磷脂茶多酚復(fù)合物的制備及其對(duì)淡水魚(yú)松的抗氧化作用

林亞楠 王海星 陽(yáng)麗紅 戴志遠(yuǎn) 陳 康 沈 清*

（1 浙江工商大學(xué)海洋食品研究院 杭州 310012

2 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 浙江溫州 325000）

茶多酚（Tea polyphenols，TPP）又叫茶單寧，茶鞣質(zhì)，是茶葉中多羥基酚類及其衍生物的總稱，主要包括兒茶素類、黃酮類、花青素和酚酸類物質(zhì)[1]。其中，兒茶素類占茶多酚總量的60%～80%，是茶多酚中含量最高的組分，具有許多生理活性如抗氧化、抗腫瘤、抗衰老、減肥等[2]。而茶多酚的多酚羥基結(jié)構(gòu)極性較大，水溶性強(qiáng)而脂溶性差，且其自身的物化穩(wěn)定性差，含有不愉悅的味道，極大地限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用。

磷脂結(jié)構(gòu)主要由甘油骨架、極性基團(tuán)和不同長(zhǎng)度和飽和度的脂肪酸鏈組成。根據(jù)磷脂極性基團(tuán)不同可將磷脂分為磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇等類別[3]。磷脂是維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的重要組成部分，也是新陳代謝不可或缺的營(yíng)養(yǎng)元素，其具備廣泛的生物學(xué)功能，諸如活化細(xì)胞，維持代謝與荷爾蒙分泌均衡，增強(qiáng)人體免疫力等[4]。由于磷脂同時(shí)含有親水相和親油相基團(tuán)，所以可以用來(lái)包封、運(yùn)載和緩釋水溶性、油溶性和兩親性物質(zhì)[5]。將茶多酚與磷脂在一定條件下復(fù)合，得到天然活性成分磷脂復(fù)合物，既改變了茶多酚的理化性質(zhì)，增加了其脂溶性，掩蓋不愉悅風(fēng)味，還提高其穩(wěn)定性以及在不同環(huán)境下抗氧化緩釋性能。

魚(yú)松是用魚(yú)類肌肉制成的金黃色絨毛狀調(diào)味干制品[6]。魚(yú)松產(chǎn)品含有較多不飽和脂肪酸類物質(zhì)，極易氧化生成腥臭味小分子化合物，影響產(chǎn)品保質(zhì)期。本試驗(yàn)針對(duì)上述問(wèn)題合成了磷脂茶多酚復(fù)合物（Tea polyphenol phospholipids complex，TPP-PL），測(cè)定其溶解性、緩釋性、抗氧化性。研究磷脂茶多酚復(fù)合物對(duì)貯藏期內(nèi)魚(yú)松過(guò)氧化值和魚(yú)松脂肪酸成分的影響，以延長(zhǎng)魚(yú)松的保質(zhì)期，擴(kuò)大茶多酚的應(yīng)用途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶多酚（純度98%，主要成分EGCG為50.4%），杭州禾田生物技術(shù)有限公司；磷脂酰膽堿（96%），美國(guó)Avanti Polar Lipids公司；膽固醇，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；乙酸乙酯、無(wú)水乙醇、氯仿，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1200高效液相色譜系統(tǒng)，美國(guó)Agilent公司；PHSJ-4A型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)，中國(guó)上海雷磁公司；Sanorius BS110S分析天平，北京賽多利斯公司；RE52-05旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮公司；T6紫外分光光度計(jì)，美國(guó)Thermo公司；MDF-382E超低溫冰箱，日本Sanyo公司；Milliplus 2150超純水處理系統(tǒng)，美國(guó)Millipore公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 磷脂茶多酚復(fù)合物制備 稱量大豆卵磷脂30 g于燒瓶中，加入到500mL氯仿中攪拌溶解；同時(shí)溶解20 g茶多酚于500mL乙醇中；將茶多酚乙醇溶液倒入燒瓶中，邊攪拌邊逐漸升溫至40℃后攪拌2 h，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)減壓蒸餾除去有機(jī)溶劑直至成膜，加入50mL含有10%蔗糖凍干保護(hù)劑的0.01mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH 6.5），繼續(xù)旋蒸使膜溶解并充分水合，得到磷脂茶多酚復(fù)合物混懸液。將其轉(zhuǎn)移至容量瓶中，于-80℃快速冷凍2 h，至于真空冷凍干燥機(jī)干燥過(guò)夜，凍干后將樣品置于4℃保存。

