王黎霞，鄧家儉，張建軍，安 健

(1.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院畜牧獸醫(yī)系，北京 房山 102442；2.北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 昌平 102206)

細胞凋亡是具有確定的形態(tài)學(xué)變化的細胞死亡的一種方式。細胞內(nèi)寄生蟲，如微小隱孢子蟲、小泰勒蟲、鼠弓形蟲、瘧原蟲和球蟲等，能夠干預(yù)宿主細胞的生命活動，入侵宿主細胞后均可抑制宿主細胞凋亡[1]。Lang M等證實，牛柔嫩艾美耳球蟲子孢子感染VERO和BFGC細胞可抑制由放線菌素D和細胞松弛素B誘導(dǎo)的凋亡，其試驗結(jié)果顯示，牛艾美耳球蟲通過表達細胞內(nèi)凋亡抑制蛋白1(c-IAP1)和Fas相關(guān)性死亡結(jié)構(gòu)域蛋白樣白介素轉(zhuǎn)變酶抑制蛋白(c-FLIP)來阻止宿主細胞凋亡[2]。據(jù)報道，核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)的表達也會引起凋亡抑制，NF-κB最初在鼠成熟B細胞和粒細胞瘤中發(fā)現(xiàn)，命名為細胞核Kappa輕鏈基因表達的調(diào)節(jié)子，研究發(fā)現(xiàn)其存在于多種細胞中。NF-κB通過參與多個目的基因的轉(zhuǎn)錄來調(diào)節(jié)細胞增殖、分化和生長，尤其與細胞凋亡有很大關(guān)系。Cacho E等利用雞活體進行試驗，發(fā)現(xiàn)毒害艾美耳球蟲感染宿主細胞后，在第2代裂殖體的成熟的過程中，表達了抑制寄生蟲誘導(dǎo)凋亡的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和下游的抗凋亡蛋白Bcl-xL的表達，而且還表達了磷酸化的NF-κB(p-IκBα)，作者認為毒害艾美耳球蟲先誘導(dǎo)激活NF-κB，保護了帶蟲細胞免于凋亡，使第2代裂殖子得以成熟[3]。Kim J Y等證實，剛第弓形蟲感染小鼠脾細胞后，導(dǎo)致NF-κB的激活，抑制了由放線菌素D誘導(dǎo)的凋亡[4]。還有試驗證明，宿主細胞缺失NF-κB p65亞基后，就喪失了感染引起的凋亡抑制作用，說明蟲體引起了NF-κB的調(diào)節(jié)和磷酸化的IκB在納蟲泡膜上的聚集定位[5]。我們在E.tenella子孢子入侵體外培養(yǎng)MDBK細胞后，用終濃度6%乙醇進行凋亡誘導(dǎo)，通過Annexin V/PI雙熒光染色法和流式細胞術(shù)(FCM)對MDBK細胞的凋亡水平進行檢測，發(fā)現(xiàn)MDBK細胞的凋亡受抑，而E.tenella子孢子入侵MDBK細胞后宿主細胞的凋亡是否與NF-κB的表達有關(guān)未見報道，因此，本試驗用免疫細胞化學(xué)技術(shù)探討E.tenella子孢子入侵MDBK細胞后宿主細胞的NF-κB的表達，明確E.tenella子孢子入侵MDBK細胞后宿主細胞的凋亡是否與NF-κB的表達有關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 細胞株和寄生蟲 MDBK細胞株，由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院索勛教授饋贈；柔嫩艾美耳球蟲河北株，由北京農(nóng)學(xué)院實驗室保存，每半年用7日齡雛雞傳代保存活力，試驗用卵囊為新鮮卵囊 (1個月內(nèi))。

1.2 藥品與試劑 DMEM細胞培養(yǎng)基和胎牛血清，購自Gibco公司；胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25%)，購自Solarbio公司；小鼠抗NF-κB抗體，購自BT公司；山羊抗小鼠IgG抗體、DAB顯色試劑盒，均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Triton X-100、多聚賴氨酸，均購自Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 子孢子純化、入侵凋亡誘導(dǎo)、凋亡鑒定 子孢子的分離和純化采用過 DE-52層析柱的方法[6]，柔嫩艾美耳球蟲子孢子入侵、細胞凋亡誘導(dǎo)、凋亡檢測采用流式細胞術(shù)和Annexin V/PI染色法[7]。

1.3.2 受侵細胞中NF-κB的檢測 用PBS漂洗蓋玻片3次，2 min/次；4%多聚甲醛處理(室溫)20 min；PBS漂洗蓋玻片3次，2 min/次；0.5%Triton X-100處理(室溫)20 min；PBS漂洗蓋玻片3次，2 min/次；3%H2O2(二抗試劑盒自帶)處理(室溫)10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性；PBS漂洗(浸泡)蓋玻片3次，2 min/次；滴加一抗(1∶100)(PBS稀釋)，陰性對照用PBS代替一抗，37 ℃ 1～2 h或4 ℃過夜；4 ℃過夜和從冰箱拿出后37 ℃復(fù)溫45 min；PBS漂洗(浸泡)蓋玻片3次，2 min/次；滴加二抗，山羊抗小鼠IgG抗體-HRP多聚體，37 ℃孵育30 min；PBS漂洗(浸泡)蓋玻片3次，2 min/次；DAB顯色，自來水漂洗10次，3 min/次；封片劑封片(有細胞一面對著載玻片)，熒光倒置顯微鏡觀察。

