林玩福， 張夏炎， 呂狄亞， 趙沙沙， 曹靜文，郁沙莎 ， 程彬彬 ， 翟笑楓 ， 鄭國銀

1.第二軍醫(yī)大學(xué)中醫(yī)系，上海 楊浦 200433；2.上海長海醫(yī)院，上海 楊浦 200433；3.海軍軍醫(yī)大學(xué)，上海 楊浦 200433

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我國最常見的惡性腫瘤之一，臨床上具有預(yù)后兇險、病死率高等特點。目前，肝癌治療方式眾多，以肝切除術(shù)為代表的外科治療仍是肝癌的首選治療方法，而單一外科手術(shù)治療已到平臺期，資料顯示2012年至2015年中國肝癌的五年生存率僅為12.1%。以靶向治療為代表的肝癌藥物治療手段是目前的熱點，在晚期肝細胞癌靶向二線治療研究中，布尼尼布、依維莫司、雷莫盧單抗均針對索拉非尼治療失敗后的肝細胞癌進行了研究，但是它們的中位總生存期（Overall Survival，OS）并沒有達標。2017年4月，美國食品和藥物管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）已經(jīng)批準瑞戈非尼在治療后進展的肝細胞癌患者試驗，截至2018年1月14日，瑞戈非尼將中位OS改善至10.7個月（95%CI：9.1～12.2），而安慰劑組為7.9個月（95%CI：6.4～9.0），死亡風(fēng)險減少了38%（HR=0.62；95%CI：0.51～ 0.75；P ＜ 0.0001），從試驗中看到的OS延長時間并不是很明顯[1]。肝癌的新藥研究一直面臨困局，中醫(yī)藥作為我國的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)，在肝癌的治療全過程中一直發(fā)揮了重要的作用。

馬齒莧為馬齒莧科馬齒莧屬植物，廣布全球溫帶和熱帶地區(qū)，喜歡溫暖潮濕的環(huán)境，在城市和農(nóng)村地區(qū)都能見到，對土壤、濕度、溫度、蟲害等環(huán)境的要求不高，容易栽培存活且適應(yīng)性極強，其為常用的藥食兩用植物，也是有名的“救荒本草”。馬齒莧地上部分入藥，其味酸、性寒，具有清熱解毒、涼血消腫之功效。在前期工作基礎(chǔ)中，我們發(fā)現(xiàn)馬齒莧有效成分有多糖、生物堿、總多酚、多不飽和脂肪酸和黃酮等[2-5]，我們對馬齒莧提取物的抗肝癌活性成分進行初步篩選，并同時觀察到馬齒莧提取物在體外有抗肝癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移的作用。然而馬齒莧的體內(nèi)抗肝癌效果未知，為探究其體內(nèi)發(fā)揮抗腫瘤作用的有效物質(zhì)、代謝途徑和作用機制，我們通過構(gòu)建人肝癌細胞肺轉(zhuǎn)移裸鼠模型，來觀察馬齒莧在體內(nèi)抗肝癌轉(zhuǎn)移的療效及其代謝過程[6-9]。

1 實驗材料

1.1 實驗試劑和儀器

光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司），電子天平（德國Sartorius公司），全自動組織脫水浸蠟機（日本Tepsarvra公司），2035型切片機（德國Leica公司），超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備儀器廠），二氧化碳孵箱（德國Heraeus公司），ZMN-6803型自動溫度控制漂片烤片儀（西安華利電子公司），ZH-3型石蠟切片用冷臺（沈陽綜縱橫高技術(shù)公司），IMS圖像分析軟件（上海申騰信息技術(shù)有限公司），TSE型電熱保溫干燥箱（日本SNAYO公司），脫色搖床（武漢Servicebio），HPLC甲醇（德國Merck公司），乙腈（德國Merck Dannstadt公司），甲酸（美國Sigma-Aldrich公司），L-2-氯-苯丙氨酸（美國Sigma-Aldrich公司），蒸餾水（屈臣氏），低溫離心機（美國Thermo fisher FRESCO17公司），其它試劑均為市售分析純。

