王海燕,樊曉麗,林植華

(1.浙江農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，杭州 311300；2.麗水學(xué)院生態(tài)學(xué)院，浙江麗水 323000)

β-胡蘿卜素(β-carotene)是一種廣泛存在于自然界中的有色物質(zhì)，作為動(dòng)物體內(nèi)的脂溶性抗氧化劑，是動(dòng)物體內(nèi)關(guān)鍵調(diào)節(jié)信號(hào)因子，在動(dòng)物體內(nèi)具有重要的生物學(xué)功能[1-2]。近年來，許多學(xué)者研究飼料中添加類胡蘿卜素對(duì)動(dòng)物養(yǎng)殖的影響。Horak等[3]研究表明添加10 μg/mL類胡蘿卜素，顯著增加金翅雀(Carduelischloris)體重。Simons等[4]研究表明鳥類體內(nèi)類胡蘿卜素濃度增加，抗氧化能力顯著提高。McCartney等[5]研究表明增加變色蜥蜴幼體(Chamaeleocalyptratus)類胡蘿卜攝入量，將促進(jìn)幼體生長(zhǎng)和免疫系統(tǒng)的發(fā)展。Pike等[6]研究表明飼料中添加200 μg/g類胡蘿卜素提高了三刺魚(Gasterosteusaculeatus)繁殖能力。因此，β-胡蘿卜素在動(dòng)物養(yǎng)殖中有廣闊的應(yīng)用前景[1]。

鎮(zhèn)海林蛙(Ranazhenhaiensis)隸屬于兩棲綱(Amphibian)無尾目(Anura)，在干旱性季節(jié)(1-4 月)進(jìn)行繁殖，其蝌蚪常見于低洼、溝渠和臨時(shí)水體[7]，關(guān)于鎮(zhèn)海林蛙的研究主要集中在生態(tài)地理分布[8-9]、毒理學(xué)[10]和孵化條件[11]等方面。本研究以鎮(zhèn)海林蛙蝌蚪為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，在基礎(chǔ)飼料中添加不同濃度的β-胡蘿卜素，研究其對(duì)鎮(zhèn)海林蛙蝌蚪生長(zhǎng)性能的影響，確定飼料中β-胡蘿卜素的最適添加量，為其在蛙類養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的應(yīng)用提供一定的基礎(chǔ)理論數(shù)據(jù)，也為蛙類資源的保護(hù)、開發(fā)和利用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

2018年12月20日，從麗水學(xué)院校園內(nèi)撈取12窩鎮(zhèn)海林蛙卵團(tuán)，置于人工氣候室(溫度21 ℃，光周期14 L∶10 D)12個(gè)塑料箱(50 cm×30 cm×20 cm，水深8 cm)中，放入曝氣水，孵化出膜后發(fā)育至Gosner25～26[12](參考Gosner對(duì)蝌蚪發(fā)育歷期的鑒定)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)開始前，鎮(zhèn)海林蛙蝌蚪的初始體重為(37.12±0.51)mg，體長(zhǎng)為(5.66±0.03)mm，尾長(zhǎng)為(10.84±0.05)mm。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 飼料制備

在基礎(chǔ)飼料粉末(黑斑蛙蝌蚪專用飼料，購(gòu)買于廈門市殷海飼料有限公司，產(chǎn)品分析保證值為粗蛋白含量≥40.0%，粗脂肪≥3.0%，水分≤10.0%，鈣≤4.0%，賴氨酸≥2.2%，粗纖維≤6.0%，粗總灰分≤16.0%，總磷≤1.3%，使用粉碎機(jī)粉碎后，分別添加β-胡蘿卜素粉末(β-胡蘿卜素濃度為98%，西安百川生物科技有限公司)混合，通過過篩(50目)20次，混合均勻，密封儲(chǔ)存在-4 ℃的冰箱中備用。

1.2.2 試驗(yàn)分組及飼養(yǎng)

