劉帥，劉歡，魏海峰,*，趙肖依，宋雪

1. 遼寧省近岸海洋環(huán)境科學(xué)與技術(shù)重點實驗室，大連 116023 2. 大連海洋大學(xué)海洋科技與環(huán)境學(xué)院，大連 116023 3. 大連海洋大學(xué)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，大連 116023

多環(huán)芳烴(PAHs)是石油等產(chǎn)品的主要組成成分，近期，受工業(yè)活動的影響，海洋生態(tài)系統(tǒng)中PAHs的含量顯著升高[1]。海洋溢油、工業(yè)廢水排放等，使多種PAHs侵入海洋環(huán)境，破壞海洋生態(tài)系統(tǒng)的平衡。石油毒性主要來源于其中的PAHs組分，PAHs約占石油組分的1%～6%，PAHs類污染物分布面積廣、致癌性作用強(qiáng)、數(shù)量多、與人類生命活動密切相關(guān)，是典型的“三致”物質(zhì)，其主要來源于有機(jī)物的熱解和不完全燃燒，具有殘留期長、高毒性和生物富集等特點，因此，研究PAHs類污染物的毒性具有重要的意義[2]。目前，大部分國家已將PAHs作為優(yōu)先控制的水環(huán)境污染物種類之一[3]。研究初期，學(xué)者大多研究水、大氣、土壤和沉積物中的PAHs[4]，也有研究海洋水生動植物體內(nèi)PAHs的含量[5-6]。國內(nèi)外關(guān)于PAHs對蝦夷扇貝幼體毒性的研究缺乏，因此，需對其毒性機(jī)理進(jìn)行深入研究。

蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)是我國主要的海水養(yǎng)殖貝類，其肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)價值和市場價值較高[7]。目前，關(guān)于蝦夷扇貝的研究集中以下方面：在銅脅迫對蝦夷扇貝鰓組織基因表達(dá)的影響[8]，PAHs對蝦夷扇貝幼貝血清酶活性的影響[9]，亞硝酸態(tài)氮對蝦夷扇貝早期生理指標(biāo)的影響[10]，6種苯系物對蝦夷扇貝的生殖毒性的影響[11]，以及蝦夷扇貝對鉛和鎘的生物富集與釋放規(guī)律和鎘、銅脅迫蝦夷扇貝的毒性作用機(jī)制等[12-13]。鑒于PAHs對蝦夷扇貝的毒性研究報道較少，本文進(jìn)行了PAHs對蝦夷扇貝幼體的急性毒性研究，對保護(hù)海洋生物生態(tài)環(huán)境和提高蝦夷扇貝存活率具有重要意義。以蝦夷扇貝為研究對象，進(jìn)行半靜水式急性毒性實驗，對暴露于不同濃度的苯并[a]芘、二甲基蒽、三甲基菲和惹烯后在1 h和4 h時觀察蝦夷扇貝卵子受精率的差異，獲得各污染下蝦夷扇貝幼體的半致死濃度、安全濃度，為評估PAHs對海洋生物安全的風(fēng)險提供基本理論和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

實驗所需已促熟的雌雄種貝購自獐子島漁業(yè)集團(tuán)大連旅順養(yǎng)殖場，挑選健康的個體，在農(nóng)村農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室海水養(yǎng)殖循環(huán)系統(tǒng)中暫養(yǎng)。實驗海水為大連砂濾海水，24 h持續(xù)充氣。其實驗用水溫度保持在20 ℃左右，鹽度30～31，pH 7.9，溶解氧保持在6 mg·L-1以上。種貝經(jīng)過促熟后獲得的性腺飽滿個體的精子和卵子用于實驗中。

苯并[a]芘、二甲基蒽、三甲基菲和惹烯，純度>95%，購自美國Sigma公司；丙酮，純度為99.5%，購自上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；過氧化氫和三羥甲基氨基甲烷，純度分別為30%和99%，均購自天津金匯太亞化學(xué)試劑有限公司。

