阮亞男 韓 陽 邢曉琳 崔智昕 孟 靖

(遼寧大學生命科學院,遼寧沈陽 110036)

離子液體是由有機陽離子與有機或無機陰離子構成,在室溫或者使用溫度下呈液態(tài)的一種新型的有機溶劑[1],因其環(huán)境友好的特性而被稱為綠色溶劑,在化學工程、生物技術、材料、液態(tài)晶體等多個領域都有廣闊的應用前景[2]。離子液體不易揮發(fā),在空氣中穩(wěn)定性高,不易造成大氣污染,但其在水體中溶解度高,極易造成水體污染。離子液體的深入研究及廣泛應用發(fā)現(xiàn)[2],離子液體在意外泄露、工業(yè)污水排放等情況下易通過水循環(huán)進入生態(tài)系統(tǒng),對水生生物及土壤生態(tài)系統(tǒng)造成影響,最終威脅人類健康。因此,離子液體環(huán)境友好型及其對環(huán)境和生物安全性受到了廣泛關注[3]。

咪唑類離子液體具有電導率高、粘度高的特點,是目前廣泛應用的綠色溶劑之一。該離子液體在水體及土壤中的生物降解性較差,具有生物毒性[4],其毒性與取代基烷基鏈長度成正比,對植物、土壤微生物、土壤動物等都具有一定的毒害作用。研究發(fā)現(xiàn)離子液體對植物的生長發(fā)育有抑制作用,進入植物體可與生物大分子蛋白和DNA直接或間接發(fā)生反應,影響DNA及蛋白質(zhì)結構的穩(wěn)定性,損壞細胞壁、增大細胞膜透性,引發(fā)毒性反應。但離子液體亦可影響植物葉綠素a的產(chǎn)生,誘發(fā)氧化應激,以應對非生物脅迫的影響[4-5]。在植物啟動抗氧化系統(tǒng)的同時,抗氧化系統(tǒng)主要酶及相關的抗逆基因表達必然受到影響。目前,關于離子液體對植物影響的研究已有大量報道[4-5],但多集中在個體水平,而在分子轉(zhuǎn)錄水平的相關研究尚鮮見報道。本試驗以我國各地普遍栽培的蔬菜作物小白菜為試驗材料,研究離子液體1-丙基-3-甲基咪唑四氟硼酸([C3mim]BF4)對其種子萌發(fā)、幼苗生長、抗氧化系統(tǒng)的影響及其分子機制,以期為揭示咪唑類離子液體毒性機理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

供試小白菜(Brassica campestrisL.ssp.chinensisMakino)品種為青梗1號,購自遼寧省沈陽農(nóng)業(yè)大學農(nóng)資站。

離子液體[C3mim]BF4,結構如下:

由遼寧大學關偉教授提供,其核磁共振氫譜和文獻[6]相符,樣品純度99%。其他試劑均為分析純,購自上海生物工程有限公司。

1.2 測定指標與方法

1.2.1 試驗材料的培養(yǎng) 選取顆粒飽滿的小白菜種子,用0.1%HgCl2浸泡10 min,無菌水反復沖洗3次。分別用 0(CK)、100、200、300、400、500 mg·L-1[C3mim]BF4水溶液浸泡種子12 h,將浸泡處理過的種子平鋪在濾紙上,每皿鋪入100粒。在培養(yǎng)皿中加入20 mL含對應濃度[C3mim]BF4的Hoagland營養(yǎng)液,以后每天向培養(yǎng)皿中添加相應的營養(yǎng)液1次,每次5 mL。將培養(yǎng)皿放在人工氣候箱中,24±1℃恒溫培養(yǎng),每天光照時間12 h。每個處理3次重復。

1.2.2 發(fā)芽率和株高的測定

于培養(yǎng)第7天按照公式計算發(fā)芽率:

于培養(yǎng)第20天,從每個濃度的3個平行中,各隨機取10株小白菜幼苗,用于測定株高。株高為從莖基部到最長葉片的長度。

1.2.3 生理生化指標的測定 于培養(yǎng)第20天,在每個濃度的3個平行中隨機取樣進行生理指標測定。超氧陰離子自由基()產(chǎn)生速率采用羥胺法[7]進行測定；過氧化氫(H2O2)含量測定采用硫酸鈦法[8]；丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量測定采用硫代巴比妥酸法[9]；脯氨酸(proline,Pro)含量測定采用酸性茚三酮法[10]；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性測定采用氮藍四唑藍(nitroblue tetrazolium,NBT)光還原法[11]；過氧化氫酶(catalase,CAT)活性測定采用紫外吸收法[12]；抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)活性測定采用紫外分光光度法[13]；谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase,GR)活性測定采用紫外分光光度法[14]。