1.3.2 分配系數(shù)K值 稱取0.1 g茶多酚和磷脂茶多酚復(fù)合物，分別加入一定量的超純水和非極性溶劑（氯仿或乙酸乙酯）使樣品充分溶解，再向其中加入等體積的非極性溶劑和超純水，劇烈振蕩后靜置，茶多酚和磷脂茶多酚復(fù)合物樣品在兩相中自動(dòng)分配，分離兩相溶液并定容至100mL，使用液相色譜測(cè)定兩相中茶多酚含量，以非水相中茶多酚含量與水相中茶多酚含量之比值即為K值。

1.3.3 體外釋放率 茶多酚的體外釋放模擬參照Fang等[7]的試驗(yàn)方案，具體步驟：取5mL磷脂茶多酚復(fù)合物樣品，加入至經(jīng)預(yù)處理的10 ku透析袋中，扎好透析袋口并置于含100mL PBS等滲溶液（0.05mol/L，pH 6.0）的燒杯中，于（37±0.5）℃下恒溫水浴低速攪拌。分別于0.1，0.2，0.4，0.8，1，2，4，6，8，10，12 h 取 5mL 透析液，以 PBS 溶液作為對(duì)照測(cè)定波長(zhǎng)275 nm下吸光度，計(jì)算各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的茶多酚釋放量。

1.3.4 抗氧化

1.3.4.1 DPPH清除自由基 將茶多酚和茶多酚磷脂復(fù)合物分別稀釋成4個(gè)質(zhì)量濃度25，50，75，100μg/mL，各取0.1mL樣品加入至2mL無(wú)水乙醇中，然后向其加入60μg/mL的DPPH溶液1.5 mL，充分混合均勻后放置暗室反應(yīng)30min。反應(yīng)結(jié)束后置于波長(zhǎng)517 nm下測(cè)定吸光度，由式（1）計(jì)算得到樣品的清除自由基活性：

式中，A——空白樣品與DPPH反應(yīng)后的吸光值；B——樣品經(jīng)上述反應(yīng)后的吸光值；C——空白樣品與無(wú)水乙醇的混合物的吸光值。

1.3.4.2 FRAP抗氧化 制備10mmol/L TPTZ溶解在 40 mmol/L的鹽酸溶液，20 mmol/L FeCl3·6H2O 溶液，0.3mol/L醋酸緩沖液（pH 3.6），并將三者按1∶1∶10混合均勻后即得到FRAP試劑。將茶多酚和磷脂茶多酚復(fù)合物分別配制4個(gè)質(zhì)量濃度20，30，40，50μg/mL，取 4.8mL FRAP 試劑與 0.2 mL樣品混合置于37℃反應(yīng)10min。待反應(yīng)結(jié)束后于593 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。

1.3.5 魚(yú)松樣品的制備 魚(yú)松的制備參照汪小玲等[6]工藝并做改進(jìn)，將淡水鯽魚(yú)清洗去除內(nèi)臟置于高壓蒸汽鍋內(nèi)蒸30min，冷卻后去除魚(yú)皮、脂肪及刺，加生姜料酒煮制去腥后用壓榨機(jī)壓榨，分成3等份，一份不做處理，另外兩份分別加入茶多酚、磷脂茶多酚復(fù)合物，分別搓松后加食鹽、白砂糖及豌豆粉文火炒松直至含水量在12%左右，旺火炒酥后冷卻罐裝貯藏備用。

