反亞油酸誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組學(xué)及生物信息學(xué)分析

邱 斌 劉 瑋 劉麗娜 宗愛珍 賈 敏 徐同成

（山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所 山東省農(nóng)產(chǎn)品精深加工技術(shù)重點實驗室農(nóng)業(yè)部新食品資源加工重點實驗室 濟(jì)南 250100）

食品中的反式脂肪酸主要是植物油在工業(yè)氫化加工過程中產(chǎn)生的，這類產(chǎn)品主要以氫化植物油為主，其反式脂肪酸含量在40%以上[1]。有研究報道，反式脂肪酸是動脈粥樣硬化和冠心病的誘導(dǎo)因素[2-4]。研究發(fā)現(xiàn)，反式脂肪酸攝入與多個內(nèi)皮損傷因子過量表達(dá)成正相關(guān)，如細(xì)胞間黏附因子-1，細(xì)胞內(nèi)黏附因子-1，E選擇素等[3-5]。另外，研究還發(fā)現(xiàn)反式脂肪酸與炎癥因子（包括白介素-6和C-反應(yīng)蛋白）的激活呈正相關(guān)[6]。反亞油酸（9t，12t-C18：2）在反式脂肪酸中含量高達(dá) 25%，它的攝入對于研究反式脂肪酸的危害有重要意義。與反油酸相比，反亞油酸在9和12位有兩個反式雙鍵，其生物活性比反油酸高，參與的生物進(jìn)程也更復(fù)雜[7]。前期有研究報道，反亞油酸通過caspase、NF-κB等信號通路導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞和肝癌細(xì)胞發(fā)生損傷和凋亡[8-9]。作者采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)的手段研究反油酸（C18：1）對內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)基因及其信號通路的影響[10]。鑒于當(dāng)前國內(nèi)外尚無關(guān)于反亞油酸誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)RNA、信號通路等變化的研究報道，本研究通過反亞油酸（9t，12t-C18：2）單體誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞，探尋其通過哪些靶基因及其相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作用于內(nèi)皮細(xì)胞，為研究反式脂肪酸與人體動脈粥樣硬化等心血管疾病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVECs，山東大學(xué)藥學(xué)院惠贈。

總RNA提取試劑盒，中國天根生化科技（北京）有限公司；TruseqTM RNA sample prep Kit試劑盒，美國Illumina公司；TBS380 Picogreen試劑盒，中國北京索萊寶科技有限公司；Certified Low Range Ultra Agarose，美國Bio-Rad公司；cBot Truseq PE Cluster Kit v3-cBot-HS試劑盒、Hiseq-Truseq SBS Kit（300cycles）試劑盒，美國Illumina公司；高糖DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清，美國賽默飛 Gibco公司；9t，12t-C18：2（反式-9，12-十八碳二烯酸），美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Eppendorf AG CO2培養(yǎng)箱，美國Sheldon公司；2K15型冷凍離心機(jī)，美國Sigma公司；cBoT簇生成系統(tǒng)、Hiseq2500測序儀，美國Illumina公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及樣品處理[8]將細(xì)胞以1×105/mL的數(shù)量接種于培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞貼壁生長至融合狀態(tài)后。將細(xì)胞分為對照組和反亞油酸組（9t，12t-C18：2），反亞油酸組（9t，12t-C18：2）的最終濃度為200μmol/L，加入后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，最后消化收集細(xì)胞，并用總RNA提取試劑處理后凍存于-80℃冰箱留作轉(zhuǎn)錄組學(xué)檢測，重復(fù)3次。

1.3.2 轉(zhuǎn)錄組測序 在進(jìn)行建庫時，將總RNA的起始量設(shè)定為5 μg；然后采用磁珠法分離mRNA，通過試劑盒將mRNA的離子打斷；雙鏈cDNA的合成在最后進(jìn)行，同時完成的還有補(bǔ)平、3'端加A、連接index接頭；待文庫富集完成后，首先進(jìn)行15個循環(huán)的PCR擴(kuò)增；為滿足定量測定的需要對利用2%瓊脂糖膠進(jìn)行回收目的條帶；按一定的比例要求來對定量測定的TBS380進(jìn)行混合上機(jī)；通過橋式PCR擴(kuò)增對cBot進(jìn)行操作，促進(jìn) clusters的生成；2×150 bp測序在 Illumina Hiseq測序平臺完成。