2019年1月8日，隨機(jī)撈取288尾蝌蚪均分到4實(shí)驗(yàn)組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)組24尾蝌蚪(1組：50 mg/kg β-胡蘿卜素；2組：500 mg/kg β-胡蘿卜素；3組：1 200 mg/kg β-胡蘿卜素；4組：基礎(chǔ)飼料)[13]。試驗(yàn)飼料中添加β-胡蘿卜素的實(shí)測(cè)濃度為：1組0.005%；2組：0.053%；3組：0.128%；4組不含β-胡蘿卜素。整個(gè)試驗(yàn)過程，蝌蚪飼養(yǎng)在塑料箱(32 cm× 21 cm×10 cm，水深7 cm)中，置于人工氣候室內(nèi)(溫度21 ℃，光周期14 L∶10 D)，每2 d喂養(yǎng)足量飼料粉末(喂至蝌蚪停止進(jìn)食)。

1.3 鎮(zhèn)海林蛙蝌蚪和幼蛙形態(tài)測(cè)定

在蝌蚪生長(zhǎng)1 d和19 d時(shí)，每個(gè)處理水平的3個(gè)重復(fù)組，隨機(jī)挑選4只蝌蚪，用電子分析天平(精確度±0.000 1 g)稱取其體重，通過Nikon XTS30解剖顯微鏡鑒定蝌蚪初期和中期的發(fā)育歷期[12]，同時(shí)測(cè)定蝌蚪的體長(zhǎng)和尾長(zhǎng)[14]。當(dāng)蝌蚪出現(xiàn)前肢(Gosner 42)時(shí)則認(rèn)定達(dá)到變態(tài)，并記錄每只變態(tài)時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)蝌蚪變態(tài)時(shí)間為40～54 d，蝌蚪的尾部完全消失，即完全變態(tài)(Gosner 46)。

將每只完全變態(tài)幼蛙撈出，用吸水紙吸干體表水分后，用電子分析天平稱取其濕重(±0.000 1 g)，分別用數(shù)顯游標(biāo)卡尺(±0.01 mm)測(cè)定其體長(zhǎng)、頭長(zhǎng)、前臂及手長(zhǎng)和后肢長(zhǎng)。

1.4 鎮(zhèn)海林蛙幼蛙跳躍距離的測(cè)定

將每只完成變態(tài)的幼蛙撈出，分別對(duì)幼蛙運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)進(jìn)行測(cè)定。先將幼蛙置于室內(nèi)(21 ℃)適應(yīng)10 min，然后將其放入1%的紅色食用色素溶液中浸濕四肢，取出置于鋪有白色紗布的地面上，使用枝條輕觸其尾桿骨來刺激其跳躍，測(cè)量跳躍距離(上一個(gè)后肢印跡的末端到下一個(gè)后肢印跡的末端之間的距離)，每只幼蛙重復(fù)5次。用直尺測(cè)量出最長(zhǎng)三次的跳躍距離(±0.01 cm)，取其平均值。

1.5 幼蛙肝臟酶活測(cè)定

從每個(gè)塑料箱中分別取4只幼蛙用于總超氧化物歧化酶(T-SOD)活力和過氧化氫酶(CAT)活力的檢測(cè)。幼蛙迅速處死后取肝臟組織，進(jìn)行稱重，置于-80 ℃冰箱保存。實(shí)驗(yàn)時(shí)，取出肝臟樣品融化解凍，用預(yù)冷任氏液沖洗3次，立即用濾紙吸干其表面水分，按照濕重(g)∶體積(mL)=1∶9的比例加入預(yù)冷任氏液，在冰浴中快速剪碎研磨制備10%的肝臟組織勻漿，低速離心10 min(3 000 r/min)，取上清液。用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。T-SOD和CAT活力檢測(cè)參見試劑盒說明書，實(shí)驗(yàn)試劑購(gòu)買于南京建成生物工程技術(shù)研究所。使用紫外分光光度計(jì)(UV-2550，日本島津公司)測(cè)定T-SOD活力和CAT活力。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

用Statistica10.0統(tǒng)計(jì)軟件包完成所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。使用方差分析和多重比較相應(yīng)的數(shù)據(jù)。描述性統(tǒng)計(jì)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，顯著性水平設(shè)置為α=0.05，不具相同字母上標(biāo)的不同β-胡蘿卜素濃度處理組和對(duì)照組間差異顯著，且a>b>c>d。

試驗(yàn)所用的計(jì)算公式如下：

變態(tài)率=Nf/Ni×100%；

增重率=(Wt-W0)/W0×100%；

特定生長(zhǎng)率=(lnWt-lnW0)/d×100%。

式中Nf為終末變態(tài)尾數(shù)；Ni為初始尾數(shù)；Wt為終末體重；W0為初始體重；d為投喂天數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 飼料β-胡蘿卜素水平對(duì)鎮(zhèn)海林蛙蝌蚪發(fā)育中期的歷期和形態(tài)的影響

