李 博， 馬 俊， 王麗萍， 許 鳴

1.廣東省第二人民醫(yī)院消化科，廣東 廣州 510317； 2.佛山市第二人民醫(yī)院消化科

肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)的激活及轉(zhuǎn)化，是肝纖維化發(fā)病的中心事件。干擾和阻斷HSC內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)，抑制HSC的活化是肝纖維化治療策略的重要環(huán)節(jié)[1]。HSC表達(dá)的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NADPH oxidase，NOX)產(chǎn)生的活性氧(reactive oxygen species，ROS)介導(dǎo)了各種促肝纖維化因子在HSC內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)[2]。黃芩素又稱黃芩苷元(Baicalein，BAE)是從唇形科植物黃芩(Radix Scutellariae)的干燥根中提取的黃酮類化合物，有文獻(xiàn)報(bào)道黃芩素可通過(guò)抑制HSC的活化，減少膠原的產(chǎn)生而發(fā)揮抗肝纖維化作用，但黃芩素抗纖維化的機(jī)制如何？本研究從黃芩素的抗氧化活性入手，旨在觀察黃芩素對(duì)HSC中NOX活性及ROS的影響，以探索黃芩素抗肝纖維化的作用靶點(diǎn)及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料大鼠肝星狀細(xì)胞株(HSC-T6)購(gòu)自上海復(fù)祥生物科技有限公司，為永生化細(xì)胞，具有活化HSC的表型；胎牛血清購(gòu)自吉泰生物公司；RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；鼠抗ɑ-SMA單克隆抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；NOX活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)公司；ROS檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)與分組：在質(zhì)量濃度為100 g/L胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，在37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為50%的CO2及飽和濕度下培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)為80%～90%密度時(shí)，傳代至6孔板或15 cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。待細(xì)胞貼壁后除對(duì)照組和TGF-β1刺激組外，其他加藥組分別加入各終濃度的黃芩素預(yù)處理HSC-T6細(xì)胞30 min后，再加入含TGF-β1(5 μg/L)的DMEM培養(yǎng)液處理細(xì)胞48 h。實(shí)驗(yàn)共分6組：A組：空白對(duì)照組；B組：TGF-β1刺激組；C組：TGF-β1+125 nmol/L黃芩素組；D組：TGF-β1+250 nmol/L黃芩素組；E組：TGF-β1+500 nmol/L黃芩素組；F組：TGF-β1+1 000 nmol/L黃芩素組。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖率：收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MGC803細(xì)胞，以每孔5×103個(gè)接種細(xì)胞于細(xì)胞培養(yǎng)板中，按分組加藥處理后加入20 μl MTT 溶液，孵育4 h，加入150 μl DMSO 震蕩10 min，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度值(absorbance，A值)。

1.2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)α-SMA表達(dá)：取出細(xì)胞爬片，洗滌，4%多聚甲醛固定30 min，滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，加BSA封閉液，滴加適當(dāng)稀釋的一抗，4 ℃過(guò)夜后在37 ℃復(fù)溫45 min，滴加生物素化二抗，DAB顯色：取1 ml蒸餾水，加試劑盒中A、B、C試劑各1滴，混勻加至爬片，室溫顯色，蘇木素輕度復(fù)染。脫水、透明、封片。每組圖片取6個(gè)視野，采取日本OLYMPUS攝像系統(tǒng)和日本MetaMorph/BX41圖像數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)測(cè)定平均光密度值，平均光密度值越大，代表樣本中目的蛋白含量越多。

1.2.4 HSC-T6細(xì)胞NOX酶活性的檢測(cè)：通過(guò)分光光度計(jì)觀察NADPH溶液在340 nm處吸光度值的減少來(lái)探測(cè)NADPH的消耗量，從而分析NOX的酶活性。計(jì)算NADPH消耗總量的摩爾吸光系數(shù)為6.22 L·mmol-1·cm-1，結(jié)果以pmol·min-1·mg-1表示。

