李文艷，張娜, 李曉寧，劉純甫，梁子騰，仲飛，管越強

(1．河北大學 基礎醫(yī)學院，河北 保定 071002； 2． 河北農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，河北 保定 071000；3．河北大學 生命科學學院，河北 保定 071002；4．河北大學 公共衛(wèi)生學院，河北 保定 071002)

單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes，LM)是一種在自然界中廣泛分布的可寄生于宿主細胞內外的人獸共患病原菌，嚴重感染時可造成妊娠動物和孕婦流產(chǎn)[1-2]，但其作用機理尚不清楚.研究證實，妊娠過程中母胎界面存在由多種細胞和細胞因子構成的網(wǎng)絡，網(wǎng)絡的動態(tài)平衡是妊娠得以成功的必要條件[3-5]，其中Th1和Th2 型細胞因子的動態(tài)平衡起著重要的作用[4-5].Th1細胞因子可激活細胞免疫和炎癥的發(fā)生，促進免疫殺傷，不利于妊娠的進行，主要包括白細胞介素-2(interleukin, IL-2) 、IFN-γ和TNF-α等，Th2細胞因子介導B細胞增殖和抗體的產(chǎn)生，有利于妊娠的進行，主要包括IL-4 、IL-6 和IL-10等[5].正常妊娠應是Th2 細胞因子占優(yōu)勢，并且Th1和Th2細胞因子維持在動態(tài)平衡的狀態(tài)，一旦這種平衡被破壞，就可能導致流產(chǎn)的發(fā)生[5].LM致小鼠流產(chǎn)是否與母胎界面Th1和Th2細胞因子失衡有關，目前尚不清楚.因此，本實驗分別用野生型(wild type，WT)和重要毒力因子溶血素O (listeriolysin O，LLO)基因缺陷型(Δhly)菌株感染妊娠小鼠和小鼠巨噬細胞，統(tǒng)計其胚胎存活率，檢測母胎界面和巨噬細胞培養(yǎng)基中Th1和Th2細胞因子的表達水平，探討母胎界面免疫失衡在LM致小鼠流產(chǎn)中的作用，為臨床LM致流產(chǎn)的防治提供科學依據(jù).

1 材料與方法

1.1 菌株和實驗動物

LM菌株和小鼠巨噬細胞系B6分別由Kyoto大學醫(yī)學研究科Masao Mitsuyama博士和Massachusetts大學醫(yī)學院Katherine Fitzgerald教授惠贈，ICR小鼠購自北京實驗動物中心.

1.2 主要試劑

小鼠IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10 ELISA 試劑盒為武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品；細菌培養(yǎng)所用的瓊脂和胰蛋白胨分別是Sigma和Oxoid公司產(chǎn)品；脫水牛心浸粉和腦浸粉為北京奧博星公司產(chǎn)品；細胞培養(yǎng)所用的DMEM培養(yǎng)基購自Gibco BRL公司；胎牛血清為索萊寶公司產(chǎn)品.

1.3 動物處理

挑選6周齡發(fā)情母鼠與正常公鼠1∶1合籠，次日清晨挑取妊娠小鼠隨機分組，每組8只，共7組，其中6個實驗組和1個對照組，妊娠第6.5天，對照組尾靜脈注射0.2 mL磷酸鹽緩沖液，實驗組分別尾靜脈注射0.2 mL的LM/WT或ΔhlyLM 菌懸液，最終注射劑量為5×104、5×105、5×106CFU/只，分別代表低、中、高3種不同劑量. 3 d后小鼠頸椎脫臼處死，解剖后統(tǒng)計小鼠胚胎存活率，取子宮角加入到組織裂解液中裂解，離心取上清液用于細胞因子的檢測.

1.4 LM對巨噬細胞的感染

將小鼠巨噬細胞B6接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，分成3組：對照組、LM/WT感染組和ΔhlyLM 感染組，對照組加入基礎培養(yǎng)基，2個感染組分別加入含LM/WT或ΔhlyLM的基礎培養(yǎng)基(2種LM與細胞的感染比均為40∶1)，在37 ℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min，再用含50 μg/mL慶大霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)1 h以殺死細胞外的細菌，最后用V-15培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，收集培養(yǎng)基，離心取上清液用于細胞因子的檢測.