方差分析表明，蝌蚪的中期(第19天)發(fā)育歷期組間差異顯著，對(duì)照組的發(fā)育歷期顯著大于50和500 mg/kg處理組。β-胡蘿卜素處理組中500 mg/kg處理組與其它3組差異不顯著，合并β-胡蘿卜素處理組發(fā)育數(shù)據(jù)，顯著低于對(duì)照組。中期體重、體長(zhǎng)和尾長(zhǎng)組間差異不顯著(表1)。

2.2 飼料β-胡蘿卜素水平對(duì)鎮(zhèn)海林蛙蝌蚪生長(zhǎng)指標(biāo)的影響

如表2所示，實(shí)驗(yàn)組間的蝌蚪的增重率、特定生長(zhǎng)率、變態(tài)率組間差異均不顯著。變態(tài)時(shí)間組間差異顯著，隨著β-胡蘿卜素處理濃度的增加而變態(tài)時(shí)間縮短，對(duì)照組時(shí)間最短。

表1 飼料β-胡蘿卜素水平對(duì)第19天鎮(zhèn)海林蛙蝌蚪生長(zhǎng)的影響Tab.1 The effects of β-carotene level on the growth development of R.zhenhaiensis tadpoles on day 19

表2 飼料β-胡蘿卜素水平對(duì)鎮(zhèn)海林蛙蝌蚪生長(zhǎng)指標(biāo)的影響Tab.2 The effects of β-carotene level on the growth indexes of R.zhenhaiensis tadpoles

2.3 飼料β-胡蘿卜素水平對(duì)鎮(zhèn)海林蛙幼蛙形態(tài)和運(yùn)動(dòng)的影響

β-胡蘿卜素對(duì)幼蛙體長(zhǎng)、頭長(zhǎng)、前臂及手長(zhǎng)和后肢長(zhǎng)影響顯著(表3)，對(duì)照組個(gè)體的形態(tài)指標(biāo)最小，β-胡蘿卜素處理組隨著濃度增加而呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)。幼蛙體重組間差異不顯著。平均跳躍距離差異顯著，β-胡蘿卜素500 mg/kg處理組幼蛙平均跳躍距離顯著大于1 200 mg/kg處理組和對(duì)照組個(gè)體，50 mg/kg處理組與其它組間差異不顯著。

表3 飼料β-胡蘿卜素水平對(duì)鎮(zhèn)海林蛙幼蛙形態(tài)和運(yùn)動(dòng)的影響Tab.3 The effects of β-carotene level on the form and motor performance of froglets of R.zhenhaiensis

2.4 飼料β-胡蘿卜素水平對(duì)鎮(zhèn)海林蛙幼蛙肝臟酶活的影響

如圖1所示幼蛙的CAT活力差異顯著，50 mg/kg β-胡蘿卜素處理組個(gè)體酶活顯著大于其它處理組，但是肝臟T-SOD活力差異不顯著。

3 討論

3.1 飼料β-胡蘿卜素水平對(duì)鎮(zhèn)海林蛙蝌蚪中期發(fā)育的歷期和形態(tài)的影響

Szuroczki等[15]研究表明添加500 mg/kg類胡蘿卜素處理組北方豹蛙(Lithobatespipiens)蝌蚪體重顯著大于其它處理組，但是發(fā)育歷期無顯著差異。

圖1 飼料β-胡蘿卜素水平對(duì)鎮(zhèn)海林蛙幼蛙肝臟抗氧化酶活力的影響Fig.1 The effects of feed β-carotene level on activity of two antioxidant enzymes on R.zhenhaiensis froglets liver

Ogilvy等[16]在熱帶爪蟾(Siluranatropicalis)使用10 mg/g類胡蘿卜素飼料處理組蝌蚪發(fā)育歷期、體重和體長(zhǎng)均顯著大于對(duì)照組。本研究結(jié)果顯示，添加50和1 200 mg/kg β-胡蘿卜素處理組蝌蚪發(fā)育歷期小于對(duì)照組和500 mg/kg β-胡蘿卜素處理組，但是體重、體長(zhǎng)和尾長(zhǎng)則無差異，這與已有的研究結(jié)果不同。分析可能是棲息地(例如食物條件)的差異導(dǎo)致母體中類胡蘿卜素含量差異，從而影響卵中類胡蘿卜素含量，若母體自身胡蘿卜素含量較高，則會(huì)減少蝌蚪生長(zhǎng)初期對(duì)外源類胡蘿卜素依賴[17]。

