馬 壘 郭志彬 王道中 趙炳梓

（1 土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點實驗室（中國科學(xué)院南京土壤研究所），南京 210008）

（2 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所，合肥 230031）

（3 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中，磷素是作物生長發(fā)育中僅次于氮素的第二重要養(yǎng)分。砂姜黑土占淮北平原耕地面積的2/3，土壤中磷含量及有效性不足，嚴重制約著砂姜黑土區(qū)農(nóng)作物生產(chǎn)，是典型的中低產(chǎn)田[1]。施用磷肥是提高作物產(chǎn)量和提升土壤肥力的重要農(nóng)業(yè)措施，前人對砂姜黑土長期定位試驗進行了大量研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)長期施用磷肥可明顯提高作物產(chǎn)量、養(yǎng)分含量和土壤酶活性[2-5]。但是農(nóng)民基于經(jīng)濟因素，磷肥的施用并非全部足量，存在不同磷肥施用梯度[6]。然而在砂姜黑土區(qū)關(guān)于不同磷肥施用梯度對土壤養(yǎng)分和作物產(chǎn)量尚未展開系統(tǒng)研究。

土壤微生物是農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，在維持生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定性中發(fā)揮重要作用，其在土壤養(yǎng)分循環(huán)、有機質(zhì)降解、團聚體形成等生物化學(xué)過程中均扮演著重要角色[7]。然而關(guān)于施用磷肥對微生物群落影響的研究并沒有一致的結(jié)論。一些研究表明施用磷肥可提高土壤有效磷含量從而改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和組成并會促進某些特定微生物的生長[8]。比如Tan 等[9]經(jīng)過42年不同磷肥施用梯度（不施磷肥、P2O515 kg·hm-2和P2O530 kg·hm-2）處理后，發(fā)現(xiàn)隨著磷肥施用量的增加，土壤細菌多樣性以及土壤中溶磷細菌的相對豐度也隨之增加，但酸桿菌門（Acidobacteria）和假單胞菌屬（Pseudomonas）等細菌相對豐度則隨之降低。研究者認為磷肥施入土壤后可通過增加養(yǎng)分有效性、改變土壤pH 和滲透勢等多種途徑影響土壤微生物[10]；然而還有一些研究發(fā)現(xiàn)長期施用磷肥對土壤微生物群落的影響很小。比如Shi 等[11]發(fā)現(xiàn)經(jīng)過17年不同磷肥施用梯度（不施磷肥、P2O517.5 kg·hm-2和P2O535 kg·hm-2）后，土壤細菌群落結(jié)構(gòu)并未發(fā)生顯著改變。這些研究者認為雖然土壤中有效磷含量較低，但C 和N 仍為土壤微生物主要生長限制因素[12]。因此關(guān)于施用磷肥對土壤微生物群落影響機制仍存在著廣泛的不確定性[13]。

本研究以典型砂姜黑土區(qū)—安徽蒙城氮磷鉀肥肥效長期定位試驗為平臺，選取P0（不施磷肥）、P1（P2O545 kg·hm-2）和P2（P2O590 kg·hm-2）3 個磷肥施用梯度，采用現(xiàn)代高通量測序技術(shù)，測定經(jīng)過21年連續(xù)不同磷肥施用梯度后，土壤細菌多樣性及群落組成變化，以探索土壤細菌群落組成與土壤肥力指標及土壤酶活性的關(guān)系，為砂姜黑土區(qū)科學(xué)施用磷肥提供理論依據(jù)和科學(xué)支持。

1 材料與方法

1.1 長期試驗概況

田間長期肥料定位試驗始于1994年，位于農(nóng)業(yè)部蒙城砂姜黑土生態(tài)環(huán)境站內(nèi)（33°13′N， 116°35′E）。該地屬暖溫帶半濕潤季風(fēng)氣候，年均氣溫14.8℃，年均降水量872.4 mm。試驗共設(shè)置9 個處理，本研究選取其中3 個處理，即：（1）P0（不施磷肥）；（2）P1（P2O545 kg·hm-2）；（3）P2（P2O590 kg·hm-2）。除磷肥施用差異外，所有處理氮肥和鉀肥施用量一致，其中 N 187.5 kg·hm-2，K2O 135 kg·hm-2。氮肥為尿素，磷肥為普鈣，鉀肥為氯化鉀。小區(qū)面積19 m2，3 次重復(fù)，完全隨機區(qū)組設(shè)計。所有肥料均在小麥播種時一次基肥施入，后茬作物不施肥。試驗樣地1994—1998年為小麥玉米輪作，1998—2015年為小麥大豆輪作。