先將苯并[a]芘、二甲基蒽、三甲基菲和惹烯用丙酮溶液分別配成500 mg·L-1的4種儲備液，用這4種儲備液和海水配制實驗所需的不同濃度PAHs溶液。

1.2 實驗方法

1.2.1 4種PAHs對蝦夷扇貝受精率的影響

在1 L玻璃燒杯中完成4種PAHs對蝦夷扇貝受精率影響的實驗，結(jié)合預(yù)實驗結(jié)果，確定苯并[a]芘、二甲基蒽、三甲基菲和惹烯的處理組為1、5、10和50 μg·L-1，并設(shè)置空白對照組和體積分?jǐn)?shù)為1‰的丙酮助溶劑對照組，對照組和處理組均設(shè)置3個平行樣。設(shè)置實驗組溶液為500 mL，加入一定體積的蝦夷扇貝精子和卵子，使精子密度約為每毫升60萬個，卵子的密度約為每毫升60個。攪拌均勻后，分別在1 h和4 h鏡檢統(tǒng)計受精率。為了方便觀察，用卵裂卵數(shù)與總卵數(shù)的比值反映受精率。

1.2.2 4種PAHs對蝦夷扇貝幼體的毒性作用

實驗水體條件與培養(yǎng)條件一致，S3期蝦夷扇貝D型幼蟲采用無光培養(yǎng)。4種PAHs的濃度設(shè)置同1.2.1。實驗進(jìn)行3 d，1～3 d中每天15:00對各實驗組進(jìn)行檢查，并記錄各處理組中蝦夷扇貝D型幼蟲的死亡數(shù)，死亡判斷標(biāo)準(zhǔn)為，通過顯微鏡觀察到幼體心跳停止[14]。并計算幼體的死亡率及半致死濃度(LC50)。每天清除死亡幼體，避免對水質(zhì)造成影響。

1.3 PAHs的LogP值與PAHs毒性關(guān)系研究

定量結(jié)構(gòu)-活性相關(guān)性(quantitative structure activity relationship, QSAR)模型是預(yù)測化合物毒性的高效模型，借助正辛醇/水分配系數(shù)(LogP)與致死率關(guān)系的QSAR模型預(yù)測PAHs毒性大小。

根據(jù)公式：Kow=co/cw，LogP=Log(co/cw)

得到LogP=LogKow

式中：co為物質(zhì)在辛醇中的濃度；cw為物質(zhì)在水相中的濃度。

LogP是辛醇/水分配系數(shù)，代表著某一化合物的親脂程度。4種PAHs的LogP值如表1所示。

表1 4種多環(huán)芳烴(PAHs)的結(jié)構(gòu)參數(shù)Table 1 Structural parameters of four polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs)

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗數(shù)據(jù)用Excel 2012軟件處理，分別計算出毒理學(xué)參數(shù)，包括死亡率、半致死濃度(LC50)與4種PAHs濃度對數(shù)相關(guān)方程。安全濃度(SC)由24 h和48 h的半致死濃度求出[15]。

安全濃度(SC)=48 h-LC50×0.3/(24 h-LC50/48 h-LC50)2

利用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，并利用單因素方差分析法進(jìn)行差異分析，分析各處理組和對照組之間的差異，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果(Results)

2.1 PAHs對蝦夷扇貝受精的影響

苯并[a]芘、二甲基蒽、三甲基菲和惹烯對蝦夷扇貝卵子受精率的影響結(jié)果如圖1～圖4所示。由圖1可知，隨著苯并[a]芘濃度的增加，蝦夷扇貝1 h和4 h的受精率都呈現(xiàn)了較明顯的下降趨勢。與對照組相比，1 h時，1、5、10和50 μg·L-1的苯并[a]芘處理組的蝦夷扇貝受精率分別下降了16.56%、18.95%、20.39%和20.71%；4 h時，1、5、10和50 μg·L-1的苯并[a]芘處理組的蝦夷扇貝受精率分別下降了10.59%、10.72%、37.50%和42.66%。1 h和4 h時苯并[a]芘濃度與受精率之間存在線性相關(guān)關(guān)系，相關(guān)方程分別為y= -2.4117x+ 51.599，R2= 0.7816和y= -5.9594x+ 74.035，R2= 0.8736。

由圖2可知，隨著二甲基蒽濃度的增加，蝦夷扇貝1 h和4 h的受精率都呈現(xiàn)了明顯的下降趨勢。與對照組相比，1 h時，1、5、10和50 μg·L-1的二甲基蒽處理組的蝦夷扇貝受精率分別下降了6.79%、12.62%、21.46%和32.73%；4 h時，1、5、10和50 μg·L-1的二甲基蒽處理組的蝦夷扇貝受精率分別下降了3.84%、12.95%、30.31%和43.75%。1 h和4 h二甲基蒽濃度與受精率之間存在線性相關(guān)關(guān)系，相關(guān)方程分別為y= -3.3529x+ 55.140，R2= 0.9307和y= -5.7154x+ 74.091，R2= 0.8832。