結(jié)果判定：鏡下抗原陽性信號呈現(xiàn)棕紅色或棕黃色顆粒或團塊狀。

2 結(jié)果

細胞免疫組化結(jié)果表明，在入侵有球蟲子孢子的MDBK細胞細胞核邊緣有棕黃色陽性物質(zhì)(見中插彩版圖1A，白箭頭)，陰性對照組(見中插彩版圖1C)為未感染球蟲子孢子組，MDBK細胞在凋亡誘導(dǎo)后細胞核中無棕黃色陽性物質(zhì)。說明6%乙醇誘導(dǎo)凋亡時，帶蟲細胞可以活化核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB。

3 討論

試驗結(jié)果顯示，未感染誘導(dǎo)凋亡對照組，細胞無染色，細胞體積縮小，連接消失，與周圍的細胞脫離，核質(zhì)濃縮，細胞核固縮(見中插彩版圖1C)。感染誘導(dǎo)凋亡組，入侵有子孢子的MDBK細胞，細胞大小正常，入侵有球蟲子孢子的MDBK細胞細胞核邊緣帶有棕黃色陽性物質(zhì)(見中插彩版圖1A)，說明帶蟲細胞可以促進核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的表達，其抑制凋亡的機理可能與NF-κB的表達上調(diào)有關(guān)。

NF-κB是由p50和p65兩個亞單位組成的二聚體，未被激活時位于胞漿，并和IκB 結(jié)合在一起，在某些刺激因素作用下，IκB被磷酸化及降解，NF-κB被快速轉(zhuǎn)運至核內(nèi)，與特定基因的啟動子或增強子上的相應(yīng)位點結(jié)合，從而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。因此，核因子NF-κB的表達能夠直觀的反映出NF-κB轉(zhuǎn)位及活化[8-9]。

胞內(nèi)寄生蟲感染后，宿主可通過一種獨特方式達到殺傷、消滅寄生蟲的作用，即促使已感染寄生蟲的自身細胞的凋亡，但事實上，寄生蟲往往可逃避宿主直接的免疫殺傷作用，其通過干擾宿主細胞的凋亡過程、抑制宿主細胞的凋亡來實現(xiàn)，以有利于自身的生存，達到免疫逃避作用。目前的研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子-核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)家族能夠調(diào)節(jié)凋亡抑制分子的轉(zhuǎn)錄。

在其他頂復(fù)門寄生蟲中，弓形蟲通過阻斷不同的凋亡前信號級聯(lián)放大來抑制受感染細胞的凋亡，包括JNK通路和NF-κB通路，從遺傳學(xué)來看，弓形蟲屬與艾美耳屬在遺傳上十分相近[10]，且JNK通路與NF-κB通路可以相互調(diào)節(jié)，JNK的磷酸化可調(diào)節(jié)下游的NF-κB[11]，氧化應(yīng)激、細菌脂多糖、細胞因子等多種刺激可活化MAPK-NF-κB 這條通路[12-13]，能調(diào)控炎癥性細胞因子、細胞表面受體、轉(zhuǎn)錄因子、粘附分子等的生成。Cacho E等[3]推測子孢子的某些成分或刺激細胞產(chǎn)生的某些成分通過刺激IκB發(fā)生磷酸化，使p65/p50異源二聚體與IκB分離，最終調(diào)控產(chǎn)生Bcl-xL。Bcl-xL通過與Bax形成異源二聚體，但是對于Bcl-2家族抑制細胞凋亡的機制尚不清楚。李捷萌等認為，Bcl-2蛋白主要是通過抑制鈣離子的釋放，阻止各種凋亡刺激因素引起的線粒體膜通透性的增加，從而阻止線粒體釋放細胞色素C，抑制凋亡級聯(lián)反應(yīng)從而抑制細胞凋亡[14]。在核因子通路中，下游信號已有相關(guān)報道，而上游信號在艾美耳屬球蟲中依然未知。目前弓形蟲凋亡關(guān)系研究主要集中于JNK通路，而堆型艾美耳球蟲曾有報道存在絲氨酸蛋白酶抑制劑，這與抑制細胞凋亡相關(guān)[15]，主要抑制caspase的活性，而NF-κB通路中依賴caspase的通路幾乎沒有，而JNK通路的激活卻和caspase有很大關(guān)系，牛艾美耳球蟲研究中發(fā)現(xiàn)，c-FLIP能夠影響Fas的表達[2]，而且弓形蟲的抑制凋亡通路也與這個通路有關(guān)。而且該通路的受體TNFR1也是NF-κB的重要受體，它可連接TRADD，TRADD再與2個TRAF2/5連接，2個TRAF2/5再連接RIP1，刺激核因子通路。由此推斷柔嫩艾美耳球蟲感染時，抑制凋亡的通路也可能是該通路。

細胞免疫組織化學(xué)試驗過程中，選擇爬片，是為了細胞貼壁效果好，節(jié)省一抗，還可用樹酯固定，便于短時間的保存，比用24孔板中直接做要好。在選擇一抗的濃度過程中，最終確定1∶100的效果最好，一抗可重復(fù)利用。在DAB染色后，如果在自來水下沖，這樣容易使細胞脫落，我們選擇漂洗的方法，多洗幾次，并不斷在鏡下觀察顏色的變化，以便獲得較好的圖片效果。