劉 磊 冉玉兵 張名位 文 偉 張瑞芬 趙廣河
(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部功能食品重點實驗室廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室 廣州 510610)
米糠是糙米精白過程的副產(chǎn)物,約占糙米質(zhì)量的8%,主要由種皮、珠心層、糊粉層及胚組成[1]。米糠富含蛋白質(zhì)、脂肪、礦物質(zhì)及維生素等多種營養(yǎng)成分,同時富含多酚類物質(zhì)等植物活性成分,是一種“天賜營養(yǎng)源”[2]。我國米糠年產(chǎn)量約1800萬t[3],主要用作動物飼料等,被廉價消耗,利用率低,造成了資源浪費。探尋米糠的高值轉(zhuǎn)化利用技術(shù)成為科研工作者亟待解決的問題[4]。
近年來微生物發(fā)酵技術(shù)被廣泛用于大宗糧食副產(chǎn)物的開發(fā)利用中[5]。有報道稱微生物發(fā)酵能加強米糠的生物活性,如Kim等[6]發(fā)現(xiàn)米糠經(jīng)酵母菌發(fā)酵后具有降血壓和抗疲勞等功效;Park等[7]利用芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵米糠可增強其對肝損傷小鼠的護(hù)肝作用。然而,這些研究缺乏對米糠中生物活性成分的分析。酚類物質(zhì)是植物中重要的生理活性成分?,F(xiàn)代流行病學(xué)調(diào)查表明膳食中增加酚類物質(zhì)的攝入可以降低肥胖癥等慢性疾病的發(fā)病率[8]。糙米中的酚類物質(zhì)主要集中在米糠層,多以結(jié)合態(tài)形式存在[1,9]。Schmidt等[10]利用米根霉固態(tài)發(fā)酵米糠,可使米糠中的酚類化合物含量較發(fā)酵前提高110%,且抗氧化活性顯著提高,然而未分析發(fā)酵過程中還原糖的變化。乳酸菌作為可食用菌種,廣泛應(yīng)用于食品發(fā)酵工業(yè)中,可以提升食品的營養(yǎng)價值,賦予其良好的食用品質(zhì)[11]。Luana等[12]研究表明乳酸菌發(fā)酵燕麥粉可以顯著提高其總酚和可溶性膳食纖維以及生理活性物質(zhì)β-葡聚糖的含量,同時還可改善燕麥粉的風(fēng)味。
課題組前期研究比較了保加利亞乳桿菌、乳酸鏈球菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌和腸膜明串珠菌等5種單一乳酸菌對還原糖和可溶性酚的影響[13]。相比較單一菌種發(fā)酵,復(fù)合菌種能產(chǎn)生更豐富的風(fēng)味物質(zhì)。目前關(guān)于復(fù)合乳酸菌發(fā)酵對米糠中酚類物質(zhì)及營養(yǎng)成分的影響鮮有研究報道。本研究以脫脂米糠為原料,通過半干法酶解米糠為乳酸菌發(fā)酵提供糖源,采用降糖和釋放可溶性酚類物質(zhì)能力為指標(biāo)建立復(fù)合乳酸菌半固態(tài)發(fā)酵脫脂米糠的最優(yōu)工藝條件,同時對發(fā)酵前、后脫脂米糠的營養(yǎng)成分進(jìn)行比較分析,旨在為開發(fā)米糠發(fā)酵粉,為拓寬米糠的加工途徑提供技術(shù)指導(dǎo)。
1.1.1 試驗材料 乳酸菌株:保加利亞乳桿菌(GIM 1.155)、嗜酸乳桿菌(GIM 1.731)、植物乳桿菌(GIM 1.648)、干酪乳桿菌(GIM 1.204)、腸膜狀明串珠菌(GIM 1.357),廣東省微生物菌種保藏中心。
脫脂米糠:本實驗室自制。新鮮米糠清理粉碎,過60目篩,經(jīng)CO2超臨界萃取脫脂處理。水分含量9.56%,淀粉含量41.11%,蛋白含量14.28%,膳食纖維含量24.65%,灰分含量9.13%。
MRS培養(yǎng)基,廣東環(huán)凱生物科技有限公司;高溫 α-淀粉酶(20 000U/g,最適 pH 6.0),尤特爾生物技術(shù)有限公司,食品級;其它試劑均為國產(chǎn)分析純級。
