陳 蘭 ，郭麗燕，張 濤*，張閃閃，顧若君，張跟喜，謝愷舟，王金玉

（1.揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009；2.教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國際合作聯(lián)合實驗室，江蘇揚(yáng)州 225009；3.無錫三鄉(xiāng)岸農(nóng)業(yè)生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司，江蘇無錫 214100）

隨著科技的飛速發(fā)展，分子生物學(xué)領(lǐng)域發(fā)展出多種測定基因表達(dá)量的方法，如半定量PCR 技術(shù)、Northern blot 技術(shù)、Western blot 技術(shù)、全基因組測序等，以上方法能精確檢測基因表達(dá)量，但操作要求嚴(yán)格，成本較高。實時熒光定量PCR 技術(shù)是20 世紀(jì)末發(fā)展的新型核酸定量分析技術(shù)，具有靈敏度高、重復(fù)性好、特異性強(qiáng)和準(zhǔn)確性高等優(yōu)點[1-3]，該技術(shù)已被廣泛用于基因表達(dá)的相關(guān)研究。然而，RT-qPCR 結(jié)果的準(zhǔn)確性一定程度上取決于內(nèi)參基因的選擇，內(nèi)參基因是為維持細(xì)胞基本生命活動而時刻都在表達(dá)的基因，其表達(dá)水平受環(huán)境因素影響較小，在個體各個生長階段的大多數(shù)或幾乎全部組織中持續(xù)表達(dá)，或變化很小。在運用RT-qPCR 技術(shù)分析靶基因的表達(dá)水平時，需要利用合適的內(nèi)參基因進(jìn)行校正，彌補(bǔ)因不同樣本在RNA 提取質(zhì)量及總量、逆轉(zhuǎn)錄效率和PCR 擴(kuò)增效率等可能出現(xiàn)的誤差，以期能夠準(zhǔn)確反應(yīng)靶基因間的表達(dá)差異性[4-5]。因此，內(nèi)參基因選擇正確與否直接關(guān)系到RT-qPCR 結(jié)果的準(zhǔn)確性，為此，Vandesompele 等[6]、Andersen 等[7]、Pfaffl 等[8]分別開發(fā)geNorm、NormFinder、BestKeeper 軟件和Ct 值分析法對內(nèi)參基因穩(wěn)定性進(jìn)行評價。

3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、beta-肌動蛋白（β-actin）、18S 核糖體RNA（18S rRNA）和核糖體蛋白S2（Ribosomal protein S2，RPS2）等均是在不同動物RT-qPCR 研究中常用的內(nèi)參基因[9-11]。目前，利用RT-qPCR 檢測肉鴿基因表達(dá)的研究日益增多，然而有關(guān)肉鴿內(nèi)參基因選擇與穩(wěn)定性的研究鮮有報道。因此，本實驗利用RTqPCR 方法檢測28 日齡乳鴿不同組織中常用內(nèi)參基因的表達(dá)，采用geNorm、NormFinder 和BestKeeper 軟件及Ct 值分析法對常見內(nèi)參基因在肉鴿組織中的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行評估，篩選出用于肉鴿組織表達(dá)研究的最佳內(nèi)參基因。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 實驗動物為無錫三鄉(xiāng)岸生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司相同飼養(yǎng)條件下的白羽王鴿，選取28 日齡母鴿3 只，采取心、肝、脾、肺、腎、胸肌、腿肌、腹脂和卵巢組織，于裝有RNA wait 樣品保存液的無酶管中暫存，隔夜放置后于超低溫冰箱（-70℃）長期保存待用。反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒和RNA wait 樣品保存液均購自天根生化科技（北京）有限公司，熒光定量PCR 板（96 孔）購自美國ABI 公司，RNA free water、Trizol、DEPC、PCR 管、異丙醇、無水乙醇、無酶管、無酶槍頭、離心管等均購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 引物合成 根據(jù)GenBank 上的原鴿（Columba livia）GAPDH（登錄號：NM_001282835.1），β-actin（登錄號：XM_005504502.2）、18SrRNA（登錄號：AF173630.1）和RPS2（登錄號：XM_021300650.1）基因mRNA 序列，使用Premier 6.0 跨內(nèi)含子分別設(shè)計1 對RT-qPCR 引物，引物均由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列信息見表1。