3.2 飼料β-胡蘿卜素水平對(duì)鎮(zhèn)海林蛙蝌蚪生長(zhǎng)指標(biāo)的影響

本研究結(jié)果顯示蝌蚪的變態(tài)率和完成變態(tài)時(shí)的增重率、特定生長(zhǎng)率組間差異均不顯著，β-胡蘿卜素處理組的變態(tài)時(shí)間大于對(duì)照組且隨著濃度增加變態(tài)時(shí)間縮短，而對(duì)照組最短。Keogh等[18]的結(jié)果顯示，添加1 mg/g胡蘿卜素處理組的布羅雨濱蛙(Litoriabooroolongensis)生長(zhǎng)速度快于其它處理組，但是對(duì)于變態(tài)率和變態(tài)時(shí)間則無影響。Cothran等[19]發(fā)現(xiàn)添加10 mg/g類胡蘿卜素飼料對(duì)樹蛙(Lithobatessylvaticus)變態(tài)率無影響，但使灰樹蛙(Hylaversicolor)變態(tài)率下降20%，蝌蚪的生長(zhǎng)速度減緩，變態(tài)時(shí)間均延長(zhǎng)。水棲的兩棲動(dòng)物幼體受到甲狀腺激素精密調(diào)控進(jìn)行變態(tài)，甲狀腺激素水平達(dá)到峰值的時(shí)間越短，蝌蚪越快完成變態(tài)[20]。胡蘿卜素可以顯著延長(zhǎng)變態(tài)時(shí)間，其機(jī)制可能是胡蘿卜素減緩了甲狀腺的發(fā)育，延緩甲狀腺激素達(dá)到峰值的時(shí)間，延長(zhǎng)蝌蚪完成變態(tài)時(shí)間[21],更易積累較多的能量進(jìn)行生長(zhǎng)發(fā)育，形成更大的個(gè)體。

變態(tài)時(shí)的幼蛙體形大小會(huì)影響之后的生長(zhǎng)和繁殖，如運(yùn)動(dòng)能力、性成熟時(shí)間以及繁殖成功率等[22]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明完成變態(tài)的幼蛙個(gè)體大小與對(duì)照組相比更大(體長(zhǎng)、頭長(zhǎng)、前肢、后肢)，這與之前的研究相同。Ogilvy等[16]研究表明使用0.1 mg/g類胡蘿卜素濃度飼料紅眼樹蛙(Agalychniscallidryas)蝌蚪完成變態(tài)時(shí)體長(zhǎng)和體重顯著大于對(duì)照組。適宜條件下，蝌蚪發(fā)育時(shí)間較長(zhǎng)，積累能量較多，個(gè)體的適合度增加[23]。

3.3 飼料β-胡蘿卜素水平對(duì)鎮(zhèn)海林蛙幼蛙運(yùn)動(dòng)性能的影響

類胡蘿卜素是維生素A的前體，一分子的β-胡蘿卜素能夠分解為兩分子的維生素A，在維持正常視覺、維持細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、骨骼發(fā)育等方面發(fā)揮重要作用[16]。β-胡蘿卜素長(zhǎng)期添加可能促進(jìn)蝌蚪骨骼的生長(zhǎng)，體長(zhǎng)、頭長(zhǎng)、前臂及手和后肢長(zhǎng)度的提高將利于鎮(zhèn)海林蛙幼蛙登陸后對(duì)身體的支撐以及跳躍能力[23]。Mcinerney等[24]研究結(jié)果表明，使用添加胡蘿卜素飼料的個(gè)體，在長(zhǎng)距離的游泳表現(xiàn)和陸地逃離捕食者實(shí)驗(yàn)中，其運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)均得到了加強(qiáng)。本研究顯示長(zhǎng)期攝食富含β-胡蘿卜素飼料可以增強(qiáng)鎮(zhèn)海林蛙幼蛙的跳躍能力，與上述研究結(jié)果相似。

3.4 飼料β-胡蘿卜素水平對(duì)鎮(zhèn)海林蛙幼蛙肝臟酶活的影響