1.3.6 過(guò)氧化值（POV）測(cè)定 過(guò)氧化值的測(cè)定參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T5538-2005，單位為meq/kg。脂質(zhì)氧化的初始產(chǎn)物是過(guò)氧化物，過(guò)氧化物極不穩(wěn)定，氧化能力強(qiáng)，能將碘化鉀氧化成游離碘，根據(jù)析出碘量計(jì)算過(guò)氧化值。

1.3.7 脂肪酸檢測(cè)

1.3.7.1 甲酯化 甲酯化參照Folch等[8]方法，將0.1 g魚(yú)松樣品與2mL的NaOH-MeOH溶液（0.5 mol/L）混合后振蕩搖勻，在65℃的水浴鍋中加熱30min，取出后冷卻至室溫，再加入2mL的BF3-MeOH溶液，振蕩混勻，在65℃水浴鍋中繼續(xù)加熱3min，取出并自然冷卻后加入2mL正己烷提取，同時(shí)加入飽和NaCl溶液稀釋，取出上清液后在其中加入少量無(wú)水硫酸鈉，取上清液用于氣相色譜分析。

1.3.7.2 氣相色譜條件 色譜柱：HP-88毛細(xì)管色譜柱（30m × 0.25mm，0.2 μm）；載氣：高純氮?dú)?；恒流?.65mL/min；進(jìn)樣量：1 μL；分流比：40∶1；進(jìn)樣口溫度：250℃；升溫程序：初溫50℃，保持2min，以4℃/min升至220℃維持15min。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果表示為平均數(shù)±SD，采用WPS Excel軟件分析數(shù)據(jù)，顯著性分析用SPSS進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，平均數(shù)間的顯著性差異分析P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 親水親脂分配系數(shù)K值

茶多酚是白色無(wú)定形結(jié)晶狀物質(zhì)，易溶于水、乙醇、甲醇、乙酸乙酯和丙酮，難溶于氯仿和正丁醇，脂溶性較差，影響了抗氧化效果和油脂外觀，限制了其在油脂食品方面的應(yīng)用[9]。合成的磷脂茶多酚復(fù)合物的親水親脂性大小可通過(guò)親水親脂分配系數(shù)K值得出，K值越大脂溶性越強(qiáng)，越小則水溶性較好[10]。由表1可知，在氯仿-水體系中，茶多酚具有良好的水溶性，難溶于氯仿故K值較?。?.002）遠(yuǎn)低于磷脂茶多酚復(fù)合物的K值（150.8），說(shuō)明與磷脂復(fù)合的茶多酚親脂性得到很大的提高，茶多酚在乙酸乙酯-水體系中的K值（4.574）較氯仿-水體系大，是由于茶多酚可溶于乙酸乙酯，從乙酸乙酯相和水相EGCG含量可以看出茶多酚溶于乙酸乙酯能力強(qiáng)于溶于水的能力，而磷脂茶多酚復(fù)合物的親水性明顯減小，其K值（21.33）遠(yuǎn)大于茶多酚（4.574），再次證明磷脂茶多酚復(fù)合物親脂性較茶多酚強(qiáng)?？梢酝茢喑隽字瓒喾幽芘c含有較多脂肪酸的魚(yú)松緊密結(jié)合，發(fā)揮茶多酚的抗氧化作用，具有良好的應(yīng)用前景。

表1 茶多酚和磷脂茶多酚復(fù)合物在兩相溶劑中的分配系數(shù)比較Table1 The performance comparison of TPP and TPP-PL in the hydrophilic and hydrophobic solvent system

2.2 體外釋放率

提高茶多酚在魚(yú)松中的緩釋性是本試驗(yàn)制備磷脂茶多酚復(fù)合物的主要目標(biāo)之一。由圖1可知，茶多酚及磷脂茶多酚在體外釋放模擬試驗(yàn)中趨勢(shì)大致相同，均為前5 h茶多酚的釋放量上升較快，之后釋放量上升較慢并趨于穩(wěn)定，而磷脂茶多酚樣品的茶多酚釋放量遠(yuǎn)低于茶多酚樣品，25 h后茶多酚樣品體外茶多酚釋放量高于磷脂茶多酚60%以上。由此可知，磷脂包覆茶多酚形成脂質(zhì)體后可延長(zhǎng)茶多酚在魚(yú)松中的保留時(shí)間，在魚(yú)松組織結(jié)構(gòu)間隙具有緩慢釋放茶多酚的特性，對(duì)延長(zhǎng)魚(yú)松的貯藏期具有重要作用。