表1 熒光定量PCR 引物

1.3 總RNA 提取及cDNA 合成 使用Trizol 法提取心、肝、脾、肺、腎、胸肌、腿肌、腹脂、卵巢組織的總RNA，Nano-Drop-1000 微量核酸測定儀檢測總RNA 純度和濃度，-70℃保存待用。反轉(zhuǎn)錄按照天根生化科技公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作程序進(jìn)行，體系為50 μL：5×FastKing-RT SuperMix 10μL，加入1 500 ngRNA 模板，加入RNA-Free ddH2O 補(bǔ)足至50 μL，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溫度為42℃ 15 min 去除基因組及反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，95℃ 3min酶滅活，然后置于-20℃保存。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及RT-qPCR 檢測 使用SYBR Green染料熒光定量試劑盒進(jìn)行定量分析，取一定量cDNA模板按照10 倍梯度稀釋成5 個梯度，以5 個梯度濃度的cDNA 為模板進(jìn)行RT-qPCR 檢測，利用ABI 7500 Software v2.3 軟件分析數(shù)據(jù)，生成基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線。隨后利用RT-qPCR 檢測4 個基因在不同組織中的表達(dá)，20 μL 反應(yīng)體系：2×SuperReal Color PreMix 10μL，正反向引物各0.6 μL（濃度為10 μmol/μL），50×ROXReferebnce Dye 0.4 μL，cDNA 模板2 μL（濃度為：500ng/μL），RNase-free ddH2O 補(bǔ) 足 到20 μL。RTqPCR 兩步法反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性15 min；95℃變性10 s，60℃退火30 s，40 個循環(huán)。

1.5 統(tǒng)計分析 采用2-△ct（△Ct=各樣本最大Ct 值-各樣本最小Ct 值）方法計算相對表達(dá)量，利用geNorm、NormFinder 和BestKeeper 程序以及Ct 值差異比較分析法分析4 個內(nèi)參基因在肉鴿不同組組織中Ct 值變化，綜合評估表達(dá)穩(wěn)定性。GeNorm 軟件分析是先將2-△ct方法計算出內(nèi)參基因相對定量數(shù)據(jù)，制作Excel表格，然后將其導(dǎo)入geNorm 程序中進(jìn)行計算，獲得每個內(nèi)參基因穩(wěn)定性的M 值來判定出較好的內(nèi)參基因。NormFinder 程序的計算分析方法與GeNorm 程序相似，均是采用2-△ct方法計算出內(nèi)參基因相對定量數(shù)據(jù)，導(dǎo)入NormFinder 程序，獲得內(nèi)參基因表達(dá)的穩(wěn)定性M 值。BestKeeper 程序是采用的公式內(nèi)置的形式，主要是計算每個內(nèi)參基因之間產(chǎn)生配對的標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）、變異系數(shù)（CV）和內(nèi)參基因Ct 值的幾何平均數(shù)（GM）產(chǎn)生BestKeeper 指數(shù)，判定標(biāo)準(zhǔn)：SD 值和CV 值越小，內(nèi)參基因的穩(wěn)定性越好。Ct 值分析法是采用同一內(nèi)參基因在不同組織中通過RT-qPCR 獲得的相對定量數(shù)據(jù)，計算出△ct 值進(jìn)行判定（判定標(biāo)準(zhǔn)：△ct 值越小，表達(dá)越穩(wěn)定）。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA 檢測 利用1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA 質(zhì)量，結(jié)果可見條帶清晰，說明RNA 完整性良好（圖1）。

2.2 PCR 擴(kuò)增結(jié)果 利用已設(shè)計好的GAPDH、β-actin、18S rRNA和RPS2基因的引物，用逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，所得產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖2。在96、131、145 bp 處檢測到特異性條帶，條帶長度與預(yù)期相符，條帶清晰無拖尾，說明引物特異性良好，模板cDNA 完整性好。

2.3 各內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線分析 熔解曲線結(jié)果顯示（圖3），4 個內(nèi)參基因均為單峰，Tm 兩側(cè)均無雜峰；由表2 可知，4 個基因回歸系數(shù)R2均大于0.99，擴(kuò)增效率介于96%～111%，Ct 值和起始模板濃度對數(shù)都呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，表明所設(shè)計引物特異性好，無引物二聚體、非特異性聚合及基因組污染而產(chǎn)生的非目的熒光。

2.4 內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性分析 GeNorm 軟件分析，是先將2-△ct方法計算出內(nèi)參基因相對定量數(shù)據(jù)，制作Excel 表格，然后將其導(dǎo)入geNorm 程序中進(jìn)行計算，獲得每個內(nèi)參基因穩(wěn)定性的M 值來判定出較好的內(nèi)參基因（軟件判定標(biāo)準(zhǔn)：M 值越小內(nèi)參基因越穩(wěn)定，反之穩(wěn)定性就越差）。由圖4 所示，4 個內(nèi)參基因在組織表達(dá)的穩(wěn)定性各異，表達(dá)穩(wěn)定性由高到低依次為18S rRNA＞RPS2＞β-actin＞GAPDH。

如圖5 所示，NormFinder 軟件分析4 個內(nèi)參基因在白羽王鴿的不同組織中表達(dá)穩(wěn)定性M 值依次為18S rRNA＞RPS2＞β-actin＞GAPDH，根據(jù)NormFinder 程序的判定方法（M 值越小基因表達(dá)量越穩(wěn)定）篩選出最佳的內(nèi)參基因是18S rRNA，RPS2次之，β-actin的表達(dá)穩(wěn)定性高，而GAPDH最差。

