劉帥，宿甜甜，劉長發(fā)，魏海峰,*，趙肖依，宋雪

1. 遼寧省近岸海洋環(huán)境科學(xué)與技術(shù)重點實驗室，大連 116023 2. 大連海洋大學(xué)海洋科技與環(huán)境學(xué)院，大連 116023 3. 大連海洋大學(xué)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，大連 116023

近年來，工農(nóng)業(yè)廢水以及生活污水大量排入海域、海上油氣開發(fā)以及海洋溢油事件頻發(fā)，造成海洋環(huán)境污染日益加重，給海洋生物資源帶來危害[1]。海洋溢油事件發(fā)生后，石油類分解產(chǎn)生多種多環(huán)芳烴(PAHs)，多環(huán)芳烴類污染物分布面積廣、致癌性作用強、數(shù)量多，與人類生命活動密切相關(guān)，是典型的“三致”物質(zhì)，因此，對PAHs類污染物的生態(tài)毒理學(xué)研究具有重要意義[2]。研究初期，研究者大多剖析優(yōu)先控制的16種PAHs，忽視PAHs衍生物的危害性[3]。苯并(a)芘、菲和蒽是最典型的3環(huán)PAHs，在石油中含量較高，關(guān)于其毒性的研究報道較多[4-5]。國內(nèi)外關(guān)于3-甲基菲和2-甲基蒽和苯并(a)芘毒性的研究缺乏，其毒性機(jī)理需深入研究。

CYP17A1(全稱為細(xì)胞色素P450c17α)是細(xì)胞色素P450酶系家族成員之一，該酶同時具有17α-羥化酶、17,20-裂解酶的活性，是一類典型的膜結(jié)合的雙功能單氧酶，在類固醇性激素合成的途徑中起關(guān)鍵作用，是治療前列腺癌和乳腺癌的重要靶標(biāo)[6]。PAHs能經(jīng)過不同途徑進(jìn)入生物體內(nèi)，從而導(dǎo)致細(xì)胞色素P450酶系CYP活力發(fā)生不同程度的改變，不同濃度不同種類的PAHs污染物會使CYP含量發(fā)生不一致的變化，因此，選用CYP17A1作為毒理學(xué)研究的生物標(biāo)志物，從而觀測生物體及生態(tài)環(huán)境污染程度。在本實驗中，選用克隆CYP17A1基因進(jìn)行相關(guān)研究，因為影響CYP17A1基因表達(dá)量的P450酶很難分離純化且不穩(wěn)定[7-8]。

中間球海膽(Strongylocentrotusintermedius)早期幼體主要以單胞藻類為食，當(dāng)變態(tài)為稚海膽轉(zhuǎn)食底棲硅藻，成體主要食褐藻類、紅藻類和綠藻類等大型底棲海藻[9]。我國遼東半島和山東半島有這種海膽的養(yǎng)殖[10]，實驗資源豐富，且生物特征無缺損，是毒理學(xué)研究的良好實驗體[11]。已有研究進(jìn)行了多環(huán)芳烴類污染物對翡翠貽貝(Pernaviridis)胚胎[12]、仿刺參(Apostichopusjaponicus)[13]和多齒圍沙蠶(PeriereisnuntiaSavigy)[14]的毒性評價。與其他海洋生物相比，PAHs污染物對海膽的毒性研究缺乏。因此，以中間球海膽為實驗對象，分別設(shè)置2組不同底物的對照組以及3組不同濃度的苯并(a)芘、3-甲基菲和2-甲基蒽處理組，檢測暴露3、7和14 d后其體內(nèi)CYP17A1基因的相對表達(dá)量。并且根據(jù)實驗數(shù)據(jù)分析中間球海膽CYP17A1基因的表達(dá)與苯并(a)芘、3-甲基菲和2-甲基蒽暴露濃度之間的關(guān)系，為篩選合適敏感標(biāo)志物提供基礎(chǔ)[15]。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