由圖3可知，隨著三甲基菲濃度的增加，蝦夷扇貝1 h和4 h的受精率都呈現(xiàn)了較明顯的下降趨勢。與對照組相比，1 h時，1、5、10和50 μg·L-1的三甲基菲處理組的蝦夷扇貝受精率分別下降了16.56%、20.39%、20.71%和20.97%；4 h時，1、5、10和50 μg·L-1的三甲基菲處理組的蝦夷扇貝受精率分別下降了34.38%、39.22%、39.69%和45.63%。1 h和4 h三甲基菲濃度與受精率之間存在線性相關(guān)關(guān)系，相關(guān)方程分別為y= -2.4643x+ 51.617，R2= 0.7736和y=-6.2203x+ 68.433，R2= 0.8323。

圖1 不同濃度苯并[a]芘作用下蝦夷扇貝的受精率注：標(biāo)有不同小寫字母者表示顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同小寫字母者表示無顯著性差異(P>0.05)；下同。Fig. 1 Fertilization rate of Patinopecten yessoensis under the treatment of benzo[a]pyrene at different concentrationsNote: The different letters indicate significant differences at the 0.05 probability level, and the same letters indicate no significant differences; the same below.

圖2 不同濃度二甲基蒽作用下蝦夷扇貝的受精率Fig. 2 Fertilization rate of Patinopecten yessoensis under the treatment of 9,10-dimethylanthracene at different concentrations

圖3 不同濃度三甲基菲作用下蝦夷扇貝的受精率Fig. 3 Fertilization rate of Patinopecten yessoensis under the treatment of 1, 9, 10-trimethylphenanthrene at different concentrations

圖4 不同濃度惹烯作用下蝦夷扇貝的受精率Fig. 4 Fertilization rate of Patinopecten yessoensis under the treatment of retene at different concentrations

由圖4可知，隨著惹烯濃度的增加，蝦夷扇貝1 h和4 h的受精率都呈現(xiàn)了較明顯的下降趨勢。與對照組相比，1 h時，1、5、10和50 μg·L-1的惹烯處理組的蝦夷扇貝受精率分別下降了8.81%、18.95%、21.78%和25.43%；4 h時，1、5、10和50 μg·L-1的惹烯處理組的蝦夷扇貝受精率分別下降了38.53%、51.52%、54.05%和58.33%。1 h和4 h惹烯濃度與受精率之間存在線性相關(guān)關(guān)系，相關(guān)方程分別為y= -2.7414x+ 52.553，R2= 0.9663和y= -5.9594x+ 74.035，R2= 0.8736。

實驗中，丙酮對照組與空白對照組的受精率無顯著差異(P<0.05)，表明丙酮助溶劑對照組可代替空白對照組。苯并[a]芘、二甲基蒽、三甲基菲和惹烯高濃度處理組對蝦夷扇貝卵子的受精有顯著抑制作用，濃度越高抑制作用越顯著，呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。經(jīng)過比較發(fā)現(xiàn)，這4種多環(huán)芳烴對蝦夷扇貝的抑制率大小關(guān)系為：惹烯>三甲基菲>二甲基蒽>苯并[a]芘。

2.2 PAHs對蝦夷扇貝幼體的半致死濃度(LC50)和安全濃度(SC)

4種PAHs對蝦夷扇貝幼體在9、24和48 h的LC50及SC結(jié)果如表2所示。蝦夷扇貝幼體在4種PAHs中暴露9、24和48 h時的LC50隨時間的增加呈現(xiàn)下降的趨勢。由于PAHs污染物毒性具有一定的累積性，暴露時間越長，導(dǎo)致生物的死亡率越高。苯并[a]芘、二甲基蒽、三甲基菲和惹烯對蝦夷扇貝幼體48 h-LC50分別為48.13、68.42、92.40和63.97 mg·L-1，故PAHs對蝦夷扇貝幼體毒性大小排序為苯并[a]芘>惹烯>二甲基蒽>三甲基菲。4種PAHs對蝦夷扇貝幼體安全濃度順序為惹烯(4.68 mg·L-1)>三甲基菲(2.8 mg·L-1)>苯并[a]芘(2.49 mg·L-1)>二甲基蒽(2.25 mg·L-1)。

3 討論(Discussion)