1.2 馬齒莧制備

馬齒莧配方顆粒，購于江陰天江藥業(yè)有限公司，代號：1203031，依據(jù)中國藥典2015年標準、江陰天江藥業(yè)有限公司內(nèi)校質(zhì)量標準，取樣GZSOP0ZE405中藥配方顆粒取樣操作流程符合質(zhì)量規(guī)定。按照濃縮顆粒：生藥為1∶10的比例溫水調(diào)制成需要的藥物濃度，高濃度2 g/ml、低濃度1 g/ml。

1.3 細胞培養(yǎng)

人肝癌細系Huh 7-luc由海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院中醫(yī)科實驗室傳代保存，實驗開始前進行復(fù)蘇。復(fù)蘇后用含10%FBS的完全培養(yǎng)基，在37℃、體積分數(shù)為5%CO2、完全飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中視細胞的生長狀態(tài)進行換液，并在細胞達到對數(shù)生長期、融合度為80%～90%時進行消化傳代或鋪板。消化過程中，先將原培養(yǎng)基吸除，用PBS洗滌3次，然后將PBS吸除干凈后加入適量含0.25%胰蛋白酶/EDTA進行消化，消化過程放恒溫培養(yǎng)箱視消化程度計時12 min，待細胞成接近泥沙樣下滑時即為消化完全，取出加入完全培養(yǎng)基終止消化，用移液槍輕輕吹打均勻后，按照一定比例進行傳代，或者計數(shù)后進行鋪板。

1.4 實驗動物

本實驗采用的研究動物為BALB/C雄性裸鼠，4周齡，體重約18～20 g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，動物合格證編號為2016-0006。裸鼠飼養(yǎng)于第二軍醫(yī)大學(xué)第一附屬長海醫(yī)院中心實驗室動物房，SPF級環(huán)境，飼料來源于斯萊克公司所用繁殖飼料，通過輻照滅菌，飲用水為高壓高溫滅菌純凈水，墊料及籠具均由中心實驗室動物房提供，高溫高壓滅菌，所有實驗裸鼠均自由采食和飲水[10]。

2 實驗方法

2.1 裸鼠肺轉(zhuǎn)移瘤模型建立

選擇Huh 7-luc細胞，取處于對數(shù)生長期、狀態(tài)良好的細胞進行常規(guī)消化，消化后細胞在離心機離心5 min，后將上清培養(yǎng)基移除，加入PBS重懸細胞，用移液槍輕輕將細胞吹打成單細胞懸液，細胞計數(shù)并定量至8×106個/mL，置于冰上備用。取本課題組研制的裸鼠尾靜脈注射裝置，先將水浴鍋預(yù)熱42℃并保持恒溫，固定好裸鼠后將其尾部放入溫水中5 min，促使尾靜脈擴張，取出后找到兩側(cè)擴張明顯的靜脈，取出胰島注射用1 mL注射器，吸取200細胞懸液，使針頭與尾靜脈方向平行，然后進針，有突破懸空感后將細胞注入尾靜脈，正確注射進尾靜脈應(yīng)較順暢無抵觸感，退針后用棉球按壓針孔止血。

本次造模共24只裸鼠，分為3組，每組8只，分別為對照組、馬齒莧高劑量組（10 g/ml）、馬齒莧低劑量組（5 g/ml），藥物濃度參考本實驗先前馬齒莧相關(guān)實驗的結(jié)果[7-8]。接種后第7天開始按照分組進行干預(yù)，取出配制好的馬齒莧溶液，預(yù)熱至37℃搖勻，取出進行灌胃，每只灌400 μL溶液，對照組灌等體積的無菌生理鹽水，加藥干預(yù)共4周，然后處死取材。眼眶取血，脫臼處死裸鼠，稱小鼠體重，剝?nèi)》谓M織，Bouins液染色24小時后，75%酒精固定，肉眼計數(shù)肺轉(zhuǎn)移的結(jié)節(jié)數(shù)目，同時對肺轉(zhuǎn)移病灶進行HE染色、包埋肺組織，制成蠟塊，HE染色，鏡下復(fù)核計算結(jié)節(jié)數(shù)目，觀察不同組肺內(nèi)組織的情況。肉眼所見肺轉(zhuǎn)移的結(jié)節(jié)呈現(xiàn)半透明樣，切開呈實性，染色所見轉(zhuǎn)移灶細胞腺樣排列，細胞呈圓形、橢圓形或者不規(guī)則形，分化差，核大，深染，核質(zhì)比大，細胞核分裂相多見。計算轉(zhuǎn)移抑制率=1-（治療組轉(zhuǎn)移率/對照組轉(zhuǎn)移率）×100%。