2.3 抗氧化

圖1 茶多酚和磷脂茶多酚復(fù)合物體外釋放率Fig.1 The releasing rates of TPP and TPP-PL

通過(guò)DPPH自由基清除能力和鐵離子還原能力試驗(yàn)，可分別測(cè)試茶多酚和磷脂茶多酚復(fù)合物在有機(jī)相和水相環(huán)境下的抗氧化能力。茶多酚復(fù)合物是由一個(gè)或者多個(gè)帶有羥基的苯環(huán)組成，羥基通過(guò)貢獻(xiàn)出氫原子，形成穩(wěn)定的苯氧基自由基，從而猝滅體系中游離自由基的存在[11]。

從圖2可以看出茶多酚和磷脂茶多酚復(fù)合物的體外抗氧化活性的大小與其質(zhì)量濃度有關(guān)，DPPH自由基清除率隨抗氧化劑質(zhì)量濃度的提高而增加，并且呈一定的線性關(guān)系。相同質(zhì)量濃度下茶多酚的抗氧化能力略優(yōu)于磷脂茶多酚復(fù)合物，差異并不顯著?？寡趸瘎┵|(zhì)量濃度為50，75，100，125μg/mL時(shí)，茶多酚的DPPH自由基清除能力為58.9% ±3.63%，67.3%±4.64%，72.1%±5.61%和75.2%±4.59%，而磷脂茶多酚復(fù)合物在相同質(zhì)量濃度下的清除能力為51.7%±2.44%，59.2%±2.54%，63.7%±2.87%和67.5%±2.95%。Zou等[12]報(bào)道了一種使用乙醇注射和動(dòng)態(tài)高壓微流法制備茶多酚脂質(zhì)體，其DPPH自由基清除率與未包覆茶多酚相當(dāng)。Peres等[13]發(fā)現(xiàn)兒茶素與經(jīng)阿拉伯膠麥芽糊精包埋的兒茶素具有相同的DPPH自由基清除能力，表明阿拉伯膠麥芽糊精包埋的方法保留了兒茶素的抗氧化活性。磷脂復(fù)合能保持茶多酚的抗氧化能力，主要由于DPPH自由基清除能力測(cè)定環(huán)境為無(wú)水乙醇，而磷脂茶多酚復(fù)合物在乙醇溶劑中易發(fā)生破乳現(xiàn)象，使被包裹的茶多酚分子暴露在DPPH反應(yīng)體系中。

在pH值較低時(shí)，無(wú)色的三價(jià)鐵復(fù)合物Fe3+-三吡啶三吖嗪（Tripyridyl-triazine，TPTZ）通過(guò)茶多酚抗氧化劑的供電子作用而轉(zhuǎn)變成藍(lán)色的二價(jià)鐵復(fù)合物，并且在593 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，根據(jù)吸光值的大小可以判斷出抗氧化能力的強(qiáng)弱[14]。茶多酚和磷脂茶多酚復(fù)合物的鐵離子還原能力均屬于濃度依賴型，且其抗氧化能力與質(zhì)量濃度成正比。由圖3可見(jiàn)，在抗氧化劑質(zhì)量濃度為20，30，40，50μg/mL 時(shí)，經(jīng) FRAP 試驗(yàn)茶多酚的鐵離子還原能力為（438.9±26.6），（720.1±47.8），（827.6±56.3），（930.4 ± 66.9） μmol/mL；磷脂茶多酚復(fù)合物的鐵離子還原能力為（265.4±14.7），（485.3±27.6），（596.9±321.1），（710.8±32.3） μmol/mL。經(jīng)過(guò)脂質(zhì)體包封之后，茶多酚的鐵離子還原能力顯著降低。Arts等[15]曾報(bào)道了綠茶組分因?yàn)榕c酪蛋白和白蛋白作用，遮蔽了其抗氧化活性。Donsì等[16]發(fā)現(xiàn)白蘆藜醇和姜黃素經(jīng)固體油脂基質(zhì)包封后，鐵離子還原能力也有所降低。造成這種差異的主要原因是茶多酚包覆在脂質(zhì)體水相中，因?yàn)闆](méi)有破乳處理，其供電子能力受到磷脂雙分子的干擾，進(jìn)而導(dǎo)致磷脂茶多酚復(fù)合物的鐵離子還原能力降低。