1.1.2 試驗儀器 HA420-40-200二氧化碳超臨界萃取設(shè)備,海安華安超臨界設(shè)備有限公司;SWCJ-2FD無菌操作臺,上海博訊實業(yè)有限公司;RHS-250-Z-Ⅱ恒溫恒濕培養(yǎng)箱,上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司;K8400型蛋白質(zhì)分析儀,瑞典FOSS公司;L-8900型全自動氨基酸分析儀,日本HITACHIL公司;Biofuge Stratos Sorvall高速冷凍離心機,美國Thermo公司;UV-1240型紫外-可見分光光度計,日本島津分析儀器公司。
1.2.1 米糠的乳酸菌發(fā)酵工藝流程 米糠發(fā)酵工藝參考前期研究[10],具體流程如下:
圖1 工藝流程圖Fig.1 The roadmap of the process
工藝要點如下:
(1)半干法酶解米糠的制備:100 g新鮮脫脂米糠與含有高溫α-淀粉酶的去離子水按質(zhì)量體積比1∶1.5的比例混合后,攪拌均勻,分裝于三角瓶中密封,于100℃蒸30min,121℃殺菌15min,冷卻備用。
(2)菌種活化及復(fù)壯培養(yǎng):5株乳酸菌及其保藏物(保加利亞乳桿菌、乳酸鏈球菌、植物乳桿菌、酪乳桿菌和腸膜狀明串珠菌)置于MRS肉湯中進(jìn)行活化,30℃,靜止發(fā)酵24 h,取1mL活化后的菌懸液,擴大培養(yǎng)2代,得復(fù)壯培養(yǎng)后的菌懸液(9 lg CFU/mL)。
(3)乳酸菌發(fā)酵:將復(fù)壯后的乳酸菌分別接種入(1)中制備好的半干法酶解米糠中,初始接種量為1.0%,發(fā)酵溫度為30℃。
1.2.2 不同復(fù)合乳酸菌菌種發(fā)酵米糠效果比較試驗 根據(jù)預(yù)試驗,將上述復(fù)壯后的5株乳酸菌兩兩復(fù)配,比例為1∶1,接種到制備好的半干法酶解米糠中,30℃恒溫培養(yǎng)24 h,測定發(fā)酵前、后米糠中可溶性酚類物質(zhì)和還原糖含量的變化,并以不發(fā)酵組為空白對照。
1.2.3 復(fù)合乳酸菌菌種發(fā)酵米糠單因素試驗 選取發(fā)酵后米糠中的還原糖和可溶性酚類物質(zhì)含量變化為考察指標(biāo),分別考察接種量、菌種配比、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間對考察指標(biāo)的影響,單因素試驗設(shè)計如下:
(1)接種量:設(shè)定復(fù)合菌種配比為1∶1,發(fā)酵溫度30℃,發(fā)酵時間24 h,接種量設(shè)定為1.0%,2.0%,3.0%,4.0%,5.0%和6.0%。
(2)菌種配比:按照(1)中確定的條件,A、B菌種配比設(shè)定為1∶0,1∶9,3∶7,5∶5,7∶3,9∶1和0∶1。
(3)發(fā)酵溫度:按照(1)和(2)確定的條件,發(fā)酵溫度設(shè)定為25,30,35,40℃和45℃。
(4)發(fā)酵時間:按照(1)、(2)和(3)中確定的條件,發(fā)酵時間設(shè)定為12,24,36,48 h和60 h。
1.2.4 相關(guān)指標(biāo)的測定
(1)還原糖含量的測定 準(zhǔn)確稱取5 g發(fā)酵米糠,置于50mL小燒杯中,加入30mL去離子水,磁力攪拌30min,轉(zhuǎn)移至50mL離心管中,4 000 r/min離心10min,取上清液,定容至50mL,采用DNS比色法測定其中還原糖的量,測定總糖時上清液先經(jīng)水解、中和并定容后采用DNS法測定,結(jié)果均以每克干基葡萄糖毫克量(mg glucose/g)表示,簡寫為(mg/g)。