儀器：CFX Connect熒光定量PCR儀(美國BIO-RAD)，Nano-400A微量核酸蛋白分析儀(杭州奧盛儀器有限公司)，TG16-WS型臺式微量高速離心機(jī)(長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司)，TS-211GZ恒溫?fù)u床(常州中誠儀器制造有限公司)。

試劑：苯并(a)芘、2-甲基蒽和3-甲基菲購自Sigma公司(Sigma-Aldrich Corporation, USA)，純度分別為>97%、>97%和>98%；丙酮(分析純，太倉市雙龍貿(mào)易有限公司)，PrimeScriptTMRT reagent Kit、SYBR PrimeScriptTMRT-PCR Kit Ⅱ和Trizol RNA提取試劑盒均購自上海生工生物有限公司。

1.2 實驗材料

從大連海寶漁業(yè)有限公司購買健康的中間球海膽(Strongylocentrotusintermedius)，因稚海膽對污染物反應(yīng)靈敏，且其組織樣品獲取比較容易，故以稚海膽為實驗受體。選取直徑為(0.8±0.1) cm稚海膽，在實驗室海水循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中暫養(yǎng)2周，期間投喂新鮮海帶，選健康且狀態(tài)、大小相同的個體用于實驗。

1.3 多環(huán)芳烴毒性實驗

用海水作為實驗用水，裝入1 L潔凈玻璃燒杯中。將3種多環(huán)芳烴以體積分?jǐn)?shù)為1‰的丙酮為助溶劑配成500 μg·L-1的3種儲備液，再將這3種儲備液用海水稀釋成不同濃度的多環(huán)芳烴實驗溶液。其中，苯并(a)芘濃度分別為1、5和20 μg·L-1，3-甲基菲濃度分別為5、10和100 μg·L-1，2-甲基蒽濃度分別為5、10和50 μg·L-1，同時設(shè)置2個對照組，分別為空白對照組和1‰丙酮助溶劑對照組，各處理組設(shè)置3個平行組。實驗?zāi)M海膽生活習(xí)性，每個燒杯中放5只海膽，水溫(15±2) ℃，鹽度(30±1)，pH為8.0±0.5，連續(xù)充氣以防缺氧，確保溶解氧>4.0 mg·L-1，在弱光條件下進(jìn)行。

以開始培養(yǎng)為時間起始點，每隔2天換一次新鮮海水，并按以上述步驟重復(fù)投加相應(yīng)的濃度的污染物。

1.4 樣品采集及RNA提取

取在不同濃度苯并(a)芘、3-甲基菲和2-甲基蒽以及不同暴露時間的海膽各3只，為防止RNA流失，取出的海膽必須放在冰上進(jìn)行操作，用移液槍取海膽體液100 μL，裝入tube管后立即投入液氮，-80 ℃保存。

1.5 CYP17A1基因表達(dá)的測定

用PrimeScriptTMRT reagent Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，用CFX Connect熒光定量PCR儀并采用SYBR PrimeScriptTMRT-PCR Kit Ⅱ進(jìn)行實時定量PCR。反應(yīng)條件：95 ℃、30 s，95 ℃、10 s，55 ℃、25 s，72 ℃、25 s，40個循環(huán)。采用delta-deltaCT法，并通過海膽的內(nèi)標(biāo)基因AB510191.1(Actin)的校正，記錄實驗樣品中CYP17A1基因表達(dá)量。采用相對定量方法分析在不同濃度苯并(a)芘、2-甲基蒽和3-甲基菲培養(yǎng)下海膽細(xì)胞CYP17A1基因表達(dá)的規(guī)律，選取海膽體內(nèi)β-Actin基因表達(dá)的規(guī)律作為內(nèi)參基因，根據(jù)前期實驗獲得的海膽CYP17A1序列信息，采用Primer5.0軟件設(shè)計引物，引物序列具體信息如表1所示。

表1 相關(guān)基因擴(kuò)增引物名稱及其序列Table 1 Name and sequence of the target gene amplified with primers