1.2.5 免疫熒光染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)：用PBS洗細(xì)胞，加入終濃度為10 μmol/L的 DCFH-DA 500 μl，混勻重懸細(xì)胞，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育 30 min。PBS洗滌3次，再向每管沉淀內(nèi)加入PBS 500 μl重新懸浮細(xì)胞。熒光顯微鏡下射片，熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)分析熒光強(qiáng)度，平均熒光強(qiáng)度表示ROS的相對(duì)含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間均數(shù)比較采用方差分析、t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05為雙側(cè)檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芩素對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)活化的HSC-T6 細(xì)胞增殖的影響MTT 法檢測(cè)顯示，與對(duì)照組相比，經(jīng)TGF-β1 5 μg/L刺激后，HSC-T6細(xì)胞的增殖活性明顯增強(qiáng)(P<0.01)；與TGF-β1刺激組相比，黃芩素處理組HSC-T6增殖能力明顯減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05、0.01，F(xiàn)=37.318)，且呈濃度相關(guān)性。但500 nmol/L、1 000 nmol/L黃芩素處理組抗增殖作用比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)圖1)。

注：A：對(duì)照組；B：TGF-β1刺激組；C：TGF-β1+125 nmol/L黃芩素組；D：TGF-β1+250 nmol/L黃芩素組；E：TGF-β1+500 nmol/L黃芩素組；F：TGF-β1+1 000 nmol/L黃芩素組；與對(duì)照組比較，#P<0.01，與TGF-β1刺激組比較，*P<0.05，**P<0.01。

圖1 黃芩素對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)活化的HSC-T6增殖的影響

Fig1EffectofBaicaleinonproliferationoftheactivationofHSC-T6inducedbyTGF-β1

2.2 黃芩素對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)活化的HSC-T6 細(xì)胞α-SMA表達(dá)的影響免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，TGF-β1處理后，HSC-T6細(xì)胞α-SMA表達(dá)明顯增加(P<0.01)；黃芩素預(yù)處理后，隨著黃芩素濃度的增加,ɑ-SMA表達(dá)逐漸下降，與TGF-β1處理組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)圖2)。

2.3 黃芩素對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)活化的HSC-T6 細(xì)胞NOX活性的影響TGF-β1刺激HSC-T6細(xì)胞后檢測(cè)的NOX活性為(3.05±0.25)pmol·min-1·mg-1，明顯高于對(duì)照組(1.22±0.15)pmol·min-1·mg-1，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。給予125、250、500、1 000 nmol/L黃芩素處理后NOX的活性分別為(2.89±0.35)pmol·min-1·mg-1、(2.55±0.15)pmol·min-1·mg-1、(1.88±0.45)pmol·min-1·mg-1、(1.79±0.45)pmol·min-1·mg-1，顯著低于TGF-β1刺激組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，F(xiàn)=40.367)。而500、1 000 nmol/L黃芩素組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)圖3)。

注：A：對(duì)照組；B：TGF-β1刺激組；C：TGF-β1+125 nmol/L黃芩素組；D：TGF-β1+250 nmol/L黃芩素組；E：TGF-β1+500 nmol/L黃芩素組；F：TGF-β1+1 000 nmol/L黃芩素組；G:各組α-SMA平均光密度值;與對(duì)照組比較，#P<0.01；與TGF-β1刺激組比較，*P<0.05。

圖2 黃芩素抑制TGF-β1誘導(dǎo)活化的HSC-T6細(xì)胞α-SMA表達(dá)(放大200倍);圖3 黃芩素對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)活化的HSC-T6 細(xì)胞NOX活性的影響

Fig2Baicaleininhibitedtheexpressionofα-SMAinHSC-T6cellsinducedbyTGF-β1;Fig3EffectofBaicaleinonNOXactivityofHSC-T6cellsinducedbyTGF-β1

2.4 黃芩素對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)活化的HSC-T6 細(xì)胞內(nèi)ROS的影響TGF-β1刺激HSC-T6后細(xì)胞內(nèi)ROS生成的相對(duì)百分比為(47.25±3.15)%,與對(duì)照組(8.05±3.22)%相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。給予125、250、500、1 000 nmol/L黃芩素預(yù)處理后，HSC-T6后細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)分別為(30.01±3.35)%、(20.06±2.15)%、(18.07±1.45)%、(17.06±2.45)%，較TGF-β1刺激組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)圖4)。