1.3.3 RNA差異表達(dá)分析[10]在測序分析基因/轉(zhuǎn)錄的過程中，以所有樣本與參考基因比對的結(jié)果作為分析依據(jù)，計算每個基因/轉(zhuǎn)錄本在樣本中的FPKM值（百萬外顯子的堿基片段值），以FP KM值作為基因/轉(zhuǎn)錄本在樣本中的表達(dá)量。為了能夠做到可視化分析，使分析結(jié)果更易于理解，通過差異顯著性分析，找出相對差異表達(dá)的基因/轉(zhuǎn)錄本。顯著差異基因/轉(zhuǎn)錄本的標(biāo)準(zhǔn)閾值參照P值≤0.05&FC（倍數(shù)）≥2進(jìn)行篩選，顯著性差異表達(dá)結(jié)果以火山圖進(jìn)行展示。

1.3.4 生物信息學(xué)分析[11]使用OmicsBean（http：//www.omicsbean.com：88/）軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析，其中包括基因本體GO（Gene ontology）富集分析、KEGG通路分析、PPI（Protein-protein interaction）互作分析。另外，GO富集分析還結(jié)合使用了數(shù)據(jù)庫 David 6.7（http：//david.abcc.ncifcrf.gov/）和QuickGO（http：//www.ebi.ac.uk/QuickGO/）對篩選的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO分類注釋和富集分析。KEGG通路分析結(jié)合使用了 KEGG（http：//www.kegg.jp/kegg/pathway.html）數(shù)據(jù)庫。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因表達(dá)分析結(jié)果

作為特定的基因或轉(zhuǎn)錄本的代表，圖1中，顯著上調(diào)的基因用紅色點表示，顯著下調(diào)的基因用藍(lán)色點表示，非顯著差異基因用黑色點表示；在映射完所有基因和轉(zhuǎn)錄本之后，結(jié)果顯示：表達(dá)差異下調(diào)的基因是位于左邊的點，表達(dá)差異上調(diào)的基因是位于右方的點，表達(dá)差異的顯著性會隨著點靠左和靠上的變化愈發(fā)明顯。結(jié)果顯示：反亞油酸（9t，12t C18：2）誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞 24 h之后，與對照組相比，共發(fā)現(xiàn)有126條基因發(fā)生顯著變化，其中基因表達(dá)上調(diào)的有28條，表達(dá)下調(diào)的有98條基因。

2.2 生物信息學(xué)匯總分析

生物信息學(xué)匯總分析包括GO富集和KEGG信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集，結(jié)果總數(shù)以及顯著（P-value＜0.05）數(shù)目分別通過柱形圖（圖2）進(jìn)行直觀展示，其中藍(lán)色柱條代表富集的總數(shù)目，橙色柱條代表富集差異顯著的數(shù)目。

通過生物信息學(xué)分析，反亞油酸（9t，12t C18：2）作用于內(nèi)皮細(xì)胞后，與對照組相比，其中生物進(jìn)程共檢測到2 201條，顯著性差異表達(dá)基因共759條；關(guān)于細(xì)胞組成的基因共發(fā)現(xiàn)249條，其中顯著表達(dá)性差異表達(dá)基因共54條；關(guān)于分子功能的基因共發(fā)現(xiàn)421條，其中顯著表達(dá)性差異表達(dá)基因共118條；共富集到99條相關(guān)信號通路，其中具有顯著性差異的信號通路7條。

