許曉牧,陶敏慧,韓 陽(yáng)，徐婷婷,樊慧敏,唐慶權(quán),彭開松,劉天龍,田紀(jì)景,佘銳萍,朱若林,鮑傳和

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，水生健康與公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室，合肥 230036；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193)

1 材料和方法

1.1 主要試劑

胰蛋白胨大豆蛋白胨肉湯(TSB)、含0.1%考馬斯亮藍(lán)(CBB)的胰蛋白胨大豆蛋白胨瓊脂(TSA)、水解酪蛋白胨(MH)、水解酪蛋白胨瓊脂(MHA)、藥敏紙片、微量生化鑒定管購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。Taq DNA聚合酶購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。DNA膠回收試劑盒購(gòu)自愛思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司。抗生素標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所。PCR引物合成和基因測(cè)序由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司完成。

1.2 臨床診斷分析

2018年3月18日和3月27日兩次到達(dá)現(xiàn)場(chǎng)，通過病史詢問、水質(zhì)分析、飼料等投入品檢查、體表和鰓的寄生蟲檢查，進(jìn)行初步的臨床診斷。

1.3 細(xì)菌分離純化

1.4 細(xì)菌鑒定

純化菌分別在MHA、含0.1%的考馬斯亮藍(lán)(CBB)的TSA上，25 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)。挑單菌落進(jìn)行革蘭氏染色和生理生化指標(biāo)測(cè)定。以純化菌落為模板，參考朱若林等[11]方法擴(kuò)增16S rRNA，并進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。

1.5 溫度對(duì)分離株世代時(shí)間的影響

參考 Prescott等[12]方法，測(cè)定分離菌分別在15 ℃和25 ℃的TSB中培養(yǎng)的世代時(shí)間。

1.6 代表性毒力基因檢測(cè)

參考朱若林等[11]方法分別檢測(cè)嗜溫性氣單胞菌的代表性毒力基因,包括氣溶素(aerA)、細(xì)胞毒性腸毒素(Act)、熱不穩(wěn)定性腸毒素(Alt)、熱穩(wěn)定性腸毒素(Ast)、溶血素(hlyA)、鞭毛(Fla)、核酶(Exu)、絲氨酸蛋白酶(Ser)、彈性蛋白酶(ahyB)、酯酶(Lip)。參考文獻(xiàn)[13，14]檢測(cè)嗜冷性氣單胞菌的代表性毒力基因，包括毒力陣列蛋白基因(vapA)、甘油磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶(GCAT)。

1.7 動(dòng)物回歸感染

1.8 藥敏試驗(yàn)

參考?xì)W盟標(biāo)準(zhǔn)[16]，采用K-B紙片擴(kuò)散法及MIC肉湯稀釋法進(jìn)行抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 臨床診斷

2.2 細(xì)菌的分離純化和鑒定

分離的4株細(xì)菌，在MHA上25 ℃培養(yǎng)24 h后，形成圓形、表面光滑、邊緣整齊、半透明狀凸起的灰白色菌落。含0.1% CBB的TSA上生長(zhǎng)的菌落為白色，不產(chǎn)色素。分離菌為兩端鈍圓的革蘭氏陰性短直桿菌。生理生化鑒定結(jié)果見表1。

PCR擴(kuò)增分離菌的16S rRNA基因，得預(yù)期大小條帶，切膠回收后測(cè)序，分別得到1 431 bp、1 429 bp、1 425 bp和1 432 bp的基因序列。BLAST比對(duì)顯示， X-G1與殺鮭氣單胞菌無(wú)色亞種(HQ283362.1)、X-P2和X-P3與殺鮭氣單菌殺鮭亞種(KF751724.1)、X-P4與嗜水氣單胞菌(MG428972.1)的相似性最高，分別為99%、96%、99%和99%。綜合菌體形態(tài)、生理生化鑒定、16S rRNA基因序列和系統(tǒng)進(jìn)化分析(圖1)，可確定X-G1為殺鮭氣單胞菌無(wú)色亞種、X-P2和X-P3為殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種，且均為非典型殺鮭氣單胞菌；X-P4為嗜水氣單胞菌。