2.2 樣本前處理

取200 μL血，加入含內(nèi)標（5 ug/mL，L-2-氯-苯丙氨酸）的溶劑（甲醇∶水=8∶2）0.6 mL，低溫離心，12 000 rpm，4℃，離心10 min，取200 uL上清液置進樣小瓶，進行代謝組學(xué)分析。取等量的各待測樣本混合，作為質(zhì)量控制（Quality Control，QC）樣本。

2.3 LC/MS分析

LC-MS分析使用Agilent6538UHDandAccurate-Mass Q-TOF質(zhì)譜聯(lián)用儀與Agilent 1290 Infinity超高效液相色譜。色譜柱選用Waters ACQUITY UPLC@HSS T3（2.5 μm，100 × 2.1 mm）進行分析。

流動相：A-0.1%甲酸溶液，B-乙腈（0.1%甲酸）；流速：0.4 ml/min；柱溫：25℃；Post Time：5 min；進樣量：3 μL。優(yōu)化的色譜梯度：0～2 min，5%B；2～13 min，5～95%B；13～15 min，95%B。Post time設(shè)為5min，用于平衡系統(tǒng)。

質(zhì)譜使用正離子模式結(jié)合負離子模式，優(yōu)化后具體的參數(shù)如下：capillary voltage，4 kV in positive mode and 3.5 kV in negative mode；drying gas flow，11l/min；gastemperature，3501C；nebulizerpressure，45 psig；fragmentor voltage，120 V；skimmer voltage，60 V。質(zhì)譜的采集范圍m/z 100～1 000。在實驗室質(zhì)譜采集的過程中同時打入?yún)⒈入x子用于監(jiān)測質(zhì)量軸的準確性，其中正離子模式參數(shù)為：121.050 9，922.009 8；負離子模式參數(shù)為：119.036 3，966.000 7。

2.4 統(tǒng)計學(xué)分析

使用Agilent Masshunter Qualitative Analysis B.04.00 software（美國安捷倫技術(shù)，公司）將原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成通用的格式mz.data進行分析。在R軟件平臺下，使用XCMS程序包進行峰的識別，同時保留時間校正，進行自動積分的預(yù)處理。同時進行內(nèi)標歸一化以及重量歸一化，得到一個包含樣品名，m/z-RT對，峰面積的可視化矩陣。將編輯后的數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入Simca-P軟件（版本11.0），進行中心化和Pareto標度化后，進行多元統(tǒng)計分析處理。采用PLS-DA模型的S-Plot來反映不同組別的離子對組間差異的貢獻程度，采用PLS-DA模型的VIP（Variable Importance in the Projection）值，如果VIP＞1則被認為是潛在的差異代謝物。對VIP＞1的值進行獨立樣本T檢驗分析，其中P＜0.05的代謝物則被認為是有差異的代謝物。