1.2 樣品采集

試驗樣品于2015年6月小麥成熟期時采集，即截止樣品采集時，各處理已經(jīng)歷總共21年不同施肥處理。按照S 采樣法，每個小區(qū)使用土鉆（直徑5 cm）采集9 份0～15 cm 表層土樣，混合成一個樣品。所有樣品置于冰袋中運回實驗室。土樣去除大的植物根系和石塊后過2 mm 篩。所有樣品分為三部分，一部分風(fēng)干后用于理化性質(zhì)測定，一部分置于4℃冰箱用于土壤酶活性的測定，另一部分置于-80℃用于DNA 提取。

1.3 土壤生化指標測定

土壤理化性質(zhì)均采用土壤常規(guī)分析方法[14]測定。土壤pH 按土水比1∶5（質(zhì)量體積比）充分混合后用pH 計測定；土壤有機碳（SOC）采用重鉻酸鉀氧化外加熱法測定；土壤全氮（TN）采用半微量開氏法測定；全磷（TP）和有效磷（AP）采用鉬銻抗比色法測定；可溶性有機碳（DOC）采用土水比1∶5（質(zhì)量體積比）充分振蕩30 min 后，上清液過0.45 μm 濾膜，濾液用有機碳分析儀測定；土壤硝態(tài)氮（NO-3-N）和銨態(tài)氮（NH+4-N）采用2 mol·L-1的KCl 提取，硝態(tài)氮采用雙波段比色法，銨態(tài)氮采用靛酚藍比色法測定。土壤酶活性[15]采用鮮土測定：β-葡糖苷酶采用對硝基酚比色法；蛋白酶采用絡(luò)氨酸比色法；酸性磷酸酶采用對硝基笨磷酸鹽法；脫氫酶活性測定參考Tabatabai[16]方法測定。土壤生化指標結(jié)果均以烘干土（105℃，24 h）為基準表達。

1.4 土壤DNA 提取及16S rRNA 基因高通量測序

土壤DNA 采用Fast DNA Spin Kit for Soil (MP Biomedicals，Santa Ana，CA，USA)試劑盒提取。每個樣品稱取0.50 g 鮮土，按照說明書操作提取DNA。

選取細菌 16S rRNA 基因的 V4-V5 區(qū)進行高通量測序測定。PCR 擴增采用特異性引物 515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′）/907R（5′-CC GTCAATTCMTTTRAGTTT-3′）。每個樣品前端引物均含有不同的7 bp Barcode 用于區(qū)分不同樣品。PCR擴增條件包括94℃ 5 min；90℃ 60 s，55℃ 60s， 72℃ 75 s，30 個循環(huán)，之后72℃ 10 min。反應(yīng)產(chǎn)物采用QIA quick PCR Purification kit （Qiagen）進行純化。將不同樣品的 PCR 擴增產(chǎn)物等摩爾混合后，采用Illumina 公司MiSeq 測序儀完成序列分析（委托上海派森諾生物科技股份有限公司測定）。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