表1 菌株X-G1、X-P2、X-P3和X-P4的生理生化特征Tab.1 Biochemical and physiological characteristics of strains X-G1，X-P2，X-P3 and X-P4

注：“+”為陽(yáng)性，“-”為陰性。

圖1 基于16S rRNA基因構(gòu)建的 X-G1株，X-P2株，X-P3株和X-P4株系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree constructed based on 16S rRNA gene of X-G1，X-P2，X-P3 and X-P4

2.3 溫度對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響

殺鮭氣單胞菌X-G1、X-P2和X-P3在15 ℃的世代時(shí)間分別為14.2、13.9、14.1 min，均小于嗜水氣單胞菌X-P4的世代時(shí)間20.2 min；而在25 ℃培養(yǎng)時(shí)，殺鮭氣單胞菌X-G1、X-P2和X-P3的世代時(shí)間分別為20.2、19.6、20.9 min，均大于X-P4的世代時(shí)間15.5 min。

2.4 代表性毒力基因的檢測(cè)

對(duì)嗜溫氣單胞菌的10種代表性毒力基因檢測(cè)結(jié)果見圖2，殺鮭氣單胞菌無(wú)色亞種X-G1株可檢到彈性蛋白酶(ahyB)和溶血素(hlyA)；殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種X-P2株可檢到彈性蛋白酶(ahyB)；殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種X-P3株可檢測(cè)到彈性蛋白酶(ahyB)、溶血素(hlyA)、細(xì)胞毒性腸毒素(Act)、絲氨酸蛋白酶(Ser)、酯酶(Lip)和氣溶素(aerA)；嗜水氣單胞菌X-P4株可檢到鞭毛(Fla)、彈性蛋白酶(ahyB)、氣溶素(aerA)、細(xì)胞毒性腸毒素(Act)、熱不穩(wěn)定性腸毒素(Alt)、絲氨酸蛋白酶(Ser)和溶血素(hlyA)。對(duì)嗜冷氣單胞菌的2種代表性毒力基因檢測(cè)見圖3， 殺鮭氣單胞菌無(wú)色亞種X-G1株和殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種X-P3株都可檢測(cè)到甘油磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(GCAT)。4個(gè)分離菌株所攜帶的毒力基因不同(表2)。

圖2 X-G1、X-P2、X-P3和X-P4分離株毒力基因的PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.2 PCR amplification of virulence genes of X-G1，X-P2，X-P3 and X-P4M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1：核酶；2：鞭毛；3：彈性蛋白酶；4：溶血素；5：細(xì)胞毒性腸毒素；6：熱不穩(wěn)定性腸毒素；7：熱穩(wěn)定性腸毒素；8：絲氨酸蛋白酶；9：酯酶；10：氣溶素；

圖3 X-G1、X-P2和X-P3分離株毒力基因的PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.3 PCR amplification of virulence genes of X-G1，X-P2 and X-P3M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1：毒力陣列蛋白基因2：甘油磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶

菌株嗜冷氣單胞菌毒力基因嗜溫氣單胞菌毒力基因殺鮭氣單胞菌無(wú)色亞種X-G1株GCATahyB、hlyA殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種X-P2株—ahyB殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種X-P3株GCATahyB、hlyA、Act、aerA、Ser、Lip嗜水氣單胞菌X-P4株 /ahyB、hlyA、Act、aerA、Ser、Fla、Alt

注：“—”表示未檢測(cè)到嗜冷氣單胞菌毒力基因；“/”示未進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)

2.5 動(dòng)物回歸感染試驗(yàn)

表3 水溫對(duì)分離菌株的半數(shù)致死濃度(LD50)的影響Tab.3 Effect of water temperature on the lethal concentration 50% of isolated strains CFU/g