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

實驗數(shù)據(jù)以3次重復(fù)試驗數(shù)據(jù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析利用SPSS 16統(tǒng)計軟件來完成，熒光定量PCR數(shù)據(jù)差異性分析用單因素方差分析法來完成。P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果(Results)

2.1 苯并(a)芘對中間球海膽CYP17A1基因表達(dá)的影響

海膽在不同濃度苯并(a)芘培養(yǎng)下，其CYP17A1表達(dá)量的變化如圖1所示。短時間內(nèi)，空白對照組CYP17A1基因的相對表達(dá)量高于丙酮對照組，但暴露后期(14 d)，2個對照組CYP17A1基因的相對表達(dá)量幾乎相近，說明丙酮對海膽CYP17A1基因的表達(dá)無影響。苯并(a)芘脅迫初期(3 d)，與丙酮對照組相比，各處理組海膽CYP17A1基因的相對表達(dá)量更高，而隨著脅迫濃度的升高，各處理組海膽CYP17A1基因的相對表達(dá)量逐漸降低，即受到的抑制作用逐漸升高，存在明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。苯并(a)芘脅迫中期(7 d)，隨著脅迫濃度的升高，海膽CYP17A1基因的相對表達(dá)量表現(xiàn)出顯著降低的趨勢。苯并(a)芘脅迫后期(14 d)，與丙酮對照組相比，5 μg·L-1和20 μg·L-1處理組對海膽CYP17A1基因的表達(dá)產(chǎn)生顯著作用，在脅迫濃度達(dá)到20 μg·L-1時，海膽CYP17A1基因的相對表達(dá)量達(dá)到最小值0.607(P<0.05)。

圖1 不同濃度苯并(a)芘對海膽體內(nèi)CYP17A1基因表達(dá)的影響注：將所有處理組與對照組進(jìn)行比較，標(biāo)有不同小寫字母者表示顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同小寫字母者表示無顯著性差異(P>0.05)；橫坐標(biāo)中B表示空白對照組，B-B表示丙酮助溶劑對照組；下同。Fig. 1 The effect of benzopyrene at different concentrations on the expression of CYP17A1 gene in Strongylocentrotus intermediusNote: All treatment groups were compared with the control group, significant difference (P<0.05) was indicated by different lowercase letters, while no significant difference (P>0.05) was indicated by the same lowercase letters; B represents the seawater control group and B-B represents the acetone control group; the same below.

2.2 不同濃度3-甲基菲對中間球海膽CYP17A1基因表達(dá)的影響

海膽在不同濃度3-甲基菲培養(yǎng)下，其CYP17A1表達(dá)量的變化如圖2所示。3-甲基菲脅迫初期(3 d)對海膽CYP17A1基因的表達(dá)表現(xiàn)出顯著的抑制作用(P<0.05)，隨著暴露濃度的升高，CYP17A1基因相對表達(dá)量逐漸降低，脅迫濃度達(dá)到100 μg·L-1時海膽CYP17A1基因的相對表達(dá)量明顯達(dá)到最小值0.153。3-甲基菲脅迫中期(7 d)，海膽CYP17A1基因的表達(dá)也受到顯著的抑制作用(P<0.05)。3-甲基菲脅迫后期(14 d)，隨著濃度增高，CYP17A1基因的相對表達(dá)量顯著增大，脅迫濃度達(dá)到100 μg·L-1時相對表達(dá)量達(dá)到最大值2.428，顯著大于對照組(P<0.05)。

圖2 不同濃度3-甲基菲對海膽體內(nèi)CYP17A1基因表達(dá)的影響Fig. 2 The effect of 3-methylphenanthrene at different concentrations on the expression of CYP17A1 gene in Strongylocentrotus intermedius