3 實驗結(jié)果

3.1 馬齒莧對裸鼠肺轉(zhuǎn)移瘤模型的影響

如表1所示，從不同組別的實驗性肺轉(zhuǎn)移瘤小鼠肺轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目上可得，空白對照組轉(zhuǎn)移數(shù)為6.86±2.54、低劑量組轉(zhuǎn)移數(shù)為4.75±1.91、高劑量組轉(zhuǎn)移數(shù)為3.14±1.57，馬齒莧高劑量組（G）和馬齒莧低劑量組（D）的肺轉(zhuǎn)移數(shù)目明顯低于正常對照組（P均＜0.05）；且馬齒莧高劑量組抑制率為54.16%，馬齒莧低劑量組抑制率為30.72%，提示馬齒莧能抑制肝癌的肺轉(zhuǎn)移；如圖1和表1所示可見馬齒莧用藥組與空白對照組相比，其腫瘤數(shù)目及大小明顯下降；而三組的裸鼠體重上差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 馬齒莧干預(yù)后的肝癌肺轉(zhuǎn)移模型裸鼠的肺組織Figure 1 Lung of nude mouse with lung metastasis model of liver cancer after purslane treatment

表1 實驗性肺轉(zhuǎn)移瘤小鼠的肺轉(zhuǎn)移情況表Table 1 The number of lung cancer in nude mouse with experimental pulmonary metastasis liver cancer

3.2 血液樣品圖譜分析

圖2為血液樣本的離子色譜圖，其中A為正離子模式下典型的總離子流圖，B為正離子模式下典型的總離子流圖。從圖中可看出正模式下共得到1342個features，負離子模式下共得到409個features，正負離子出現(xiàn)不同的峰值。

3.3 多元統(tǒng)計分析

我們采用PCA建模方法對QC樣本的聚集程度進行考察，如圖3示，正（2A）、負（2B）離子模式下QC樣本均聚集良好，其離散度明顯低于待分析樣本的離散度，表明系統(tǒng)穩(wěn)定性良好。圖3示高劑量組、低劑量組和模型組的樣本分布分離趨勢明顯，高劑量組、低劑量組以及空白組的樣本分布在不同的區(qū)間，提示給藥組和對照組之間，以及高、低劑量組之間在代謝產(chǎn)物上存在分離趨勢。

從多元統(tǒng)計方法偏最小二乘判別分析（PLSDA）對給藥組與模型組樣本（如圖4示）進行分析。發(fā)現(xiàn)正離子（A）、負離子（B）模式下得分圖的不同組之間呈現(xiàn)出明顯的分離趨勢。判別模型質(zhì)量好壞的主要參數(shù)為R2Y（該值代表模型的解釋率）及Q2值（該值為模型的預(yù)測率）。另外我們還對模型進行排序驗證，檢驗?zāi)Ｐ褪欠瘛斑^擬合”。模型對于解釋兩組之間差異及尋找差異物質(zhì)是可靠的，且從排序驗證圖得模型不存在“過擬合”現(xiàn)象，即可利用此數(shù)據(jù)進行后續(xù)分析。模型是否存在“過擬合”體現(xiàn)了模型的構(gòu)建是否準確，未“過擬合”則說明模型能較好地描述樣本，并可作為尋找模型生物標記物群的前提；“過擬合”則說明該模型不適用于描述樣本，且此數(shù)據(jù)不宜做后續(xù)分析。而本樣本的正離子模式下累積R2X=0.7，R2Y=0.921，Q2=0.701；負離子模式累積R2X=0.926，R2Y=0.99，Q2=0.954，說明不同組別的代謝產(chǎn)物的分離明顯。同時對模型進行排列測試，如正離子（C）、負離子（D）所示，從檢驗?zāi)Ｐ臀覀兛煽闯瞿Ｐ筒淮嬖凇斑^擬合”的現(xiàn)象。

圖2 典型總離子流色譜圖（TIC）。A為正離子模式下高劑量總離子流圖，B為負離子模式下總離子流圖Figure 2 The Total Ion Chromatogram of QC（TIC）：（A）ESI+，（B）ESI-

圖3 樣本及QC樣品的PCA得分圖Figure 3 The PCA scores plot of all samples：（A）ESI+，（B）ESI-

圖4 測試組的PLS-DA模型圖得分和排列測試圖。A為PLS-DA得分圖（pos），B為PLS-DA模型的排列測試圖（pos），C為PLS-DA得分圖（neg），D為PLS-DA模型的排列測試圖（neg）Figure 4 The PLS-DA model score and permutation test chart of all samples：（A、C）ESI+，（B、D）ESI-