(2)可溶性酚類物質(zhì)的提取和測定 參考Xu等[14]的方法提取可溶性酚類物質(zhì)。準(zhǔn)確稱取5 g發(fā)酵脫脂米糠,加入50mL去離子水,10 000 r/min均質(zhì)5min,4 000 r/min離心收集上清液。向水相中加入4mol/L NaOH溶液50mL,充滿氮氣密封,室溫下振蕩4 h。所得堿化液用6mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至2后,分別用100mL乙酸乙酯萃取5次,合并乙酸乙酯萃取相,在45℃下旋蒸至干,殘余物用甲醇定容至10mL,得發(fā)酵脫脂米糠可溶性酚類物質(zhì)提取液,貯存于-20℃冰箱備用。稱樣和提取均重復(fù)3次。
參考Singleton等[15]方法測定可溶性酚類物質(zhì)含量。移取0.125mL酚類物質(zhì)提取液,加入0.5 mL去離子水和0.125mL福林酚試劑,混勻后靜置6min,再加入1.25mL 7%碳酸鈉溶液和1mL去離子水,混勻后在25℃下避光靜置90min,于760 nm波長下測其吸光值。同時以0.125mL甲醇代替提取液作空白對照,以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線??偡雍恳悦?00 g干基中所含沒食子酸當(dāng)量(mg gallic acid equivalents/100 g dry weight)表示,簡寫為(mg GAE/100 g DW)。
1.2.5 發(fā)酵米糠提取物基本組成測定 100 g脫脂米糠經(jīng)半干法酶解后,接種入復(fù)合乳酸菌,按照上述優(yōu)化后的工藝發(fā)酵,熱水浸提4 h后,4 000 r/min離心取上清,將發(fā)酵上清提取液凍干成粉,得到發(fā)酵米糠浸提物,測定相關(guān)營養(yǎng)成分含量。淀粉含量的測定:GB/T 5009.9-2008;還原糖含量的測定采用DNS比色法;碳水化合物含量的測定:GB/Z 21922-2008;蛋白質(zhì)含量的測定:GB 5009.5-2010;蛋白氨基酸組成測定:GB/T 5009.124-2003;膳食纖維含量的測定:GB/T 5009.88-2008;可溶性膳食纖維含量參考AACC 920.153(2011)方法測定;灰分含量的測定:GB 4800-84??扇苄苑宇惖奶崛『蜏y定參考1.2.4節(jié)(2)中的方法。樣品制備和測定均重復(fù)3次。其中原料利用率、淀粉轉(zhuǎn)化率、可溶性膳食纖維得率、蛋白提取率計算公式如下:
1.2.6 米糠提取物中蛋白營養(yǎng)價值評價 參考胡秋輝等[16]的方法,采用氨基酸比值系數(shù)法對發(fā)酵米糠提取物中蛋白營養(yǎng)價值進(jìn)行評價。即根據(jù)氨基酸平衡理論,利用WHO/FAO的必需氨基酸模式,計算樣品中必需氨基酸(Essential amino acids,EAA)的氨基酸比值(Ratio of amino acids,RAA),氨基酸比值系數(shù)(Ratio coefficient,RC)和比值系數(shù)分?jǐn)?shù)(Score of ratio coefficient,SRC)。
式中,CV——RC的變異系數(shù),CV=標(biāo)準(zhǔn)差/均數(shù)。由于一般食物各種氨基酸比值往往不相同,故可計算氨基酸比值的均數(shù)。按照公式(5~7)分別計算各米糠蛋白的RAA、RC、SRC值。
采用SPSS19軟件檢驗分析比較試驗各組間均值差異顯著性(P<0.05),響應(yīng)面試驗采用design expert軟件處理。