2.3 GO分析

GO分析是基于基因本體聯(lián)合會（Gene ontology consortium）所建立的一套生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫，它通過建立一套具有動態(tài)形式的控制字集（Controlled vocabulary），以角色描述來幫助理解基因及蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)所發(fā)揮的作用，從屬性的角度進(jìn)行分析，并對生物體中基因及其基因產(chǎn)物進(jìn)行全面描述。共有3個本體存在于GO當(dāng)中：（1）生物過程（Biological process，BP）——主要是用來描述分子功能的有序組合；（2）細(xì)胞定位（Cellular component，CC）——描述亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、位置及其某些大分子復(fù)合物；（3）分子功能（Molecular function，MF）——詳細(xì)的描述某基因及產(chǎn)物個體的相關(guān)功能。

圖1 差異基因火山圖Fig.1 Differential gene volcanic map

圖3富集分析顯示了生物過程、細(xì)胞定位和分子功能3種屬性具有顯著性差異的排名前20的功能條目。GO中3個本體都有層級之分。層級是對每個過程（組分、功能）進(jìn)行層層劃分，通常層級越大，劃分越細(xì)，生物功能等信息會更明確。在生物過程分析中，主要以生物合成和代謝為主，其中包括膽固醇生物合成、膽固醇代謝、脂質(zhì)代謝等，說明反亞油酸誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞后，反亞油酸顯著改變了涉及胞內(nèi)和胞外脂質(zhì)合成及代謝等生物過程。細(xì)胞定位富集分析結(jié)果顯示，其中參與細(xì)胞膜定位等相關(guān)生物進(jìn)程共計11條，而參與細(xì)胞外區(qū)域定位和涉及膠原蛋白錨定的生物進(jìn)程共5條，細(xì)胞內(nèi)生物進(jìn)程包括bcl3-10復(fù)合物和過氧化物酶等共4條。分子功能富集分析結(jié)果顯示，其中參與蛋白、細(xì)胞外基質(zhì)等綁定功能12條，包括C-4甲基固醇氧化酶、7-去氫膽固醇、角鯊烯合成活性等相關(guān)功能8條。

圖3 GO注釋分析圖Fig.3 GO annotation analysis chart

2.4 KEGG通路分析

差異表達(dá)基因/轉(zhuǎn)錄本相關(guān)信息被映射到KEGG數(shù)據(jù)庫后，可以富集到相關(guān)KEGG通路。

圖4信號通路富集分析顯示：反亞油酸誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞后，能清晰的發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)類固醇生物合成通路（Steroid biosynthesis）激活，膽固醇從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運進(jìn)入線粒體。結(jié)合GO分析中生物進(jìn)程富集結(jié)果，類固醇生物合成和代謝相關(guān)進(jìn)程都有顯著表達(dá)，這與KEGG類固醇合成通路結(jié)果一致。同時，還發(fā)現(xiàn)反亞油酸在細(xì)胞內(nèi)代謝過程中，還激活了包括腫瘤壞死因子TNF信號通路（TNF signaling pathway）、細(xì)胞凋亡（Apoptosis）及PI3K-AKT等信號通路。

圖4 KEGG通路富集分析圖Fig.4 KEGG pathway enrichment analysis chart

Downar等[12]報道了反油酸（9t C18：1）和反亞油酸（9t，12t-C18：2）能夠通過激活 Caspase-3 誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。研究者發(fā)現(xiàn)反油酸能夠通過死亡受體通路和線粒體通路誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[13]。饒歡等[14]發(fā)現(xiàn)反式脂肪酸能夠通過FAS/FASL通路誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。在內(nèi)皮細(xì)胞中，TFA能夠通過激活PI3K-Akt通路進(jìn)而增加NO的產(chǎn)生[15]。TFA能夠造成系統(tǒng)炎癥及其相關(guān)炎癥因子的表達(dá)，包括TNF-α、TNF 受體、IL-6 等[16-18]。

2.5 PPI基因互作分析

基因互作是通過對已知蛋白質(zhì)/基因之間和預(yù)測蛋白質(zhì)/基因之間的關(guān)系進(jìn)行分析，并借助數(shù)據(jù)庫得到準(zhǔn)確的搜尋結(jié)果，預(yù)測蛋白質(zhì)/基因的相互關(guān)系。這種關(guān)系既是相關(guān)性的體現(xiàn)，也是相互作用的顯現(xiàn)，充分說明了包括蛋白質(zhì)/基因等之間的關(guān)聯(lián)。