1.2.4 RNA提取和RT-PCR分析 選取顆粒飽滿的小白菜種子,用0.1%HgCl2消毒后用無菌水浸泡12 h,然后鋪在培養(yǎng)皿中,每皿100顆。在培養(yǎng)皿中加入Hoagland營養(yǎng)液20 mL,直至發(fā)芽。在培養(yǎng)第7天,用含400 mg·L-1[C3mim]BF4的Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)幼苗,隨后每天向培養(yǎng)皿中添加相應的營養(yǎng)液1次,每次5 mL。培養(yǎng)條件:24±1℃,光照時間為每天12 h。分別于[C3mim]BF4處理 0、1、3、6、12、24 h 和 13 d 時取小白菜幼苗葉片,立即置于液氮中冷凍,并保存于-80℃冰箱。采用植物總 RNA提取試劑盒(華越洋生物公司生產(chǎn))提取材料的總RNA,并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

參考鐘友明[15]的引物序列(表1),擴增小白菜Cu/Zn-SOD(AF071112)、APX(GQ500125)和CAT(U68219.2)。以β-actin(GQ339782)作為內(nèi)參,調(diào)整每個處理的cDNA模板量一致。PCR擴增體系為25 μL,包括 0.5 μL Taq,10 mmol·L-1dNTP Mixture 0.5 μL,5 μmol·L-1正向引物和 5 μmol·L-1反向引物各 0.5 μL,40 ng·μL-1cDNA 模板 2.5 μL,18 μL ddH2O。PCR擴增程序:94℃預變性 5 min；94℃變性 30 s,54℃退火30 s,72℃延伸1 min,35循環(huán)；72℃延伸10 min。所有PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 RT-PCR引物序列Table 1 RT-PCR primers information

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析；LSD進行多重比較,顯著性以P值表示,P＜0.05表示差異顯著。RT-PCR電泳圖條帶采用Image J軟件進行灰度值分析。

2 結果與分析

2.1 [C3mim]BF4濃度對小白菜發(fā)芽率和株高的影響

由表2可知,100～300 mg·L-1[C3mim]BF4對小白菜種子萌發(fā)無顯著影響,發(fā)芽率與CK相比無顯著差異；而400～500 mg·L-1[C3mim]BF4處理組種子發(fā)芽率顯著低于CK,且500 mg·L-1[C3mim]BF4處理的發(fā)芽率顯著低于400 mg·L-1[C3mim]BF4處理組。表明較低濃度[C3mim]BF4對小白菜種子萌發(fā)無影響,而300～500 mg·L-1[C3mim]BF4則抑制種子萌發(fā)。

株高變化是植物遭受脅迫時從外觀上表現(xiàn)的癥狀之一。100～400 mg·L-1[C3mim]BF4處理組小白菜株高與CK間無顯著差異,而500 mg·L-1[C3mim]BF4處理組小白菜株高較CK顯著降低36.74%(P＜0.05)。說明100～400 mg·L-1[C3mim]BF4對小白菜幼苗生長無顯著影響,而高濃度[C3mim]BF4則抑制幼苗生長。不同濃度[C3mim]BF4對小白菜種子萌發(fā)和幼苗生長的影響存在差異,其中400 mg·L-1[C3mim]BF4抑制小白菜種子萌發(fā),500 mg·L-1[C3mim]BF4抑制了小白菜種子萌發(fā)和幼苗生長,且其對幼苗生長的抑制作用大于對種子萌發(fā)的影響,此結果符合植物發(fā)育的不同階段抗性不同的特點。

表2 [C3mim]BF4濃度對小白菜發(fā)芽率和株高的影響Table 2 Effect of[C3mim]BF4concenation on germination percentage and plant height of pakchoi

2.2 [C3mim]BF4濃度對小白菜幼苗活性氧生成的影響

由圖1可知,隨著[C3mim]BF4濃度的增加,小白菜葉片超氧陰離子自由基()產(chǎn)生速率逐漸升高,500 mg·L-1[C3mim]BF4處理組產(chǎn)生速率最高,較CK 高17.59%。 除200、300 mg·L-1[C3mim]BF4處理組間產(chǎn)生速率無顯著差異外,其他各處理間均差異顯著。

