文/黃廣明 寶立群 牟和鑫 姚 臻 黃俊恒 李德鵬

〔建明（中國）科技有限公司〕

產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）又稱魏氏梭菌，是一種人畜共患病原菌，廣泛分布于自然界，能產(chǎn)生多種外毒素，是引起各種動(dòng)物壞死性腸炎、腸毒血癥及動(dòng)物猝死癥的主要病原菌之一[1]。該菌導(dǎo)致的動(dòng)物猝死癥發(fā)病急、病程短、死亡率高，各類家畜均可發(fā)病，尤以牛的發(fā)病率最高[2]。在我國，產(chǎn)d氣莢膜梭菌病在20世紀(jì)80年代有零星發(fā)生，以犢牛發(fā)病為主；90年代以來，該病日趨嚴(yán)重，發(fā)病地區(qū)也不斷擴(kuò)大，給養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。

A、B、C、D、E型產(chǎn)氣莢膜梭菌均能感染牛（肉牛、奶牛等），但是以A、C、D型居多，C型產(chǎn)氣莢膜梭菌是奶牛犢牛腸毒血癥的主要病原[4]。B型菌主要引發(fā)羔羊痢疾，而E型菌感染僅見于野生牦牛[5]。體格強(qiáng)壯、膘情較好的黃牛、犢牛和高產(chǎn)奶牛是該菌侵害的主要目標(biāo)；病畜發(fā)病時(shí)間差別較大，從數(shù)小時(shí)到數(shù)個(gè)月不等，病死率可達(dá)80%。由產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素引起的犢牛梭菌性腸炎是可致幼犢急性死亡的一種疾病[6]。另外，犢牛10 日齡左右出現(xiàn)真胃炎也是該菌發(fā)病的典型癥狀之一。

本研究在2019年2—7月，采用生化快速檢測(cè)方法，對(duì)華北、西北和西南3 個(gè)地區(qū)6 個(gè)?。ㄊ?、區(qū)）的10個(gè)牧場(chǎng)進(jìn)行了產(chǎn)氣莢膜梭菌感染狀況的調(diào)查，為牧場(chǎng)管理者防控梭菌類疾病，避免造成重大損失提供參考。

1 材料與方法

（1）儀器與試劑

高壓滅菌鍋、試管加熱器、生物安全柜、分析天平、離心管、EP管、無菌醫(yī)用棉簽、SFP瓊脂培養(yǎng)基、PBS緩沖液。產(chǎn)氣莢膜梭菌快速檢測(cè)試劑盒，由建明（中國）科技有限公司研制。

（2）菌株與益生菌制劑

產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC13124，購自中國獸藥監(jiān)察所；益生菌制劑克洛生TM-R，由建明（中國）科技有限公司生產(chǎn)。

（3）取樣地點(diǎn)

對(duì)華北地區(qū)5 個(gè)牧場(chǎng)205 頭，西北地區(qū)3 個(gè)牧場(chǎng)86 頭，以及西南地區(qū)3 個(gè)牧場(chǎng)60 頭各階段牛的糞便進(jìn)行采樣。合計(jì)犢牛154 頭，育成牛23頭，泌乳牛131 頭，干奶牛43 頭。

（4）檢測(cè)方法

原理。產(chǎn)氣莢膜梭菌可分解培養(yǎng)基中的含硫化合物，產(chǎn)生硫化氫氣體，硫化氫遇到亞鐵離子可生成不溶性硫化亞鐵黑色沉淀。SFP瓊脂培養(yǎng)基是一種選擇性培養(yǎng)基，常用于產(chǎn)氣莢膜梭菌的篩選和計(jì)數(shù)。

表1 產(chǎn)氣莢膜梭菌感染程度評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)

表2 華北地區(qū)5 個(gè)牧場(chǎng)產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測(cè)結(jié)果

表3 西北地區(qū)3 個(gè)牧場(chǎng)產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測(cè)結(jié)果

采樣。用棉拭子挑取牛糞便樣品約1 g于PBS緩沖液中，攪拌均勻。

檢測(cè)。按產(chǎn)氣莢膜梭菌快速檢測(cè)試劑盒說明書操作。（5）結(jié)果判定

通過實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)，由產(chǎn)氣莢膜梭菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC13124作為陽性對(duì)照，制定產(chǎn)氣莢膜梭菌活菌數(shù)（以CFU/g表示）的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。感染程度的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)參考國標(biāo)對(duì)食品中產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)以及其他文獻(xiàn)[7]（表1）。

2 結(jié)果與分析

（1）各地區(qū)牧場(chǎng)產(chǎn)氣莢膜梭菌感染情況

華北地區(qū)。從華北地區(qū)5 個(gè)牧場(chǎng)的檢測(cè)結(jié)果來看，犢牛和泌乳牛產(chǎn)氣莢膜梭菌重度感染率較高，分別為56.82%和50.00%；干奶牛和育成牛中度感染率較高，分別為62.50%和38.10%；各階段輕度感染率均較低。因此，犢牛、泌乳牛這2 個(gè)階段產(chǎn)氣莢膜梭菌感染均較嚴(yán)重，而干奶牛和育成牛次之（表2）。