如表3 所示，Bestkeeper 分析內(nèi)參基因在鴿子各組織中的表達(dá)穩(wěn)定性由高到低依次為RPS2＞18S rRNA＞βactin＞GAPDH，通過BestKeeper 程序計算，可判定RPS2內(nèi)參基因的表達(dá)最穩(wěn)定，18S rRNA次之，β-actin的表達(dá)穩(wěn)定性高，而表達(dá)穩(wěn)定性最差的是GAPDH。此分析結(jié)果與GeNorm 軟件分析的結(jié)果一致。

內(nèi)參基因分析結(jié)果顯示，18S rRNA、RPS2、β-actin和GAPDH的△ct 值分別為1.83、2.47、3.74、5.22。通過Ct 值分析法可判定18S rRNA基因表達(dá)穩(wěn)定性最強(qiáng)，RPS2次之，表達(dá)穩(wěn)定性最差的是GAPDH。

表2 內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、回歸系數(shù)R2 和擴(kuò)增效率

3 討 論

目前，實時熒光定量PCR 技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)的定量研究，為減小偏差，需要選用合適的管家基因?qū)Π谢蜻M(jìn)行校正。Lossos 等[12]研究顯示，目前還沒有能夠適用于各種細(xì)胞類型、不同組織的內(nèi)參基因。在肉鴿中，尚未出現(xiàn)內(nèi)參基因篩選到的相關(guān)報道。本研究發(fā)現(xiàn)，不同的分析程序得出的結(jié)果有所差異。其中，采用geNorm 程序分析，結(jié)果顯示穩(wěn)定性最高的內(nèi)參基因為18S rRNA；NormFinder 程序的分析原理與geNorm 程序相似，其分析結(jié)果一致，均表明18S rRNA穩(wěn)定性最佳；利用BestKeeper 軟件進(jìn)行分析，結(jié)果表明RPS2基因表達(dá)最穩(wěn)定，Ct 值分析法結(jié)果表明18S rRNA的△ct 值最小，穩(wěn)定性最強(qiáng)，與geNorm、NormFinder 軟件分析結(jié)果一致。

表3 Bestkeeper 分析內(nèi)參基因在鴿子各組織中的表達(dá)穩(wěn)定性的相關(guān)參數(shù)

Faccioli 等[13]研究表明利用單個管家不能保證一個公正的結(jié)果，由于不存在適合于每一個實驗條件的標(biāo)準(zhǔn)基因，因此還需要在計劃實驗的特定要求上驗證每一個候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性，篩選出一套最佳的內(nèi)參基因，才能得出真實可靠的定量數(shù)據(jù)。楊顯英等[14]在評估小鼠卵巢發(fā)育過程中內(nèi)參基因時發(fā)現(xiàn)，GAPDH和β-actin在小鼠的卵巢發(fā)育過程中能夠穩(wěn)定表達(dá)，是最佳的內(nèi)參候選基因組合。劉圓等[15]利用RT-qPCR 技術(shù)對茶樹在不同氮濃度處理條件下進(jìn)行定量分析時發(fā)現(xiàn)，GAPDH+β-actin組合穩(wěn)定性最佳，可作為研究茶樹基因表達(dá)的內(nèi)參基因。張蓉等[16]采用實時熒光定量PCR技術(shù)對海蘭灰蛋雞的內(nèi)參基因進(jìn)行定量分析，篩選出最佳的內(nèi)參基因組合為RPS2+β-actin基因。張蓉等[17]在不同GluN 處理下產(chǎn)蛋后期籠養(yǎng)蛋雞基因表達(dá)中，能夠穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因是RPS2和TBP基因。本研究通過4 種內(nèi)參基因?qū)Ｓ迷u估軟件篩選在鴿同一時期不同組織中穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因，BestKeeper 程序分析顯示RPS2基因穩(wěn)定性最好，而geNorm、NormFinder和Ct 值分析法分析顯示18S rRNA基因表達(dá)穩(wěn)定性最強(qiáng)。因此，建議在白羽王鴿不同組織RT-qPCR 檢測時RPS2+18S rRNA為最佳內(nèi)參基因組合。無論是用單個內(nèi)參基因還是用多個內(nèi)參基因?qū)蚨糠治?，篩選出合適的內(nèi)參基因是得到可靠定量數(shù)據(jù)的重要前提，本實驗結(jié)果為課題組今后開展白羽王鴿基因表達(dá)分析提供了理論參考。

4 結(jié) 論

本實驗結(jié)果顯示，GAPDH基因穩(wěn)定性差，不適合作為鴿子的內(nèi)參基因；而RPS2基因和18s RNA 的穩(wěn)定性均強(qiáng)，推薦RPS2+18sRNA的內(nèi)參基因組合用于鴿子不同組織基因表達(dá)的研究。