圖1 [C3mim]BF4濃度對小白菜幼苗O2-產(chǎn)生速率的影響Fig.1 Effects of the concentration of[C3mim]BF4on the rate of O2-production in pakchoi seedlings

由圖2可知,隨著[C3mim]BF4濃度的增加,小白菜幼苗H2O2含量也逐漸升高,500 mg·L-1[C3mim]BF4處理組H2O2含量最高。100 mg·L-1[C3mim]BF4處理組 H2O2含量顯著低于 CK；200、300 mg·L-1[C3mim]BF4處理組H2O2含量與CK間無顯著差異；而 400、500 mg·L-1[C3mim]BF4處理組 H2O2含量顯著高于CK,其中500 mg·L-1[C3mim]BF4處理組H2O2含量為CK的128%。結果表明,[C3mim]BF4能誘發(fā)小白菜幼苗細胞內(nèi)活性氧的生成,而活性氧代謝失調(diào)最終將造成細胞結構的損傷。

2.3 [C3mim]BF4濃度對小白菜幼苗MDA含量的影響

MDA是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物。由圖3可知,100～300 mg·L-1[C3mim]BF4處理對小白菜葉片MDA含量無顯著影響,繼續(xù)增加[C3mim]BF4濃度,MDA含量顯著升高,400和500 mg·L-1[C3mim]BF4處理組幼苗MDA含量分別是CK的233%和255%。結果表明,[C3mim]BF4濃度高于400 mg·L-1時能加速小白菜幼苗脂質(zhì)過氧化進程。

2.4 [C3mim]BF4濃度對小白菜幼苗脯氨酸含量的影響

圖2 [C3mim]BF4濃度對小白菜幼苗H2O2含量的影響Fig.2 Effect of the concentration of[C3mim]BF4on H2O2content in pakchoi seedlings

圖3 [C3mim]BF4濃度對小白菜幼苗MDA含量的影響Fig.3 Effect of the concentration of[C3mim]BF4on MDAcontent in pakchoi seedlings

脯氨酸是最有效的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一,以游離態(tài)廣泛分布在植物細胞中；在多種逆境下,植物體內(nèi)積累脯氨酸。由圖4可知,100～500 mg·L-1[C3mim]BF4處理組小白菜葉片的脯氨酸含量較CK顯著升高,其中,500 mg·L-1[C3mim]BF4處理組脯氨酸含量最高,是 CK 的 1.67倍。 除200、300 mg·L-1[C3mim]BF4處理組間脯氨酸含量無顯著差異外,其他各處理間均存在顯著差異,且隨著[C3mim]BF4濃度的增加,脯氨酸含量呈逐漸升高的趨勢。綜上表明,離子液體[C3mim]BF4對小白菜細胞構成了脅迫。

2.5 [C3mim]BF4濃度對小白菜幼苗抗氧化酶活性的影響

圖4 [C3mim]BF4濃度對小白菜幼苗脯氨酸含量的影響Fig.4 Effects of the concentration of[C3mim]BF4 on proline content in pakchoi seedlings

由表3可知,100～500 mg·L-1[C3mim]BF4處理下,小白菜葉片的SOD、CAT、APX和GR活性均呈先上升后下降的趨勢。300 mg·L-1[C3mim]BF4處理組小白菜葉片的SOD活性最高,較500和100 mg·L-1[C3mim]BF4處理組分別高21.13%、11.09%。各處理組的 SOD活性均顯著低于 CK,其中 500 mg·L-1[C3mim]BF4處理組僅為 CK的77.03%,說明[C3mim]BF4處理抑制了小白菜葉片的SOD活性。300 mg·L-1[C3mim]BF4處理組CAT活性最高,是CK的2.45倍；當[C3mim]BF4濃度為 400 mg·L-1時,小白菜葉片組織中CAT活性下降；當[C3mim]BF4濃度為500 mg·L-1時,CAT活性受到抑制,為 CK的36.69%。300 mg·L-1[C3mim]BF4處理組APX活性最高,是CK的1.98倍,是500 mg·L-1[C3mim]BF4處理組的8.32倍。100 mg·L-1[C3mim]BF4處理組小白菜葉片中APX活性與CK無顯著差異；200、300 mg·L-1[C3mim]BF4處理組APX活性較CK顯著增加,表明此時APX被激活,然而[C3mim]BF4濃度為400～500 mg·L-1時,APX 活性又顯著低于 CK。 400 mg·L-1[C3mim]BF4處理組小白菜葉的GR活性最高,為CK的7.48倍。各處理組的GR活性均顯著高于CK,且各處理間差異顯著。