表4 分離株混合感染對(duì)死亡率的影響Tab.4 Effect of co-infection on the mortality rate of the isolated strains %

2.6 抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)

紙片法和肉湯稀釋法的藥敏試驗(yàn)均顯示分離株對(duì)多西環(huán)素、恩諾沙星、氟苯尼考敏感(表5和表6)。

表5 抗菌藥物對(duì)分離菌株的抑菌效應(yīng) Tab.5 Antibacterial effect of antibiotics on the isolated strains

表6 抗菌藥物對(duì)分離菌株的最小抑菌濃度 Tab.6 Minimum inhibitory concentration of antibiotics on the isolated strains μg/mL

2.7 治療情況

介入診斷和治療時(shí)，大部分患病魚體表有創(chuàng)傷、潰爛、出血，并繼發(fā)水霉感染，從口腔到肛門均已經(jīng)發(fā)生嚴(yán)重的潰瘍。全池潑灑過碘制劑、水霉治療劑等外用藥。內(nèi)服使用恩諾沙星等藥餌，但病魚對(duì)正常飼料和藥餌都已經(jīng)喪失食欲。最終，本病例治療以失敗告終。

3 討論

致病菌攜帶的毒力基因可能與其致病特性有關(guān)聯(lián)[13,14]。本研究中的4個(gè)分離菌株所攜帶毒力基因譜存在差異，且這3株非典型殺鮭氣單胞菌不同程度地?cái)y帶有嗜溫氣單胞菌的代表性毒力基因。這與李紹戊等[14]從潰爛懷頭鯰分離的維氏氣單胞菌、殺鮭氣單胞菌和嗜水氣單胞菌的研究結(jié)果類似。非典型殺鮭氣單胞菌攜帶嗜溫氣單胞菌的某些毒力基因，可能與這些菌株的適應(yīng)溫度或宿主范圍擴(kuò)大有關(guān)[17]。

本研究治療以失敗告終，最后四個(gè)發(fā)病塘死亡率均為100%。綜合分析可知，患魚上一年的11月已發(fā)生該病，初步治療且水溫下降后，病情表面緩解，但大部分病魚體內(nèi)病菌并未徹底清除。第二年3月中旬，水溫上升，嗜冷性的殺鮭氣單胞菌又開始大量生長(zhǎng)繁殖。3月18日現(xiàn)場(chǎng)診斷時(shí)，大部分魚的體表、鰭條、口腔和消化道均潰爛；而這時(shí)水溫較低(15.5 ℃)，即使健康魚的食欲也很差，而感染魚也因?yàn)檠装Y性厭食而不能攝食。因此，病魚無(wú)法攝入敏感抗菌藥物是本病治療失敗的重要原因。3月27日采樣分離鑒定細(xì)菌時(shí)，水溫已經(jīng)上升到24.5℃，達(dá)到了嗜溫性嗜水氣單胞菌生長(zhǎng)的適應(yīng)宜溫度，進(jìn)一步加劇了患魚的損傷和死亡。因此，由嗜冷性的殺鮭氣單胞菌和嗜溫性的嗜水氣單胞菌在低溫期到高溫期過渡階段引起的混合感染，應(yīng)該引起充分重視。筆者在病史調(diào)查中了解到，該池魚沒有拉網(wǎng)或并池。最值得懷疑的發(fā)病誘因有兩點(diǎn)，一是年前魚價(jià)低，養(yǎng)殖戶使用了品質(zhì)不好的飼料且停食過早；其次，上一年11月份病魚患潰爛癥后，沒有徹底治療好。越冬期魚體質(zhì)弱且?guī)Ь蕉?，可能是本病開春暴發(fā)的原因。因此，筆者建議在上一年的秋冬季節(jié)，晚停食且使用優(yōu)質(zhì)飼料，第二年春季要早開食。如果上一年的秋冬季節(jié)，魚發(fā)生潰爛癥，一定要徹底治療，不為第二年開春后的疾病暴發(fā)埋下隱患。