高通量測序所得序列按照以下步驟進行分析：（1）雙端序列采用FLASH[17]進行拼接；（2）使用Cutadapt[18]切除引物；（3）采用QIIME（1.91）[19]去除質(zhì)量分數(shù)低于20，序列短于300 bp 的低質(zhì)量序列；（4）采用RDP[20]數(shù)據(jù)庫去除嵌合體；（5）得到的高質(zhì)量序列采用Uparse[21]軟件，以97%相似度進行OTU 劃分，采用Blast 方法以Greengeens13.8 數(shù)據(jù)庫為比對進行注釋。將未注釋到門水平及注釋為古菌的序列刪除后，所有樣品隨機抽取10 000 條序列進行后續(xù)分析。細菌香農(nóng)指數(shù)在QIIME 中計算?；贐ray-Curtis 距離的PCoA、CAP 和Adonis 分析均使用R 2.15.3 軟件的vegan 包進行。采用mvpart和MVPARTwrap 包進行多元回歸樹（MRT）分析。使用SPSS 22.0 軟件進行單因素方差分析，相關(guān)性分析采用Pearson 雙尾檢驗；平均值多重比較采用鄧肯新復(fù)檢驗法（Duncan's New Multiple Range Test）進行顯著性檢驗（P＜ 0.05）。采用Microsoft Excel 2007 和Origin 8.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理和繪圖。

2 結(jié) 果

2.1 長期施用磷肥對砂姜黑土理化性質(zhì)的影響

由表1可知經(jīng)過21年不同磷肥施用梯度后土壤理化性質(zhì)發(fā)生明顯變化。土壤有機碳、銨態(tài)氮和有效磷含量在P2 處理中顯著升高（P＜0.05），分別較P0 處理提高10.33%、79.49%和384.19%，較P1 處理提高7.65%、65.68%和98.42%。全磷、可溶性有機碳和碳氮比在不同處理間均按照P0＜P1＜P2 的順序升高，其中P2 和P1 處理全磷含量較P0 處理分別提高40.00%和12.90%，可溶性有機碳含量分別提高31.36%和13.63%，而碳氮比分別提高12.74%和8.54%。硝態(tài)氮、碳磷比和氮磷比在P0 處理中均顯著高于P1 和P2 處理，而在P1 和P2 處理間沒有顯著差異。本試驗條件下長期不同磷肥施用量對土壤pH 和TN 均沒有顯著影響（P＞0.05）。

2.2 長期施用磷肥對砂姜黑土酶活性的影響

為了檢驗施用磷肥對土壤微生物功能的影響，分別測量β-葡糖苷酶、蛋白酶、酸性磷酸酶和脫氫酶等4 種胞外酶活性（圖1）。隨著磷肥施用量增加，所測4 中酶活性均有增加的趨勢，但只有蛋白酶和脫氫酶活性在不同磷肥施用梯度間達到統(tǒng)計學(xué)上的差異顯著水平，P2 和P1 處理蛋白酶較P0 分別升高68.31%和 41.55%，脫氫酶分別升高 16.48%和4.39%；β-葡糖苷酶在P2 和P1 處理間差異不顯著，但分別較P0 高70.78%和51.22%；酸性磷酸酶在不同磷肥水平間均沒有達到差異顯著水平。

表1 三種磷肥施用梯度下砂姜黑土理化性質(zhì)的變化 Table1 Physico-chemical properties of the lime concretion black soil relative to P application rate

圖1 三種磷肥施用梯度下砂姜黑土酶活性的變化 Fig.1 Soil enzyme activities in the lime concretion black soil relative to P application rate

2.3 長期施用磷肥對砂姜黑土細菌多樣性的影響

對9 個樣品（3 個處理，每個處理3 個重復(fù)）進行MiSeq 高通量測序。經(jīng)過質(zhì)量控制，總共得到108 759 條高質(zhì)量序列（每個樣品10 187～15 169條序列）。以97%相似度與數(shù)據(jù)庫比對注釋后，共獲得655 個OTU，這些OTU 歸屬于228 個屬、188個科、120 個目、69 個科和23 個門。以香農(nóng)指數(shù)表征細菌群落多樣性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖2a），隨著磷肥的施入，細菌多樣性顯著升高；相關(guān)性分析（圖2b）表明細菌多樣性與 DOC 和 TP 均成顯著正相關(guān)（r=0.89，P=0.001；r=0.93，P=0.001），因此施用磷肥后DOC 和TP 含量的增加可能是導(dǎo)致細菌多樣性升高的主要原因。