1.5 胚胎存活率的計算

按下列公式計算各實驗組的胚胎存活率：

胚胎存活率=正常胚胎數(shù)/(被吸收的胚胎數(shù)+正常胚胎數(shù))×100%.

1.6 組織和培養(yǎng)基中細胞因子的測定

采用酶聯(lián)免疫分析試劑盒對子宮組織和巨噬細胞培養(yǎng)基中的細胞因子進行測定：按照試劑盒說明書操作，反應終止后，在酶聯(lián)免疫檢測儀上讀取450 nm波長下的OD值，繪制標準曲線，計算各種細胞因子的含量.

1.7 統(tǒng)計分析

使用SPSS17.0軟件的單因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan多重比較進行統(tǒng)計分析.

2 實驗結果

2.1 LM對小鼠胚胎存活率的影響

LM/WT和ΔhlyLM感染妊娠小鼠后統(tǒng)計小鼠胚胎存活率，結果如圖1所示.與對照組相比，LM/WT感染組小鼠胚胎存活率顯著下降，并且隨著感染劑量的增加胚胎存活率降低；ΔhlyLM感染組與對照組相比，高、中、低劑量組胚胎存活率均沒有明顯變化，說明LM可誘導小鼠流產(chǎn)的發(fā)生，并且LLO在其中發(fā)揮著重要的作用.

*代表與對照組相比差異顯著(P<0.05)；**代表與對照組相比差異極顯著(P<0.01)；代表感染劑量由低到高依次為低、中、高劑量組.

2.2 LM對妊娠小鼠子宮中Th1和Th2細胞因子的影響

為探討LM誘導的小鼠流產(chǎn)是否與母胎界面Th1和Th2細胞因子失衡有關，檢測了LM/WT和ΔhlyLM感染后小鼠子宮組織中主要Th1和Th2細胞因子水平. Th1細胞因子檢測結果顯示(圖2)，無論是高劑量還是低劑量LM/WT感染的妊娠小鼠，子宮組織中IL-2和IFN-γ水平都顯著高于對照組(P<0.05)，并且與感染劑量呈正相關，而ΔhlyLM感染妊娠小鼠后，與對照組相比，各個感染組子宮中IFN-γ和IL-2含量無顯著差異(P>0.05)，即LM/WT在誘導妊娠小鼠流產(chǎn)的同時也誘導了子宮中IFN-γ和IL-2含量的增加，ΔhlyLM沒有誘導妊娠小鼠流產(chǎn)的同時也沒有誘導子宮中IFN-γ和IL-2含量的增加，說明LM誘導的小鼠流產(chǎn)與其誘導的母胎界面Th1細胞因子增加相關，而LLO在其中發(fā)揮著重要作用.

*代表與對照組相比差異顯著(P<0.05)；代表感染劑量由低到高依次為低、中、高劑量組.

Th2細胞因子檢測結果顯示(圖3)，與對照組相比，無論是感染LM/WT還是ΔhlyLM后的小鼠子宮中IL-4水平均升高而IL-10水平均降低，但是差異都不顯著(P>0.05)，說明LM/WT和ΔhlyLM感染均沒有誘導Th2細胞因子(IL-4，IL-10)發(fā)生顯著變化.

代表感染劑量由低到高依次為低、中、高劑量組.

2.3 LM對小鼠巨噬細胞分泌Th1和Th2細胞因子的影響

巨噬細胞是母胎界面主要的免疫細胞，為了檢測巨噬細胞是否參與了母胎界面Th1和Th2型細胞因子的變化，用LM感染小鼠巨噬細胞B6后，ELISA檢測培養(yǎng)基中Th1和Th2細胞因子的水平.