3 討論

HSC是各種原因?qū)е赂卫w維化發(fā)生的最終共同途徑，各種致肝纖維化因素也是以HSC作為靶細(xì)胞。當(dāng)肝臟受到各種損傷時(shí)，HSC活化為具有高度增殖活性和α-SMA表達(dá)陽(yáng)性的肌成纖維細(xì)胞，合成大量細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致肝纖維化發(fā)生[3]。因此，α-SMA的表達(dá)已被認(rèn)為是HSC激活的顯著特征之一。TGF-β是關(guān)鍵的促肝纖維化因子[4]。本實(shí)驗(yàn)中我們觀察到經(jīng)TGF-β1刺激后，HSC-T6細(xì)胞的增殖活性明顯增強(qiáng)，且HSC-T6細(xì)胞中α-SMA表達(dá)升高。

ROS是一類氧衍生的分子，包括超氧化物、羥自由基、烷氧基、過(guò)氧化氫、臭氧等[5]。在炎性反應(yīng)及炎性反應(yīng)后階段，ROS介導(dǎo)了各種促纖維化因子如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)和瘦素(leptin)等在HSC內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)，使HSC持續(xù)激活、增殖、轉(zhuǎn)化，并分泌更多的促纖維化因子，形成惡性循環(huán)，促進(jìn)肝纖維化發(fā)展[6]。

因此，清除過(guò)多的ROS是防治肝纖維化的重要環(huán)節(jié)。NOX是由6個(gè)亞基構(gòu)成的多蛋白復(fù)合體，包括細(xì)胞膜上的催化亞基gp91pohx和調(diào)節(jié)亞基p22pohx及位于細(xì)胞質(zhì)的亞基p47pohx、p40pohx、p67pohx和小G蛋白R(shí)ac，產(chǎn)生ROS，參與信號(hào)傳導(dǎo)、天然免疫等許多生物學(xué)功能[7]。NOX通過(guò)產(chǎn)生ROS介導(dǎo)了TGF-β、TGF-8、PDGF、AngⅡ等促肝纖維化因子在HSC內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)[8]。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中觀察到HSC-T6在TGF-β1作用下細(xì)胞內(nèi)NOX活性、ROS水平較對(duì)照組明顯升高。說(shuō)明TGF-β1能誘導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞中NOX活化，產(chǎn)生的ROS介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)。

黃芩素具有抗病毒、抗炎、抗變態(tài)反應(yīng)、抗氧化、抗凝、清除氧自由基等藥理學(xué)活性。有報(bào)道[9]稱，黃芩素可通過(guò)抑制HSC的活化，減少膠原的產(chǎn)生而發(fā)揮抗肝纖維化作用。本研究發(fā)現(xiàn)，HSC-T6給予黃芩素預(yù)處理后其增殖程度及細(xì)胞內(nèi)α-SMA表達(dá)較TGF-β1刺激組顯著下降。說(shuō)明黃芩素能抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HSC-T6細(xì)胞的增殖與活化。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，黃芩素預(yù)處理的NOX活性及ROS水平較TGF-β1刺激組顯著下降。

注：A：對(duì)照組；B：TGF-β1刺激組；C：TGF-β1+125 nmol/L黃芩素組；D：TGF-β1+250 nmol/L黃芩素組；E：TGF-β1+500 nmol/L黃芩素組；F：TGF-β1+1 000 nmol/L黃芩素組；G:各組ROS表達(dá)水平;與對(duì)照組比較，#P<0.01，與TGF-β1刺激組比較，*P<0.05。

圖4 黃芩素對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)活化的HSC-T6細(xì)胞內(nèi)ROS的影響(免疫熒光染色,放大100倍)

Fig4EffectofBaicaleinonintracellularROSofHSC-T6cellsinducedbyTGF-β1

綜上所述，黃芩素能抑制TGF-β1誘導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞的增殖與活化，其機(jī)制可能與其阻斷TGF-β1導(dǎo)致的HSC-T6細(xì)胞內(nèi)NOX激活，抑制ROS產(chǎn)生，從而阻礙了下游細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步揭示了黃芩素抑制HSC-T6細(xì)胞活化的作用機(jī)制，其對(duì)TGF-β1導(dǎo)致HSC-T6活化并向肌成纖維細(xì)胞分化的下游信號(hào)通路的影響是我們下一步的研究目標(biāo)。