2.3 不同濃度2-甲基蒽對中間球海膽CYP17A1基因表達(dá)的影響

海膽在不同濃度2-甲基蒽培養(yǎng)下，其CYP17A1基因表達(dá)量的變化如圖3所示。2-甲基蒽脅迫初期(3 d)對海膽CYP17A1基因的表達(dá)表現(xiàn)出顯著的抑制作用(P<0.05)，且隨著暴露濃度的逐漸遞增，CYP17A1基因相對表達(dá)量逐漸降低，脅迫濃度達(dá)到50 μg·L-1時海膽CYP17A1基因的相對表達(dá)量達(dá)到最小值0.43。2-甲基蒽脅迫中期(7 d)，海膽CYP17A1基因的表達(dá)受到較顯著的抑制作用(P<0.05)。2-甲基蒽脅迫后期(14 d)，海膽CYP17A1基因的相對表達(dá)量隨著脅迫濃度的升高，逐漸降低，分別在脅迫濃度為5 μg·L-1和50 μg·L-1時CYP17A1基因的相對表達(dá)量達(dá)到最大值1.618和最小值0.164。

圖3 不同濃度2-甲基蒽對海膽體內(nèi)CYP17A1基因表達(dá)的影響Fig. 3 The effect of 2-methylanthracene at different concentrations on the expression of CYP17A1 gene in Strongylocentrotus intermedius

3 討論(Discussion)

從整體上看，高濃度苯并(a)芘(20 μg·L-1)和2-甲基蒽(50 μg·L-1)污染物長時間作用(14 d)會抑制CYP17A1基因的表達(dá)，且高濃度3-甲基菲污染物在3 d和7 d時也會抑制CYP17A1基因的表達(dá)。多芳環(huán)烴在海膽體內(nèi)的富集動力學(xué)研究表明，苯并(a)芘、3-甲基菲和2-甲基蒽隨暴露時間的增長和濃度的增加富集程度升高[16]?？梢酝茰y，有毒污染物進(jìn)入海膽體內(nèi)會阻止構(gòu)成CYP17A1基因的相關(guān)酶的合成，同時CYP17A1基因的表達(dá)可以反抑制污染物的作用，以維持生物有機(jī)體的正常生理活動，但不同濃度污染物作用時間不同會導(dǎo)致抑制強度不同，這與CYP17A1基因在生物體內(nèi)功能密切相關(guān)。免疫系統(tǒng)與新陳代謝系統(tǒng)彼此相互聯(lián)系，它們都參與生物機(jī)體抵抗外來侵害的過程，如抵御病毒、細(xì)菌以及其他外源化合物，而且生物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)與眾多激素類產(chǎn)物的調(diào)控過程相互關(guān)聯(lián)，其中，細(xì)胞色素氧化酶P450單氧化酶類起著重要的轉(zhuǎn)化作用[17]。CYP450酶系是一個大的基因家族，能生物轉(zhuǎn)化多種化合物，具有解毒和代謝的功能[18]。而CYP17A1是生物體內(nèi)CYP450血紅蛋白或相同結(jié)構(gòu)域的酶系，可以轉(zhuǎn)化來自生物體外的或存在生物體內(nèi)的多種化合物[18]。為維持生物有機(jī)體內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定，生物系統(tǒng)具有一定的防范保護(hù)措施，當(dāng)具有差異的外源化合物進(jìn)入生物體內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中的解毒和代謝系統(tǒng)發(fā)生響應(yīng)，及時發(fā)揮保護(hù)作用[19]。研究發(fā)現(xiàn)，進(jìn)入生物體內(nèi)的污染物在P450酶系的作用下，經(jīng)過一系列生物代謝，毒性大大降低[20]。在有機(jī)污染物Ι相代謝過程中，會生成活性氧產(chǎn)物，大量的活性氧會損傷生物機(jī)體，甚至?xí)柚笴YP17A1基因的表達(dá)[21-24]。在生物代謝過程中，用CYP450酶系轉(zhuǎn)化的原子氧可加快底物羥基化或環(huán)氧化，也可為下一轉(zhuǎn)化外源化合物的反應(yīng)酶提供基礎(chǔ)[25]。