3.4 差異物質(zhì)篩選與鑒定

為了進一步說明馬齒莧對肝癌肺轉(zhuǎn)移裸鼠血液的影響，研究采用PLS-DA模型的S-Plot來反映不同組別的離子對組間差異的貢獻程度，從圖5中可看出，離原點越遠的點表明其對組間差異的貢獻度越大，其VIP值也越大。其中差異性代謝物的定性方法為：通過搜索在線數(shù)據(jù)庫（Metlin、HMDB等）進行精確分子量的比對，同時通過MS/MS譜圖的比對以發(fā)現(xiàn)代謝產(chǎn)物名稱。如表2所示我們發(fā)現(xiàn)人肝癌肺轉(zhuǎn)移裸鼠的差異代謝物有六十余種，其中主要包括有尿素、三甲基乙烯胺、絲氨酸、煙酰胺、肉堿、苯丙氨酸、丙醇、尿酸、色氨酸、乙酰基肉堿、1，2-二苯乙烷-1，2-二醇、丙?？嵬?、辛基酰膽堿脫羰基、異丁酰左旋肉堿、棕櫚酸、高香草醛硫酸、丙酮、左旋棕櫚酰肉堿、左旋肉堿、依萊迪肉堿、4-β-羥甲基-4-α-甲基-5-α-膽固醇-7-烯-3-β-醇、?；悄懰猁}、2-亞麻酰-甘油-3-磷酸膽堿、2-油酰甘油磷酸膽堿、2-花生四烯酸甘油磷酸膽堿等物質(zhì)，這類代謝產(chǎn)物覆蓋范圍較廣，其中通路歸屬主要集中為脂肪酸、氨基酸、能量代謝等相關(guān)物質(zhì)。

圖5 馬齒莧對肝癌肺轉(zhuǎn)移裸鼠的PLS-DA模型的S-Plot分析。A為正離子、B為負離子Figure 5 The PLS-DA scores plot of all samples：（A、C）ESI+，（B、D）ESI-

表2 馬齒莧對肝癌肺轉(zhuǎn)移裸鼠作用的差異表達代謝物列表Table 2 The list of different expression metabolites of nude mouse with lung metastasis model of liver cancer after purslane treatment

（續(xù)表2）

4 討論

肝癌起病隱匿，惡性程度高，手術(shù)是最佳的治療選擇，但術(shù)后5年生存率僅為30～50%，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率超過60%，現(xiàn)有的藥物并不能有效控制手術(shù)后的疾病進展，因此探尋有效的診斷標志物和藥物干預(yù)仍然是目前的研究者需要努力的方向。

代謝組學(xué)自問世以來，不斷發(fā)展更新，目前被廣泛應(yīng)用到臨床和基礎(chǔ)研究的各個領(lǐng)域中。在肝癌研究中，相比于基因組學(xué)與蛋白組學(xué)等其他組學(xué)技術(shù)，代謝組學(xué)展現(xiàn)出它獨到的優(yōu)勢，代謝組學(xué)能反映肝癌體內(nèi)基因水平、蛋白質(zhì)水平各因素綜合作用下的最終結(jié)果，各種微小變化都可能引起代謝物中的差異出現(xiàn)，產(chǎn)生大量異乎尋常的代謝物，因此能夠更綜合、更準確、更靈敏地反映肝癌肺轉(zhuǎn)移裸鼠的生物體系的狀態(tài)[11]。

在肝癌代謝組學(xué)方面，目前的報道主要集中在肝癌患者領(lǐng)域，比如Yin等[12]利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（LC/MS）對乙肝誘導(dǎo)的肝硬化患者與HCC患者的血清進行代謝組學(xué)研究。通過反向液相色譜與親水作用色譜兩種方式獲取了25例健康志愿者、24例肝硬化患者與25例HCC患者的血清數(shù)據(jù)，經(jīng)過化學(xué)計量學(xué)標準化和整合的數(shù)據(jù)用OPLS分析，篩選出了潛在的生物標志物。其中甘氨膽酸，甘氨鵝去氧膽酸，?；悄懰嵋约芭；蛆Z去氧膽酸是肝硬化的潛在生物標志物，二氫鞘氨醇與4-羥雙氫鞘氨醇是肝癌的潛在標志物。