2.4 土壤細菌群落組成及其與土壤性質(zhì)之間關(guān)系

長期不同磷肥施用梯度可導(dǎo)致細菌群落組成和結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化（圖3）。與前人研究結(jié)果類似[22]，變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和酸桿菌門（Acidobacteria）是砂姜黑土中的優(yōu)勢菌，其相對豐度分別為40.16%、19.75%和14.91%（圖3a）。其余相對豐度大于1%的門主要為綠彎菌門（Chloroflexi，7.20%）、浮霉菌門（Planctomycetes，6.65%）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes，2.73%）、疣微菌門（Verrucomicrobia，1.85%）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae，1.75%）、擬桿菌門（Bacteroidetes，1.68%）和厚壁菌門（Firmicutes，1.27%）。對均一化后的OTU 表，基于Bray-Curtis 距離進行主坐標分析發(fā)現(xiàn)：主坐標分析的前兩軸解釋了大約75%的總方差，其中第一軸和第二軸分別解釋55.24%和18.86%的總方差，各處理按照磷肥施用梯度（P0＜P1＜P2）沿第一軸分開，施肥處理各重復(fù)聚集在一起，而不同施肥處理間距較遠。同樣Adonis 分析發(fā)現(xiàn)施肥處理對細菌群落結(jié)構(gòu)具有顯著影響（r2=0.631，P=0.006）。以上結(jié)果說明土壤細菌群落組成和結(jié)構(gòu)在不同磷肥施用梯度下發(fā)生明顯改變。

圖2 三種磷肥施用梯度下砂姜黑土細菌群落α 多樣性的變化 Fig.2 Soil bacterial alpha-diversity of the lime concretion black soil relative to P application rate

圖3 三種磷肥施用梯度下砂姜黑土細菌群落組成的變化 Fig.3 Composition of the soil bacterial community in the lime concretion black soil relative to P application rate

通過對各處理中相對豐度最高的前10 個門（圖4A）和前15 個屬（圖4b）進行單因素方差分析，發(fā)現(xiàn)不同磷肥施用梯度導(dǎo)致砂姜黑土中特定微生物 相對豐度發(fā)生改變。與P0 處理相比，共有3 個門（變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）和疣微菌門（Verrucomicrobia））和3個屬（Kaistobacter、DA101和Rhodanobacter）細菌相對豐度在P1 和P2 處理中有不同程度降低；而4 個門（放線菌門（Actinobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、浮霉菌門（Planctomycetes）和擬桿菌門（Bacteroidetes））和3 個屬（Terracoccus、Flavisolibacter和Arthrobacter）相對豐度在P1 和P2 處理中不同程度升高。與P0 和P1 處理相比，P2處理中的Bradyrhizobium和Burkholderia相對豐度顯著降低。

CAP 分析（圖5a）表明DOC 和TP 對第一軸貢獻率較高，而 3NO--N 對第二軸貢獻率較高；多元回歸樹分析（圖5b）總共解釋了73.10%的細菌群落變異，細菌群落首先由DOC 分為2 個大的分支（解釋43.15%群落變異），然后由TP 又分為兩個分支（解釋29.95%群落變異）。MRT 分析的三片葉子基本將三個處理分開（除一P2 處理歸屬于第二片葉子）。以上結(jié)果說明在不同磷肥施用梯度下，土壤DOC 和TP 是調(diào)控砂姜黑土細菌群落的關(guān)鍵理化因子。

圖4 不同磷肥施用梯度下砂姜黑土相對豐度最高的前10 個門a）和前15 個屬b）的變化 Fig.4 Relative abundances of the top 10 phyla a) and the top 15 genera b) in the lime concretion black soil relative to P application rate

在門和屬水平上，對差異物種與環(huán)境因子進行相關(guān)性分析，結(jié)果如表2 所示。變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）以及Kaistobacter、DA101、Rhodanobacter等在施磷后相對豐度降低的細菌均與DOC 和TP 成顯著負相關(guān)，而與 C∶P 和 N∶P 成顯著正相關(guān)；酸桿菌門（Acidobacteria）、浮霉菌門（Planctomycetes）以及Terracoccus、Arthrobacter等在施磷后相對豐度升高的細菌則與DOC 和TP 成顯著正相關(guān)，與C∶P 和N∶P 成顯著負相關(guān)；擬桿菌門（Bacteroidetes）和Flavisolibacter與 NH+4-N 相關(guān)系數(shù)最高，且均達到極顯著水平。由上述結(jié)果可以看出長期不同磷肥施用梯度下土壤理化性質(zhì)的變化是導(dǎo)致微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的重要原因。