2.6 [C3mim]BF4對抗氧化酶基因表達的影響

由圖5、表 4可知,400 mg·L-1[C3mim]BF4處理小白菜 1、3、6、12、24 h 和 13 d 后,隨著處理時間的延長,Cu/Zn-SOD表達量呈先升高再下降趨勢,表達量最高點出現(xiàn)在處理1 h時,其表達量是對照(以0 h為對照)的107.37%,隨后表達量逐漸下調(diào),但是在處理3 h時仍然高于對照,是對照的102.79%。處理6 h時,Cu/Zn-SOD表達量已經(jīng)低于對照；處理13 d時,基因表達量僅為對照的64.54%。表明離子液體的長時間處理會導致Cu/Zn-SOD表達量降低,且處理時間越長對Cu/Zn-SOD表達量的抑制作用越強。

表3 [C3mim]BF4濃度對小白菜幼苗抗氧化酶系的影響Table 3 Effect of the concentration of[C3mim]BF4on antioxidant enzyme series in pakchoi seedlings

400 mg·L-1[C3mim]BF4對CAT和APX表達的影響與Cu/Zn-SOD相似,隨著處理時間的延長,CAT和APX基因表達量均呈先升高再下降的趨勢,且處理時間越長對抗氧化酶基因表達的抑制作用越強。不同在于,CAT和APX表達最高點出現(xiàn)在處理3 h,此時CAT和APX表達量分別是對照的125.74%和105.39%。處理6 h時,APX表達量已經(jīng)低于對照；而處理6、12 h時CAT表達量仍高于對照。處理13 d時,其CAT和APX表達量均顯著低于對照,分別為對照的75.00%和16.16%。比較[C3mim]BF4對3種抗氧化酶基因表達的影響可知,[C3mim]BF4對APX基因表達的抑制作用更強。

表4 離子液體[C3mim]BF4處理時間對小白菜葉片抗氧化酶基因表達的影響(灰度值)Table 4 Effect of[C3mim]BF4treatment time on gene expression of antioxidant enzymes in leaves of pakchoi seedlings(grayscale value)

3 討論

圖5 [C3mim]BF4處理時間對小白菜葉片抗氧化酶基因表達的影響Fig.5 Effect of[C3mim]BF4treatment time on gene expression of antioxidant enzymes in leaves of pakchoi seedlings

幼苗期是植物對外界環(huán)境因素最敏感的時期,離子液體對幼苗生長有抑制作用。由于離子液體的不同及植物材料的不同,抑制作用的起始濃度及各濃度下的抑制率存在較大差異[16-18]。本研究中,100～400 mg·L-1[C3mim]BF4對小白菜幼苗生長無顯著影響,而500 mg·L-1[C3mim]BF4抑制幼苗生長。楊芬芬等[19]研究發(fā)現(xiàn)100～1 000 mg·L-1濃度范圍內(nèi)離子液體丁基甲基咪唑氯([BMIM]C1)、丁基甲基咪唑溴[EMIM]Br、1,3二甲基咪唑磷酸二甲酯鹽([MMIM][DMP])和乙基甲基咪唑硫酸單乙酯鹽([EMIM][Es])對小白菜的發(fā)芽率和發(fā)芽勢均未產(chǎn)生明顯影響,這與本研究結果不同。本研究中,濃度高于400 mg·L-1的[C3mim]BF4對小白菜種子發(fā)芽率產(chǎn)生了抑制。這可能與不同類型的離子液體毒性不同有關。