西北地區(qū)。在西北地區(qū)3 個(gè)牧場(chǎng)中，犢牛重度感染率較高，為44.44%；在中度感染率上，泌乳牛最高，為38.46%；而輕度感染率則是干奶牛最高，為39.29%。從產(chǎn)氣莢膜梭菌正常比例來看，犢牛污染程度最重，其次是泌乳牛，干奶牛污染程度最輕（表3）。

西南地區(qū)。西南地區(qū)3 個(gè)牧場(chǎng)產(chǎn)氣莢膜梭菌的重度感染比例相對(duì)較低，只有犢牛稍高為28.57%。各階段中度感染比例較高，育成牛、泌乳牛、犢牛和干奶牛中度感染的比例分別為50.00%、46.67%、42.86%和28.57%。干奶牛輕度感染比例最高為42.86%。綜合來看，犢牛階段產(chǎn)氣莢膜梭菌感染最嚴(yán)重，重度感染和中度感染相加后占比為71.43%（表4）。

3 個(gè)地區(qū)綜合感染情況。從3 個(gè)地區(qū)11 個(gè)牧場(chǎng)的綜合情況來看，重度感染率最高的是犢牛，為49.53%；其次是泌乳牛，為36.64%，因此，此3 個(gè)地區(qū)是產(chǎn)氣莢膜梭菌疾病的重災(zāi)區(qū)。中度感染率最高的是育成牛，為39.13%；其次是干奶牛，為25.58%。干奶牛輕度感染比例最高，為34.88%。從綜合感染情況來看，犢牛感染率最高，為79.22%；泌乳牛其次，為64.12%；育成牛和干奶牛分別為60.87%和60.47%（表5）。

（2） 克洛生TM-R對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的治療效果

對(duì)西北某牧場(chǎng)11 頭產(chǎn)氣莢膜梭菌感染并有不同程度腹瀉癥狀的犢牛，進(jìn)行了克洛生TM-R使用效果的跟蹤監(jiān)測(cè)。使用克洛生TM-R前，該菌重度感染率為45.45%，中度感染率為36.36%，輕度感染率為18.18%。使用克洛生TM-R 12 天后重度感染率和中度感染率分別下降至0和9.09%，梭菌正常的比率達(dá)到72.73%，說明使用克洛生TM-R對(duì)梭菌感染的控制效果顯著（表6）。

表4 西南地區(qū)3 個(gè)牧場(chǎng)產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測(cè)結(jié)果

表5 3 個(gè)地區(qū)11 個(gè)牧場(chǎng)產(chǎn)氣莢膜梭菌感染情況匯總

表6 西北某牧場(chǎng)11 頭犢牛使用克洛生TM-R前后感染產(chǎn)氣莢膜梭菌情況對(duì)比

3 討論

輕度感染樣品中產(chǎn)氣莢膜梭菌的數(shù)量為1.0×104～1.0×106CFU/g，屬于亞臨床感染狀態(tài)，隨時(shí)可能因?yàn)樘鞖狻⑥D(zhuǎn)群、其他疾病等應(yīng)激因素而導(dǎo)致梭菌類疾病的發(fā)生；中度感染樣品中產(chǎn)氣莢膜梭菌的數(shù)量為1.0×106～1.0×107CFU/g；而重度感染樣品中產(chǎn)氣莢膜梭菌的數(shù)量為1.0×107CFU/g以上，后兩者均已處于感染甚至發(fā)病的狀態(tài)[7，8]。

華北、西北和西南3 個(gè)地區(qū)的調(diào)查結(jié)果表明，產(chǎn)氣莢膜梭菌在牧場(chǎng)的感染非常普遍，尤其是犢牛重度感染比例最高，其次是泌乳牛，給養(yǎng)牛業(yè)帶來重大威脅。牛產(chǎn)氣莢膜梭菌病的發(fā)病率低，但死亡率高，一旦發(fā)生，往往來不及治療即造成死亡[2]，因此，采取綜合防制措施尤為重要。一方面要加強(qiáng)畜舍衛(wèi)生管理，定期使用0.1%高錳酸鉀溶液、10.0%氫氧化鈉溶液輪換交替消毒[6]；另一方面，可通過飼喂微生態(tài)制劑來調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，尤其是選擇對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌有抑制作用的益生菌，可預(yù)防該病的發(fā)生[2]。

克洛生TM-R是一種以枯草芽孢桿菌PB6為主要活性成分的益生菌類飼料添加劑，PB6所分泌的細(xì)菌素可特異性殺死產(chǎn)氣莢膜梭菌。從使用克洛生TM-R以后的檢測(cè)結(jié)果來看，產(chǎn)氣莢膜梭菌的感染情況有明顯的好轉(zhuǎn)，重度感染情況完全消失，梭菌正常的比例顯著提高，說明克洛生TM-R在控制產(chǎn)氣莢膜梭菌感染方面具有顯著的效果。