圖5 三種磷肥施用梯度下砂姜黑土細菌群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)之間關(guān)系 Fig.5 Relationship between soil bacterial community structure and soil physic-chemical properties of the lime concretion black soil relative to P application rate

表2 三種磷肥施用梯度下砂姜黑土差異細菌與土壤理化性質(zhì)相關(guān)性 Table2 Pearson correlation analysis of bacterial variation with soil physicao-chemical properties in the lime concretion black soil relative to P application rate

在門和屬水平上，對差異物種與土壤酶活性進行相關(guān)性分析，結(jié)果如表3所示。β-葡糖苷酶和蛋白酶與變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi） 以 及Kaistobacter、DA101、Rhodanobacter等在施磷后相對豐度降低的細菌均成顯著負相關(guān)，而與酸桿菌門（Acidobacteria）、浮霉菌門（Planctomycetes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）以及Terracoccus、Flavisolibacter、Arthrobacter等在施磷后相對豐度升高的細菌成顯著正相關(guān)。酸性磷酸酶則與擬桿菌門（Bacteroidetes） 和Flavisolibacter成顯著正相關(guān)。脫氫酶與綠彎菌門（Chloroflexi）、Bradyrhizobium和Burkholderia成顯著負相關(guān)，而與擬桿菌門（Bacteroidetes）、Terracoccus、Flavisolibacter和Arthrobacter成顯著正相關(guān)。由以上結(jié)果可以看出土壤中酶活性的變化與差異物種間存在顯著性關(guān)聯(lián)，施用磷肥后土壤酶活性的變化可能與相關(guān)功能微生物相對豐度的改變有關(guān)。

表3 三種磷肥施用梯度下砂姜黑土差異細菌與土壤酶活性相關(guān)性 Table3 Pearson correlation analysis of bacterial variation with soil enzyme activities in the lime concretion black soil relative to P application rate

3 討 論

磷素缺乏是砂姜黑土區(qū)作物產(chǎn)量低下的重要限制因子，施用磷肥是提高砂姜黑土磷素有效性的有效措施[3-4]。然而關(guān)于長期不同磷肥施用梯度對地下微生物群落的影響尚未展開系統(tǒng)研究。本研究采用現(xiàn)代高通量測序技術(shù)，研究經(jīng)過21年三種不同磷肥施用梯度后，土壤細菌群落多樣性及細菌群落組成變化，探索其與土壤肥力指標及土壤酶活性的關(guān)系。

3.1 長期三水平磷肥施用梯度對細菌群落多樣性和組成的影響

與以往的研究結(jié)果相同[9]，長期施用磷肥導(dǎo)致土壤細菌多樣性顯著升高（圖2a）。Zhong 和Cai[23]認為施用磷肥后土壤養(yǎng)分的升高尤其是有機質(zhì)含量的增加是導(dǎo)致細菌多樣性增加的主要原因。在本研究中施用磷肥后土壤DOC 和TP 含量顯著升高，而相關(guān)性分析（圖2b）表明DOC 和TP 含量均與香農(nóng)指標成顯著正相關(guān)（r=0.89，P=0.001；r=0.93，P=0.001）。因此在本研究中長期施磷后DOC 和TP含量的升高可能是導(dǎo)致細菌多樣性升高的重要原因。