在本實驗中，海膽CYP17A1基因的表達(dá)在苯并(a)芘脅迫14 d后受到抑制，在3-甲基菲脅迫3 d和7 d時均受到抑制，而3-甲基菲處理組(100 μg·L-1)脅迫14 d后表現(xiàn)出顯著的誘導(dǎo)作用(P<0.05)，在2-甲基蒽脅迫3 d和7 d時均受到抑制，而2-甲基蒽處理組(5 μg·L-1)脅迫14 d后表現(xiàn)出較顯著的誘導(dǎo)作用(P<0.05)。因此，海膽CYP17A1基因的表達(dá)在不同多環(huán)芳烴脅迫下表現(xiàn)出不同的變化規(guī)律。這與2-甲基蒽等對仿刺參(Apostichopusjaponicus)CYP450基因的影響[13]、苯并(a)芘對櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)消化盲囊中8-OHdG含量的影響[26]以及苯并(a)芘對黑鯛(Sparumacrocephalus)肝臟谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)活性的影響[27]有著相似的規(guī)律。由此可以推斷，剛開始反應(yīng)階段(3 d和7 d)苯并(a)芘誘導(dǎo)海膽CYP17A1基因的表達(dá)，生物機(jī)體利用相關(guān)酶抵制外源污染物的毒性作用，使細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)減緩，由于其調(diào)節(jié)能力有一定的限制，CYP17A1基因的表達(dá)不能永久提升，隨著暴露時間的增加(14 d)，海膽遭受到的毒性強度超過其最大耐受性，CYP17A1基因的合成系統(tǒng)會遭到破壞，因此，CYP17A1基因的相對表達(dá)量會降低，最終出現(xiàn)中毒現(xiàn)象。已有學(xué)者報道過相似的結(jié)果，王淑紅等[28]發(fā)現(xiàn)菲、芘等多環(huán)芳烴在暴露初期會誘導(dǎo)菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)消化腺超氧化物歧化酶(SOD)活性，而穆景利等[29]發(fā)現(xiàn)苯并(a)芘長時間作用會抑制黑鯛(Sparusmacrocephalus)膽汁中代謝產(chǎn)物3-羥基-苯并(a)芘的生成。而CYP17A1基因?qū)?-甲基菲和2-甲基蒽的耐受能力較弱，暴露初期(3 d和7 d)3-甲基菲和2-甲基蒽即抑制海膽CYP17A1基因的表達(dá)。但隨著暴露時間延長，在14 d時，有的處理組中海膽CYP17A1基因的表達(dá)顯著升高，是因為誘導(dǎo)了細(xì)胞色素P450相關(guān)系統(tǒng)發(fā)生解毒代謝的過程，進(jìn)而發(fā)生氧化應(yīng)激，使細(xì)胞體內(nèi)產(chǎn)生過量的活性氧，從而誘導(dǎo)CYP17A1基因家族的表達(dá)。在芘對馬氏珠母貝肝胰腺hsp90基因的影響以及石油烴對馬糞海膽(Hemicentrotuspulcherrimus)生殖腺過氧化氫酶(CAT)活性的影響的研究中發(fā)現(xiàn)類似規(guī)律[30-31]。對比可發(fā)現(xiàn)，3-甲基菲對海膽CYP17A1基因表達(dá)的影響小于2-甲基蒽。筆者比較了3種多環(huán)芳烴暴露下海膽CYP17A1基因的相對表達(dá)量(平均值)。在苯并(a)芘的影響下，海膽CYP17A1基因平均相對表達(dá)量為0.907；在3-甲基菲的影響下，海膽CYP17A1基因平均相對表達(dá)量為0.795；在2-甲基蒽的影響下，海膽CYP17A1基因平均相對表達(dá)量為0.782。3種物質(zhì)對海膽CYP17A1基因相對表達(dá)量影響程度總體趨勢為苯并(a)芘>3-甲基菲>2-甲基蒽，可能因為三者結(jié)構(gòu)及性質(zhì)的差異。為更完全了解污染物對海膽的毒性作用機(jī)理，需要進(jìn)一步研究化合物結(jié)構(gòu)對毒性的影響。