的表現(xiàn)[24-25]。HII可以直觀反映植物遭受熱害的程度,并將其表型特征數(shù)量化,便于進行數(shù)據(jù)分析,被認為是比較可靠的耐熱性評價指標并廣泛應(yīng)用[26-28]。本研究結(jié)果表明,不同耐熱型鐵線蓮品種的HII差異顯著,可作為耐熱性評價的關(guān)鍵指標,也驗證了HII的可靠性,為通過表型觀測對品種耐熱性進行預判提供了依據(jù)。

此外,本研究中入選的鐵線蓮耐熱性評價關(guān)鍵生理指標還有 REC、MDA含量、CC以及 SOD、APX活性,由于測定樣本數(shù)量、選取指標類別和數(shù)據(jù)分析方法存在差異,導致與朱玉雪等[2]在4種鐵線蓮耐熱性研究中篩選出的REC、MDA含量、相對含水量和CAT活性4個指標并不完全一致,但REC和MDA含量均入選關(guān)鍵評價指標。REC和MDA含量是評價植物抗逆性的傳統(tǒng)指標,已被用于鐵炮百合(Lilium longiflorum)[29]、菊花(Chrysanthemum morifolium)[30]、藍莓(Vaccinium corymbosum)[31]、越桔(Vaccinium corymbosum)[32]等諸多園藝植物的耐熱性評價。葉綠素含量與植物光合機能關(guān)系密切,易受到熱脅迫的影響[33]。研究表明,葉綠素含量下降是造成光合速率下降的根本原因,其含量變化可以在一定程度上反映植物受害程度[34]。本研究中,耐熱性越弱的鐵線蓮品種,其葉綠素含量降低越顯著,與黃瓜(C.sativus)[35]、蘇鐵(Cycas revoluta)[36]的研究結(jié)果相似。此外,高溫等逆境條件會使植物細胞內(nèi)產(chǎn)生大量超氧自由基(),造成細胞膜脂過氧化脅迫。抗氧化酶系統(tǒng)可以清除細胞內(nèi)過度積累的活性氧等有毒物質(zhì),維持細胞膜正常的生理功能。APX以抗壞血酸為電子供體,可以有針對性地清除葉綠體細胞內(nèi)的H2O2和；SOD是參與清除活性氧系列反應(yīng)中的第一個抗氧化酶,能將快速歧化為O2和H2O2,再由POD和CAT負責清除,從而保護細胞免受氧化脅迫[38]。高溫引起鐵線蓮品種APX、SOD和POD等抗氧化保護酶活性提高,其中SOD和APX活性變化與品種耐熱能力具有顯著相關(guān)性,表明這2種保護酶在鐵線蓮熱脅迫響應(yīng)和耐熱性狀形成過程中發(fā)揮著重要作用,但POD活性與鐵線蓮品種耐熱性并未表現(xiàn)出明顯的對應(yīng)關(guān)系,其原因有待于進一步研究。

3.3 耐熱性評價的復雜性

不同植物種類對熱脅迫的響應(yīng)與適應(yīng)機制存在較大差異。植物的耐熱性與自身表型性狀、發(fā)育階段[39-40]、生理代謝強弱等有關(guān),又受熱害發(fā)生時間、持續(xù)時間、脅迫強度、光照、水分因子的共同作用等多種因素影響,是在植物與環(huán)境因子之間相互作用的復雜過程中形成的[41-42]。本研究利用溫室內(nèi)的自然高溫進行熱脅迫處理,有效控制了夏季強光、高濕等復合逆境的形成,利于更加客觀地對鐵線蓮品種耐熱性進行評價。可用于耐熱性評價的指標種類豐富[43],對熱脅迫的響應(yīng)方式各異,不同指標之間也存在一定關(guān)聯(lián)[44]。本研究中,10個生理生化指標在高溫下的變化趨勢和相關(guān)性分析結(jié)果與上述觀點一致,表明使用單項指標難以對鐵線蓮品種耐熱性進行準確評判,借助多元統(tǒng)計方法才能構(gòu)建高效、準確的鐵線蓮耐熱評價體系。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明,按照耐熱性排序,20個鐵線蓮品種可劃分為耐高溫、較耐高溫、高溫較敏感和高溫敏感4種類型；REC、HII、CC、MDA 含量和 APX 活性 6個指標可以反映鐵線蓮的耐熱能力,由其建立的方程模型可以高效、準確地進行鐵線蓮耐熱性評價,依據(jù)綜合評價值D證實了半致死溫度作為鐵線蓮耐熱性評價的可靠性。本研究為鐵線蓮栽培適應(yīng)性評價體系的建立和耐熱型品種選育提供了理論基礎(chǔ)和實踐依據(jù)。