磷肥施入不僅提高了細菌多樣性，同時還改變了細菌群落組成和結(jié)構(gòu)。在門水平上，放線菌門（Actinobacteria）、浮霉菌門（Planctomycetes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）相對豐度隨著磷肥施入而逐漸升高（圖4a）。研究表明這三種細菌在土壤中均具有溶磷作用，在土壤中可將難利用的無機磷和大分子的有機磷轉(zhuǎn)化為作物可吸收利用的磷素形態(tài)，其相對豐度隨磷肥的加入而升高[24-26]。在屬水平上，Terracoccus、Flavisolibacter和Arthrobacter相對豐度則隨著磷肥的施入逐漸升高（圖4b）。Terracoccus和Arthrobacter均屬于 Actinomycetales ，F(xiàn)lavisolibacter屬于Chitinophagaceae，它們在土壤中均具有溶磷作用，其相對豐度隨磷肥施用而升高[27-28]。由上述結(jié)果可以看出長期施用磷肥導(dǎo)致砂姜黑土中溶磷細菌的相對豐度升高。我們之前的研究表明砂姜黑土對磷素具有較強的固持作用，施用磷肥后土壤中的磷主要向生物有效性低的Al-P 和Fe-P 轉(zhuǎn)化[4]。因此施磷土壤中大量難利用的P 素可能會促進溶磷細菌的生長，而溶磷細菌可通過分泌有機和無機酸性物質(zhì)、H+、磷酸酶、激素等提高磷素有效性[29]。

長期施用磷肥還導(dǎo)致部分細菌相對豐度的降低。在門水平上，變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）和疣微菌門（Verrucomicrobia）相對豐度隨著磷肥的施入而有所降低（圖4a）。其中綠彎菌門（Chloroflexi） 和疣微菌門（Verrucomicrobia）均為寡營養(yǎng)型細菌，適宜在養(yǎng)分有效性低環(huán)境中生長[30]；相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)（表2），它們的相對豐度均與全磷含量成顯著負相關(guān)（r= -0.82，P＜0.05；r= -0.63，P＜0.05），因此施磷土壤中較高的養(yǎng)分含量可能會抑制其生長。與之前的研究結(jié)果不同， 屬富營養(yǎng)型的變形菌門（Proteobacteria）[30]在施用磷肥后相對豐度降低；相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)變形菌門（Proteobacteria）與pH 成顯著負相關(guān)（r= -0.73，P＜0.05），這與之前的研究結(jié)果相同[31]。因此未施磷肥土壤中較低的pH 可能更適宜變形菌門（Proteobacteria）的生長（盡管不同處理間的pH 差異沒有達到顯著水平）。在屬水平上，Kaistobacter、DA101和Rhodanobacter相對豐度在施磷后有所降低（圖4b）。Kaistobacter和Rhodanobacter均為土壤中重要的反硝化細菌，可將硝酸鹽轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽[32-33]。在本研究中，其相對豐度與NO3--N含量均呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（r=0.93，P＜0.01；r=0.85，P＜0.01），由此可以推斷，P0 處理中較高的硝酸鹽含量可能更適宜其生長。DA101屬于Chthoniobacteraceae，其在土壤中功能尚不清楚。P2 處理中Bradyrhizobium和Burkholderia顯著低于其他兩個處理，Bradyrhizobium屬于根瘤菌目，它和Burkholderia均是土壤中重要的固氮細菌，可將大氣中的N2固定轉(zhuǎn)化為土壤氮源。P2 處理中由于磷肥的不斷施入，N∶P 不斷降低，N 的有效性下降，而固氮細菌固氮作用需要大量土壤N，這種N 有效性的不足可能會降低固氮菌相對豐度[32-33]。

由以上結(jié)果可以看出長期施用磷肥可顯著提高土壤中溶磷細菌相對豐度，但由于DOC、TP、3NO--N和pH 等土壤理化指標的變化導(dǎo)致土壤中寡營養(yǎng)型細菌、反硝化細菌和固氮細菌相對豐度的降低。