Gao等[13]利用NMR對肝硬化與HCC患者的血清進行了代謝組學(xué)研究。選擇了63例健康志愿者、36例肝硬化患者與39例HCC患者，發(fā)現(xiàn)與健康人相比，肝硬化與HCC患者的血清中含有更高的醋酸鹽、N-乙酰糖類蛋白、丙酮酸、谷氨酰胺、a-酮戊二酸鹽、甘油、酪氨酸、1-甲基組氨酸與苯丙氨酸，以及更低的脂蛋白、異亮氨酸、纈氨酸、乙酰乙酸、肌酸、膽堿與不飽和脂類等物質(zhì)。

對于肝癌動物模型的代謝組學(xué)分析目前鮮有報道，本項目采用LC/MS儀器對小鼠血清樣本進行檢測。對所有樣本中這些物質(zhì)的峰的響應(yīng)強度數(shù)據(jù)進行模型判別分析，我們首先使用SIMCA-P了軟件對樣品進行了PCA分析，隨后進行PLSDA、OPLS-DA的模型構(gòu)建，最終獲得了差異性表達代謝物。差異物質(zhì)種類主要包括氨基酸類、脂肪酸類、有機酸類等。主要影響的通路有氨基酸代謝、脂肪酸代謝、脂質(zhì)代謝等。

本次實驗結(jié)果提示馬齒莧能夠抑制裸鼠肝癌肺轉(zhuǎn)移模型的腫瘤轉(zhuǎn)移，同時對裸鼠的體內(nèi)代謝產(chǎn)生一定的影響，隨著藥物濃度的不同，其抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和體內(nèi)代謝產(chǎn)物方面也不同。這一方面說明代謝組學(xué)對裸鼠體內(nèi)代謝物質(zhì)的檢測的靈敏度較高，同時提示馬齒莧能夠抑制肝癌肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生，可能在一定程度上與干擾裸鼠的體內(nèi)代謝有關(guān)。在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中，癌組織畸形的能量需求及正常組織功能的受損及紊亂可同時表現(xiàn)于血液中。有研究證實肝癌及癌旁組織間脂酰肉堿的代謝輪廓變化有差異，其中發(fā)現(xiàn)相對于癌旁組織，中短鏈及長鏈脂酰肉堿在肝癌組織中分別呈現(xiàn)降低及升高的趨勢。而本實驗通過觀察人肝癌肺轉(zhuǎn)移模型血液的代謝產(chǎn)物的差異，初步揭示了肝癌血行轉(zhuǎn)移播散的可能生物學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，提示肝癌的遠處播散轉(zhuǎn)移可能與血液內(nèi)氨基酸代謝、脂肪酸代謝、脂質(zhì)代謝等小分子物質(zhì)代謝相關(guān)。由于非靶向代謝組學(xué)的局限性，本次實驗只能初步揭示人肝癌肺轉(zhuǎn)移模式的血液代謝的輪廓，人肝癌肺轉(zhuǎn)移模型的肝臟、尿液等組織等其它體液或組織的代謝如何，是否與血液代謝存在差異，可以通過進一步的檢測來逐步揭示。通過對比人肝癌肺轉(zhuǎn)移裸鼠模型的不同組織不同體液的代謝輪廓和產(chǎn)物我們可以更為精確的得出代謝物質(zhì)，而后通過靶向代謝組學(xué)技術(shù)精確定位其中差異明顯的代謝產(chǎn)物，通過相關(guān)代謝途徑揭示出肝癌遠處轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，這有利于闡明肝癌血液轉(zhuǎn)移的內(nèi)在途徑和物質(zhì)基礎(chǔ)。