淀粉是米糠的主要化學(xué)成分,如何在水分含量較低的條件下,降解淀粉為乳酸菌生長提供可利用糖,成為發(fā)酵利用米糠的關(guān)鍵。本研究采用高溫α-淀粉酶在蒸汽條件下降解米糠中的淀粉,為乳酸菌的生長提供碳源[17]。此外,前期研究發(fā)現(xiàn)不同乳酸菌的降糖能力和釋放酚類物質(zhì)的能力密切相關(guān)[13],而現(xiàn)代流行病學(xué)表明攝入米糠多酚可以預(yù)防癌癥、糖尿病、肥胖癥等慢性疾病[18-21],因此,本文同時以還原糖含量和可溶性總酚含量為考察指標(biāo)。圖2為不同復(fù)合乳酸菌發(fā)酵對脫脂米糠中還原糖和可溶性總酚含量的影響。從圖中可以看出,不同復(fù)合乳酸菌發(fā)酵對米糠中還原糖和可溶性總酚含量的影響顯著(P<0.05),復(fù)合乳酸菌發(fā)酵后,米糠中的還原糖含量顯著下降,可溶性總酚含量顯著提高,這主要是由于發(fā)酵過程中糖類物質(zhì)被降解利用,導(dǎo)致還原糖含量降低,而米糠細(xì)胞壁上的糖及蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)被利用降解的同時,與之結(jié)合的酚類物質(zhì)被釋放出來,導(dǎo)致可溶性總酚含量升高[17,22]。其中植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌復(fù)合發(fā)酵,降糖和釋放可溶性酚類物質(zhì)的能力明顯優(yōu)于其它復(fù)合菌種。因此,植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌為本次發(fā)酵最適復(fù)合乳酸菌菌種。
圖2 不同復(fù)合乳酸菌發(fā)酵對米糠中還原糖(a)和可溶性總酚(b)含量的影響Fig.2 Effects of different complex strains on the content of reducing sugar(a) and total soluble phenolics(b) of rice bran
2.2.1 不同接種量對發(fā)酵米糠中還原糖含量和可溶性總酚含量的影響 圖3為不同復(fù)合菌種接種量對發(fā)酵米糠中還原糖含量和可溶性總酚含量的影響。從圖中可以看出,隨著接種量的增加,發(fā)酵米糠中的還原糖含量呈顯著下降趨勢(P<0.05),可溶性總酚含量呈先稍微升高后不變的趨勢。當(dāng)復(fù)合菌種接種量達(dá)到5.0%后,發(fā)酵米糠中的還原糖含量和可溶性總酚含量均不再有顯著性變化(P>0.05),因此選定接種量為5.0%為最適接種量。
2.2.2 菌種配比對發(fā)酵米糠中還原糖含量和可溶性總酚含量的影響 圖4為不同菌種配比對發(fā)酵米糠中還原糖含量和可溶性總酚含量的影響。從圖中可以看出,嗜酸乳桿菌和植物乳桿菌間的配比對發(fā)酵米糠中的還原糖含量和可溶性總酚含量均無顯著性影響(P>0.05),因此確定菌種配比為1∶1。
圖3 不同接種量對發(fā)酵米糠中還原糖含量和可溶性總酚含量的影響Fig.3 Effects of complex strain inoculation amount on the content of reducing sugar and total soluble phenolics of rice bran
圖4 不同菌種比例對發(fā)酵米糠中還原糖含量和可溶性總酚含量的影響Fig.4 Effects of complex strains matching shift on the content of reducing sugar and total soluble phenolics of rice bran
2.2.3 發(fā)酵溫度對發(fā)酵米糠中還原糖含量和可溶性總酚含量的影響 圖5為不同發(fā)酵溫度對發(fā)酵米糠中還原糖含量和可溶性總酚含量的影響。從圖中可以看出,發(fā)酵米糠中的還原糖含量隨發(fā)酵溫度的升高呈先下降后上升趨勢,當(dāng)發(fā)酵溫度為35℃時,還原糖含量顯著低于其它水平值(P<0.05)??扇苄钥偡雍侩S著發(fā)酵溫度升高呈先不變后下降趨勢,當(dāng)溫度超過35℃后,發(fā)酵米糠中可溶性總酚含量顯著下降(P<0.05)。因此,綜合判斷復(fù)合菌種發(fā)酵米糠時最適溫度為35℃。