3.2 細菌群落結(jié)構(gòu)與土壤環(huán)境因子及酶活性關(guān)系

以往的大量研究表明，pH 是土壤細菌群落最佳預(yù)測因子，對細菌群落的變化起主導(dǎo)作用[34]。朱敏[5]和孫瑞波[22]等分別采用熒光實時定量PCR 和高通量測序技術(shù)研究不同施肥模式對砂姜黑土微生物群落的影響，其研究結(jié)果一致認為不同施肥處理后pH的變化是導(dǎo)致細菌群落變異的主要因素。而本研究中，DOC 和TP 是細菌群落最重要的決定因素（圖5a 和圖5b）。這可能是由于在本研究中不同施磷處理間pH 差異很?。?.22～5.53），如此小的pH 差異對細菌群落結(jié)構(gòu)的改變作用并不明顯。DOC 是土壤中微生物可直接利用的有機碳源，而碳的有效性是限制土壤微生物生長最重要因素[35]。Huang 等[10]研究認為施用磷肥后細菌生物量的增加主要是由于DOC 含量的升高。本研究中相關(guān)性分析（表2）表明，C∶P 和N∶P 與多個差異細菌間存在顯著相關(guān)關(guān)系。在施磷土壤中，TP 和AP 含量增加，C∶P和N∶P 降低，此時C 源和N 源成為限制微生物生長的環(huán)境因子。相反，在P0 處理中，由于長期P素損耗，微生物的生長面臨嚴重的P 素脅迫，此時P 取代C 和N 成為微生物生長的限制因子。因此不同施磷處理中這種C、N、P 有效性的變化可能是導(dǎo)致微生物群落組成差異的重要因素。

砂姜黑土區(qū)長期施用磷肥不僅改變了微生物群落組成，同時還提高了土壤微生物功能。本研究以β-葡糖苷酶、蛋白酶、酸性磷酸酶和脫氫酶等4 種胞外酶活性代表微生物功能。其中β-葡糖苷酶屬于纖維素酶類，具有分解纖維素的功能，其與土壤有機質(zhì)的轉(zhuǎn)化關(guān)系密切。蛋白酶參與土壤中氨基酸、蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化，其水解產(chǎn)物是作物生長的重要氮源。酸性磷酸酶在土壤磷素循環(huán)中具有重要作用，其活性高低可直接影響土壤磷素有效性。脫氫酶可反映土壤體系內(nèi)活性微生物量以及其對有機物的降解活性，可以作為土壤微生物降解性能的指標[15-16]。本研究結(jié)果（圖3）表明β-葡糖苷酶、蛋白酶和脫氫酶等三種酶活性均隨磷肥施入量的增加而顯著升高（P＜0.05），有趣的是酸性磷酸酶活性并未受磷肥施用的影響（P＞0.05）。這可能是由于施用磷肥后C∶P 和N∶P 降低，此時C 和N 的有效性不足，刺激微生物分泌β-葡糖苷酶、蛋白酶等與C 和N 循環(huán)相關(guān)胞外酶；而施磷后土壤中磷有效性較高，微生物不需要分泌過多的酸性磷酸酶即可滿足其生長對磷需求[36]。相關(guān)性分析（表3）表明，施用磷肥后相對豐度升高細菌與土壤酶活性之間存在顯著正相關(guān)關(guān)系，其中擬桿菌門（Bacteroidetes） 和Flavisolibacter與所測四種酶均成顯著正相關(guān)關(guān)系。這表明長期不同磷肥施用梯度導(dǎo)致的微生物群落結(jié)構(gòu)變化推動了土壤中與C、N、P 循環(huán)轉(zhuǎn)化有關(guān)的功能微生物的改變。由此可以說明土壤養(yǎng)分、功能微生物和土壤酶活性之間關(guān)系密切，土壤養(yǎng)分差異導(dǎo)致功能微生物的改變，從而引起土壤中酶活性的變化，而這種變化反過來又可能影響土壤性質(zhì)。

4 結(jié) 論

長期施用磷肥可明顯改善砂姜黑土土壤肥力，SOC、DOC、TP、AP 以及NH4+-N 含量在施磷處理中顯著升高。土壤肥力的提升導(dǎo)致細菌群落多樣性顯著升高，同時細菌群落結(jié)構(gòu)和組成發(fā)生明顯改變，而DOC 和TP 是影響砂姜黑土細菌群落結(jié)構(gòu)的最重要的環(huán)境因子。土壤中具有溶磷作用的細菌相對豐度在施磷處理中顯著升高，但寡營養(yǎng)型細菌、具有反硝化和固氮作用的細菌相對豐度則在施磷處理中顯著降低。隨著磷肥施用量的增加，土壤中酶活性也隨之升高，而這種變化與土壤養(yǎng)分、細菌群落密切相關(guān)。