圖2 不同質(zhì)量濃度的茶多酚和磷脂茶多酚復(fù)合物體外DPPH自由基清除能力Fig.2 The radical scavenging activities of TPP and TPP-PL in different mass concentrations

圖3 不同質(zhì)量濃度的茶多酚和磷脂茶多酚復(fù)合物FRAP抗氧化值Fig.3 The FRAP values of TPP and TPP-PL in different mass concentrations

2.4 脂質(zhì)過(guò)氧化值

過(guò)氧化物是脂質(zhì)氧化酸敗的初始產(chǎn)物，通常以過(guò)氧化物的產(chǎn)生作為脂質(zhì)氧化酸敗的開(kāi)始。過(guò)氧化物與碘化鉀作用，生成游離碘，以硫代硫酸鈉溶液滴定，以滴定的體積計(jì)算生成過(guò)氧化物的含量。當(dāng)魚(yú)松中含有茶多酚等抗氧化劑時(shí)，其生成的過(guò)氧化物的量就減少，即POV值降低，以POV值的高低判定抗氧化劑性能的優(yōu)劣。由圖4可知，前5 d茶多酚及磷脂茶多酚均能有效抑制魚(yú)松脂肪氧化酸敗，POV值基本保持為0，貯藏5 d后POV值均開(kāi)始上升，添加磷脂茶多酚復(fù)合物的魚(yú)松過(guò)氧化值上升較添加茶多酚的魚(yú)松過(guò)氧化值上升的緩慢。這驗(yàn)證了磷脂茶多酚的緩釋性，磷脂茶多酚，復(fù)合物能長(zhǎng)時(shí)間保留在魚(yú)松中持續(xù)釋放茶多酚，抑制魚(yú)松脂肪氧化酸敗，另有研究表明磷脂本身具有還原作用，能修復(fù)被氧化的兒茶素分子[17]，所以磷脂茶多酚復(fù)合物延長(zhǎng)魚(yú)松貯藏期的效果強(qiáng)于茶多酚單體。

圖4 不同貯藏期內(nèi)茶多酚和磷脂茶多酚復(fù)合物對(duì)魚(yú)松過(guò)氧化值的影響Fig.4 The effect of TPP and TPP-PL on the POV value of freshwater fish floss during storage