植物在正常生長狀態(tài)下,體內(nèi)可以產(chǎn)生適量的活性氧(reactive oxygen species,ROS),且ROS的產(chǎn)生和消除處于一種動態(tài)平衡,即植物體內(nèi)自身可以清除ROS。但當植物遭遇干旱、冷凍、鹽堿等不良環(huán)境時,體內(nèi)ROS產(chǎn)生和消除的動態(tài)平衡會被破壞,進而導致生物體內(nèi)ROS的過量積累[20],對植物的生長發(fā)育產(chǎn)生影響[21-23],如對生物大分子的破壞及生物膜的過氧化等,甚至造成細胞功能發(fā)生障礙而死亡[24]?？寡趸赶到y(tǒng)在植物ROS清除過程中發(fā)揮著重要作用,其中SOD 催化轉(zhuǎn)化為 H2O2和O2；CAT催化H2O2分解為H2O和O2；APX是植物AsA-GSH氧化還原途徑的重要組分,也是清除H2O2(特別是葉綠體中的 H2O2)的關鍵酶,還是抗壞血酸代謝的主要酶類。本試驗中,不同濃度的[C3mim]BF4處理使小白菜葉片產(chǎn)生速率和H2O2含量顯著升高,且與離子濃度呈正相關,表明[C3mim]BF4作為一種刺激物引發(fā)了活性氧的生成。小白菜葉片CAT和APX活性均呈先升高后降低的趨勢,說明較低濃度的[C3mim]BF4對抗氧化酶生成有一定的促進作用。高濃度(500 mg·L-1)[C3mim]BF4處理顯著抑制了小白菜葉片SOD、CAT和APX活性,這與500 mg·L-1[C3mim]BF4抑制小白菜生長,促進和H2O2的產(chǎn)生相對應,但與前人在小麥[25]、大麥[26]、蠶豆[27]、玉米[5]上的研究結果不完全相同。這不僅與植物材料對離子液體的敏感程度有關,還與離子液體的毒性相關。GR作為調(diào)節(jié)谷胱甘肽代謝的關鍵酶,其抗氧化脅迫作用體現(xiàn)在通過抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)使植物體內(nèi)2種重要的非酶抗氧化劑-谷胱甘肽和抗壞血酸得以再生[28]。離子液體[C3mim]BF4使小白菜葉片GR活性顯著升高,均高于CK。本研究中幾種抗氧化酶對[C3mim]BF4的響應幅度及趨勢不同,表明不同抗氧化酶對[C3mim]BF4的敏感性不同,SOD對[C3mim]BF4的應激敏感性高于CAT、APX和GR。此外,SOD、APX和CAT活性與其基因表達量之間存在不同步的現(xiàn)象,特別是CAT活性與其基因,這可能是因為本研究僅檢測了Cu/Zn-SOD、CAT1、APX1的表達情況,而它們的表達產(chǎn)物只是 SOD、APX和CAT同工酶中的一種,不能代表全酶系。本研究還發(fā)現(xiàn)400 mg·L-1[C3mim]BF4處理超過3 h會降低Cu/Zn-SOD和APX基因表達量,且隨著處理時間的延長,[C3mim]BF4對抗氧化酶的抑制作用越明顯,這與400 mg·L-1[C3mim]BF4對SOD和APX活性的抑制效果一致。

MDA是膜質(zhì)過氧化的產(chǎn)物,細胞中MDA含量可反映細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度,進而反映細胞受損的程度,其產(chǎn)生量已成為鑒別細胞傷害的指標之一。本研究中,100～300 mg·L-1[C3mim]BF4對葉片MDA含量無顯著影響；當[C3mim]BF4濃度高于400 mg·L-1時小白菜葉片MDA含量顯著升高。綜合考慮[C3mim]BF4對葉片活性氧和抗氧化酶的影響,發(fā)現(xiàn)在100～300 mg·L-1[C3mim]BF4處理下,小白菜細胞內(nèi)ROS濃度和抗氧化酶含量同時增加,抗氧化酶及時淬滅了離子液體誘發(fā)的ROS,保護了脂質(zhì)和細胞結構的完整性；而較高濃度的[C3mim]BF4破壞了植物體內(nèi)的ROS代謝平衡,抗氧酶及非酶抗氧化物無法清除細胞內(nèi)的ROS,導致膜質(zhì)過氧化程度加重,細胞受到嚴重損傷。

4 結論

本研究結果表明,[C3mim]BF4濃度越大,其對小白菜生長的影響越強?？傮w來看,[C3mim]BF4濃度高于400 mg·L-1會顯著抑制小白菜種子萌發(fā)、抗氧化酶活性。較高濃度離子液體對活性氧生成的促進和對抗氧化酶基因表達的抑制造成了植物體內(nèi)活性氧代謝平衡的失調(diào)。