圖5 不同發(fā)酵溫度對發(fā)酵米糠中還原糖含量和可溶性總酚含量的影響Fig.5 Effects of the fermentation temperature on the content of reducing sugar and total soluble phenolics of rice bran
2.2.4 發(fā)酵時間對發(fā)酵米糠中還原糖含量和可溶性總酚含量的影響 圖6為不同酵時間對發(fā)酵米糠中還原糖含量和可溶性總酚含量的影響。從圖中可以看出,隨著發(fā)酵時間的延長,發(fā)酵米糠中的還原糖含量呈逐漸降低的趨勢,可溶性總酚含量呈先上升后下降趨勢,當(dāng)發(fā)酵時間為36 h時,與發(fā)酵時間24 h比較發(fā)現(xiàn)米糠中還原糖含量顯著降低(P<0.05),而可溶性總酚含量無顯著變化,因此選擇36 h為最適發(fā)酵時間,此時脫脂米糠中可溶性酚含量是102.3mg GAE/100 g DW,還原糖含量是60.6mg/g。
圖6 不同發(fā)酵時間對發(fā)酵米糠中還原糖含量和可溶性總酚含量的影響Fig.6 Effect of the fermentation time on the content of reducing sugar and total soluble phenolics of rice bran
2.3.1 基本組成表1為發(fā)酵前、后米糠提取物的基本營養(yǎng)成分比較。從表中可以看出,發(fā)酵后米糠提取物中可溶性固形物、碳水化合物、可溶性膳食纖維、蛋白和可溶性總酚含量顯著高于未發(fā)酵米糠(P<0.05)。對比發(fā)酵前、后提取物中基本組成可知,發(fā)酵后米糠提取物中可溶性固形物、碳水化合物、可溶性膳食纖維、蛋白和可溶性總酚含量分別提高了 31.42%,21.82%,112.21%,65.54%和37.14%。
表1 發(fā)酵前、后米糠提取物的基本組成(g/100g DRB)Table1 Fundamental components of rice bran extract before and after fermentation(g/100g DRB)
米糠的細(xì)胞壁是由纖維素、蛋白質(zhì)及淀粉等大分子形成的復(fù)雜三維結(jié)構(gòu),溶解性較差[23]。本研究在蒸汽條件下采用高溫α-淀粉酶降解淀粉可使米糠中的還原糖提高6倍左右[13],這是碳水化合物增加的主要原因。陳麗莉[24]對乳酸菌發(fā)酵前、后的豆渣膳食纖維進(jìn)行分析,結(jié)果表明乳酸菌發(fā)酵可以降解豆渣中由阿拉伯糖、木糖和糖醛酸等組成的不溶性膳食纖維,從而使豆渣中的可溶性膳食纖維含量提高,這可能是本研究中發(fā)酵后米糠提取物中可溶性膳食纖維含量顯著提高的原因。劉晶晶等[25]研究表明復(fù)合乳酸菌發(fā)酵可以提高柳枝稷粗蛋白含量,這與本研究中乳酸菌發(fā)酵后提取物中蛋白含量顯著提高的結(jié)果一致。閔偉紅[26]的研究指出乳酸菌發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量的乳酸可以促進(jìn)蛋白質(zhì)的溶出。此外,乳酸菌在生長繁殖過程中產(chǎn)生的菌體蛋白也是可溶性蛋白質(zhì)增加的原因之一[27]。復(fù)合乳酸菌發(fā)酵后,米糠中的可溶性酚類物質(zhì)含量顯著提高。Razak等[28]報道復(fù)合霉菌發(fā)酵增加了米糠中的游離酚。這與本研究的結(jié)果相一致。米糠中的不溶性結(jié)合酚類物質(zhì)以酯鍵、糖苷鍵、醚苷鍵等與細(xì)胞壁上的纖維素及蛋白質(zhì)等大分子相結(jié)合,乳酸菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生糖苷酶、蛋白酶及阿魏酸酯酶降解了米糠細(xì)胞壁上的大分子物質(zhì),從而釋放出與之相結(jié)合的酚類物質(zhì)[17,29]。