Th1型細胞因子檢測結果顯示(圖4a,b)，LM/WT感染組培養(yǎng)基中IL-2和IFN-γ的水平都高于對照組，且差異極顯著(P<0.01)；ΔhlyLM感染組和對照組相比沒有顯著差異.Th2細胞因子檢測結果顯示(圖4 c,d)，與對照組相比，LM/WT感染組培養(yǎng)基中IL-4水平明顯升高(P<0.05)，IL-10的水平明顯降低(P<0.05)；ΔhlyLM感染組培養(yǎng)基中IL-4和IL-10水平與對照組相比沒有明顯變化.

*代表差異顯著(P<0.05)；** 代表差異極顯著(P<0.01)；NS代表無顯著性差異(P>0.05).

3 討論

LM感染可引發(fā)人和動物流產(chǎn)，其對人類生殖健康和畜牧養(yǎng)殖業(yè)的影響不容忽視，但LM致流產(chǎn)的機制尚不清楚.妊娠過程中母胎界面Th1/Th2細胞因子的平衡是維持妊娠正常進行的保證，Th1/Th2細胞因子失衡是妊娠失敗的一個重要原因[6-8].因此，本研究通過分析LM感染后妊娠小鼠胚胎存活率與子宮中Th1和Th2細胞因子的相關性探討了Th1和Th2細胞因子的變化在LM致流產(chǎn)中的作用.

LM感染妊娠動物后個別Th1或Th2細胞因子表達發(fā)生變化已有一些報道[9-11]，但是多種Th1和Th2細胞因子綜合在一起進行免疫動態(tài)平衡的分析還未見報道，因此本實驗通過檢測LM誘導的流產(chǎn)小鼠子宮中4種有代表性的Th1和Th2細胞因子水平綜合來探討Th1/Th2細胞因子平衡與妊娠的關系.結果表明，LM感染妊娠小鼠誘導了流產(chǎn)小鼠母胎界面主要Th1細胞因子水平的升高，從而誘導Thl與Th2型細胞因子的平衡偏向Th1型，過量的 Th1 型細胞因子一方面降低保護性的Th1抗胞內感染的應答，導致感染不愈，另一方面進一步激活NK 細胞和巨噬細胞，使其產(chǎn)生更多的 Th1 型細胞因子和炎癥介質，加重對胚胎的傷害，從而危及妊娠[5,7-8].

在妊娠過程中，母胎界面的巨噬細胞作為一種免疫細胞參與妊娠的建立和維持局部免疫反應，在整個妊娠中維持較高水平，在妊娠早期占子宮蛻膜免疫細胞總數(shù)的30%～35%，并且隨著妊娠的發(fā)展逐漸增加[12]，推測它分泌的細胞因子與其他免疫細胞分泌的細胞因子一起影響著妊娠結果.因此，在體內實驗的基礎上，檢測了LM感染對小鼠巨噬細胞分泌的Thl和Th2型細胞因子水平的影響，結果顯示LM感染誘導了小鼠巨噬細胞的Thl型細胞因子水平明顯升高，使細胞外Thl/Th2細胞因子的平衡偏向Th1型，與體內實驗結果基本一致，說明巨噬細胞分泌的細胞因子在LM誘導的母胎界面Th1/Th2細胞因子失衡中發(fā)揮著重要的作用.

已知LM在感染宿主細胞的過程中，毒力因子LLO發(fā)揮著重要的作用[13].為了驗證LLO在LM致流產(chǎn)中的作用，分別用LM/WT和ΔhlyLM感染妊娠小鼠和巨噬細胞，結果發(fā)現(xiàn)，ΔhlyLM沒有誘導小鼠流產(chǎn)的發(fā)生，同時沒有改變母胎界面Thl/Th2型細胞因子的平衡，說明LLO在LM誘導流產(chǎn)小鼠母胎界面Thl/Th2細胞因子失衡過程中發(fā)揮著重要的作用.

綜上，LM通過LLO誘導的小鼠流產(chǎn)與母胎界面Th1/Th2細胞因子失衡相關，其中巨噬細胞分泌的細胞因子水平的改變在這種失衡中發(fā)揮著重要的作用.