通過圖5發(fā)現(xiàn)某個基因或蛋白參與了多個生物進(jìn)程和多條信號通路。這些基因或蛋白在整個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路網(wǎng)絡(luò)中起到至關(guān)重要的作用，它的表達(dá)上調(diào)或下調(diào)，能夠使多條信號通路發(fā)生激活或靜默。因此，通過對信號通路中的這些靶蛋白或靶基因的檢測，能夠為了解反式脂肪酸調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞生物進(jìn)程機(jī)制提供重要思路。其中，研究發(fā)現(xiàn)CSF3基因同時參與瘧疾通路（Malaria pathway）和PI3K-Akt信號通路。TRAF1基因同時參與凋亡途徑（Apoptosis pathway）和腫瘤壞死因子通路（TNF signaling pathway）通路；TRAF1作為TNF通路受體家族一員，有研究發(fā)現(xiàn)TRAF1的激活，會導(dǎo)致TNF信號通路的下調(diào)[19]。本試驗中TRAF1下調(diào)，相反可能會導(dǎo)致TNF信號通路的激活和上調(diào)。MMP3基因同時參與了腫瘤壞死因子通路（TNF signaling pathway）和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎通路（Rheumatoid arthritis）；有研究報道，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎細(xì)胞模型中，TNF通路會通過激活PI3K-Akt信號通路，進(jìn)而激活MMP3等炎癥因子[20]。通過PPI互作圖發(fā)現(xiàn)，反式脂肪酸能夠誘導(dǎo)TNF通路激活，進(jìn)而激活MMP3炎癥因子，而PI3K-Akt信號通路并沒有參與TNF通路。FOS、CTSK同時參與了類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎通路（Rheumatoid arthritis）和凋亡途徑（Apoptosis pathway）；有報道發(fā)現(xiàn) CTSK mRNA表達(dá)上調(diào)與凋亡成正相關(guān)[21]。FOS既可以作為轉(zhuǎn)錄激活因子，又可以作為轉(zhuǎn)錄抑制因子。而c-fos作為轉(zhuǎn)錄抑制因子，在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡后，c-fos基因的表達(dá)會受到抑制[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)反式脂肪酸誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡后，CTSK的mRNA表達(dá)上調(diào)，同時FOS的mRNA表達(dá)受到抑制，與報道研究一致。HMGCS1基因同時參與了萜類骨架合成通路（Terpenoid backbone biosynthesis）、酮體合成和降解通路（Synthesis and degradation of ketone bodies）。HMGCS1是膽固醇合成過程的關(guān)鍵酶，有研究報道顯示，在超聲波誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中，HMGCS1基因表達(dá)及其膽固醇合成通路下調(diào)[23]。HMGCS1所涉及的萜類骨架合成通路及其酮體合成和降解通路有可能作為下游通路，參與到反式脂肪酸誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡進(jìn)程中，需要后續(xù)試驗進(jìn)行驗證。

圖5 信號通路網(wǎng)絡(luò)基因互作圖Fig.5 Signal pathway network gene interaction map

3 結(jié)論

本研究考察了反亞油酸（9t，12t-C18：2）對內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)的影響，發(fā)現(xiàn)共計126條基因發(fā)生顯著變化，研究還重點針對表達(dá)顯著差異的基因進(jìn)行GO富集分析和討論。最后根據(jù)基因互作通路分析發(fā)現(xiàn)：反亞油酸作用于內(nèi)皮細(xì)胞所涉及相關(guān)信號通路主要包括類固醇生物合成通路、凋亡通路、腫瘤壞死因子通路和PI3K-Akt信號通路等，還發(fā)現(xiàn)多個參與多個通路的靶基因，包括TRAF1、HMGCS1、FOS和CTSK。本研究為后續(xù)全方位研究反亞油酸在內(nèi)皮細(xì)胞的作用機(jī)制研究提供了方向。