2.3.2 蛋白質(zhì)的氨基酸組成與營養(yǎng)價值表2為發(fā)酵前、后米糠提取物中蛋白質(zhì)的氨基酸含量分析。從表中可以看出,發(fā)酵前、后蛋白的氨基酸含量有顯著性變化,乳酸菌發(fā)酵使得發(fā)酵后蛋白的必需氨基酸比例提高了21.23%,其中異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸和纈氨酸含量分別提高了 47.18%,49.78%,13.73%,9.0%,75.26%,24.06%(P<0.05),同時,發(fā)酵米糠提取物的必需氨基酸與非必需氨基酸比值較發(fā)酵前提高了33.33%。氨基酸含量的變化和乳酸菌發(fā)酵過程中產(chǎn)生的蛋白酶種類、氨基酸及肽的代謝、有機酸的酸化等因素密切相關(guān)[30],具體原因有待進(jìn)一步研究。Zhao等[31]研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌發(fā)酵可以提高麥麩中亮氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸等氨基酸的含量。這種差異可能是由于原料的組成及使用的乳酸菌不同導(dǎo)致。
為了進(jìn)一步對蛋白營養(yǎng)價值進(jìn)行評價,本文采用氨基酸比值系數(shù)法進(jìn)行評價,結(jié)果如表3所示。如果食物蛋白質(zhì)的EAA組成比例與EAA模式一致,則 CV=0,SRC=100,相比較而言,SRC 越接近100,其營養(yǎng)價值相對越高。比較可知乳酸菌發(fā)酵顯著提高了脫脂米糠中的蛋白營養(yǎng)價值。
表2 發(fā)酵前、后米糠提取物蛋白質(zhì)的氨基酸組分(mg/g蛋白)Table2 Animo acids components of proteins in rice bran extract before and after fermentation(mg/g protein)
表3 發(fā)酵前、后米糠提取物中蛋白質(zhì)的必需氨基酸的RAA、RC和SRC值Table3 RAA,RC,SRC value of the essential amino acids of protein in the rice bran extract before and after fermentation
本文以脫脂米糠為原料,采用降糖和釋放可溶性酚類物質(zhì)能力為指標(biāo),篩選確定了用于發(fā)酵的復(fù)合乳酸菌,分別考察接種量、菌種配比、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間等單因素對考察指標(biāo)的影響,優(yōu)化了脫脂米糠復(fù)合乳酸菌半固態(tài)發(fā)酵的工藝條件:復(fù)合菌種為嗜酸乳桿菌和植物乳桿菌,菌株比例1:1,復(fù)合菌株添加量5.0%,發(fā)酵溫度35℃,發(fā)酵時間36h。發(fā)酵米糠熱水浸提物中可溶性固形物、碳水化合物、可溶性膳食纖維、可溶性蛋白含量和可溶性總酚含量分別為38.27%,27.02%,4.52%,2.93%和105.60mg GAE/100 g DW,相比于未發(fā)酵米糠分別提高了31.42%,21.82%,112.21%,65.54%和37.14%(P<0.05)。對發(fā)酵脫脂米糠蛋白質(zhì)的氨基酸組成與營養(yǎng)價值分析發(fā)現(xiàn),發(fā)酵米糠提取物中必需氨基酸的含量提高了21.23%,其與非必需氨基酸比值為0.48,較未發(fā)酵米糠提高了33.33%,并且必需氨基酸的SRC值更接近100,由此說明發(fā)酵米糠提取物的營養(yǎng)價值更高。以上結(jié)果表明,乳酸菌發(fā)酵可以改善米糠的營養(yǎng)價值,使其成為風(fēng)味良好的配料應(yīng)用在食品加工業(yè)中。本研究可以為脫脂米糠的高值化利用提供指導(dǎo)。