2.5 脂肪酸成分變化

脂肪酸成分的測(cè)定需先進(jìn)行甲酯化，把高沸點(diǎn)、不易氣化的脂肪酸酯水解或皂化成脂肪酸和甘油，再使脂肪酸與甲醇反應(yīng)生成相應(yīng)脂肪酸甲酯，變成低沸點(diǎn)易氣化的物質(zhì)，從而降低氣化溫度，有利于氣相色譜法分離，并逐一測(cè)定其組成及含量[18]，脂肪酸甲酯的變化對(duì)應(yīng)脂肪酸的變化。經(jīng)測(cè)定，魚(yú)肉原料、魚(yú)松（未處理）、TPP魚(yú)松及TPPPL魚(yú)松的脂肪酸成分及相對(duì)含量見(jiàn)表2。由結(jié)果可知，4種不同樣品中均檢出23種脂肪酸，且脂肪酸種類相同，包括：9種飽和脂肪酸，其中含量最多的均為棕櫚酸；6種單不飽和脂肪酸，含量最多的均為油酸；8種多不飽和脂肪酸，含量最多的均為亞油酸，雖然原料魚(yú)為淡水魚(yú)但二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）均有檢出。原料魚(yú)炒制成魚(yú)松后，9種飽和脂肪酸含量均有增加，硬脂酸含量增加最為顯著，增加了23.28%，在不飽和脂肪中除了花生一烯酸含量略有升高，其它不飽和脂肪酸含量均有減少，其中亞油酸含量變化最為顯著，減少了11.02%?？赡苁怯椭械奶?xì)滏I鍵能較小，容易斷裂形成自由基，不飽和雙鍵的存在會(huì)使碳氧鍵更容易斷裂成自由基，魚(yú)松炒制過(guò)程中各種加熱處理容易導(dǎo)致不飽和脂肪酸碳?xì)滏I獲得能量產(chǎn)生自由基被氧化[19]，部分不飽和脂肪酸可轉(zhuǎn)化為飽和脂肪酸。相比魚(yú)肉原料，魚(yú)松（未處理）、TPP魚(yú)松及TPP-PL魚(yú)松中的飽和脂肪酸有所增加，不飽和脂肪酸相應(yīng)減少，其中加入茶多酚的魚(yú)松的硬脂酸含量增加了12.05%，遠(yuǎn)大于磷脂茶多酚魚(yú)松的硬脂酸增量（1.46%），不飽和脂肪亞油酸含量減少了8.26%，大于磷脂茶多酚魚(yú)松的亞油酸變化（4.29%），說(shuō)明茶多酚及磷脂茶多酚均能抑制魚(yú)松脂肪氧化等反應(yīng)，而磷脂茶多酚保持魚(yú)松脂肪酸成分的效果較茶多酚顯著，磷脂茶多酚能保護(hù)不飽和脂肪酸，減少損失或轉(zhuǎn)化，磷脂茶多酚魚(yú)松中各種脂肪酸含量均與原料魚(yú)相近，磷脂茶多酚魚(yú)松的EPA損失量（0.14%）及DHA損失量（0.23%）分別少于茶多酚魚(yú)松EPA的損失量（0.45%）及DHA損失量（0.72%），而EPA和DHA是人體必需脂肪酸，對(duì)人體細(xì)胞膜功能和基因表達(dá)有重要作用，具有促進(jìn)嬰幼兒大腦發(fā)育，抑制血小板凝集，降血脂，防止動(dòng)脈粥樣硬化及老年癡呆等功效[20]，所以磷脂茶多酚添加到魚(yú)松中不僅能延長(zhǎng)貯藏期而且還能提高魚(yú)松的營(yíng)養(yǎng)功能性。

表2 魚(yú)肉原料、魚(yú)松及抗氧化處理后魚(yú)松的脂肪酸甲酯成分與相對(duì)含量Table2 The composition and relative contents of fatty acid ethyl esters in freshwater fish tissue，fish floss and antioxidant-treated fish floss

（續(xù)表2）

3 結(jié)論

本研究合成了磷脂茶多酚，以茶多酚為對(duì)照，測(cè)定了其親脂親水性、體外茶多酚釋放性、抗氧化性以及對(duì)淡水魚(yú)松過(guò)氧化值及脂肪酸含量的影響。研究表明磷脂茶多酚的合成方法極大的提高了茶多酚脂溶性，消除了茶多酚的局限性，擴(kuò)大了茶多酚應(yīng)用范圍。磷脂茶多酚因其親脂性、緩釋性和抗氧化性可以長(zhǎng)久保存于魚(yú)松中發(fā)揮抗氧化的作用，可有效提高魚(yú)松的貯藏期，保護(hù)魚(yú)松中EPA和DHA等不飽和脂肪酸營(yíng)養(yǎng)成分，解決了傳統(tǒng)魚(yú)松保質(zhì)期短等問(wèn)題，為茶多酚在油脂食品等方面的應(yīng)用提供了依據(jù)。