生態(tài)系統(tǒng)中的PAHs會對海洋生物產(chǎn)生一定的毒害作用，被我國確定為需要優(yōu)先控制的環(huán)境污染物[16-18]。1986年，我國原環(huán)境保護(hù)局在《生物技術(shù)檢測規(guī)范(水環(huán)境部分)》分類標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定，LC50≤0.1 mg·L-1，為劇毒；0.1 mg·L-1﹤LC50≤1.0 mg·L-1，為高毒；1.0 mg·L-1﹤LC50≤10.0 mg·L-1，為中毒；LC50>10.0 mg·L-1，為低毒。本實驗中，苯并[a]芘、二甲基蒽、三甲基菲和惹烯的毒性程度均屬于低毒，它們對蝦夷扇貝毒性大小排序為：苯并[a]芘>惹烯>二甲基蒽>三甲基菲。

親代蝦夷扇貝暴露于PAHs下，其卵子的受精能力會發(fā)生改變，且親本繁殖能力也顯著降低，在壓力環(huán)境下蝦夷扇貝性腺內(nèi)性細(xì)胞的再吸收作用可以使蝦夷扇貝將更多的能量分配到細(xì)胞解毒和保護(hù)過程中，導(dǎo)致蝦夷扇貝產(chǎn)卵量和排精量較正常情況有所降低，因此，可以推測親本產(chǎn)卵量和排精量與PAHs濃度具有一定的關(guān)系[19]。而且PAHs釋放的毒性會對親本造成傷害，親本的遺傳毒性會隨蝦夷扇貝配子傳遞給子代，影響子代的胚胎發(fā)育[19]。本實驗結(jié)果表明，隨著苯并[a]芘、二甲基蒽、三甲基菲和惹烯處理組濃度逐漸增加，蝦夷扇貝卵子的受精率呈現(xiàn)下降的趨勢，幼體死亡率呈現(xiàn)上升的趨勢。相同暴露時間，處理組濃度越高，則對蝦夷扇貝發(fā)育影響越大，存在明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。這表明，PAHs影響了蝦夷扇貝卵子的受精能力，這可能與壓力環(huán)境下蝦夷扇貝卵子受精能力較正常情況有所降低有關(guān)。在苯并[a]芘和二甲基蒽對皺紋盤鮑(Haliotisdiscushannai)早期發(fā)育的毒性研究中[20]，隨著苯并[a]芘和二甲基蒽濃度的增加，皺紋盤鮑卵子受精率降低，胚胎發(fā)育時間和胚胎死亡率明顯增加，研究結(jié)果與本文表現(xiàn)出相似的規(guī)律。本實驗中，4 h對照組蝦夷扇貝卵子的受精率高于1 h對照組，是由于累計受精率增加，但4 h PAHs處理組蝦夷扇貝卵子的受精率出現(xiàn)高于或低于1 h對照組的情況，這與累計受精率受到不同濃度PAHs的抑制作用有關(guān)。

相關(guān)研究顯示，海洋生物對外界污染物毒性較為敏感的時期是胚胎和幼體時期，因此，研究胚胎和幼體毒性閾值可以反映海洋污染狀況，而蝦夷扇貝D型幼蟲對毒性作用具有較高的敏感性，故選取蝦夷扇貝D型幼蟲為實驗對象[21]。在4種PAHs的暴露下，蝦夷扇貝D型幼蟲存活率隨PAHs濃度的升高顯著降低，這表明，高濃度PAHs對蝦夷扇貝D型幼蟲危害較高，呈現(xiàn)顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系。研究表明，PAHs對海洋生物胚胎和幼體產(chǎn)生不同程度的影響，從而影響海洋生物生命活動[22]：4種PAHs會使仿刺參(Apostichopusjaponicus)相關(guān)組織損傷，導(dǎo)致有機(jī)體死亡[23]；二甲苯降低斑馬魚(Brachydaniorerio)胚胎的孵化率，導(dǎo)致胚胎幼體死亡或幼魚發(fā)育畸形[24]。由此可以推測，親本的遺傳毒性會隨蝦夷扇貝配子傳遞給子代，影響子代的胚胎發(fā)育，在環(huán)境壓力的脅迫下親本的DNA受到損傷，也會引起子代畸形率增加[25]。本實驗中，高濃度PAHs導(dǎo)致蝦夷扇貝幼體死亡，可能與PAHs對蝦夷扇貝幼體有毒性損傷作用以及PAHs提高了蝦夷扇貝的死亡率有關(guān)。

表2 4種PAHs對蝦夷扇貝幼體的毒性回歸方程、半致死濃度和安全濃度Table 2 Regression equation, median lethal concentration and safe concentration of four PAHs on larva of Patinopecten yessoensis

QSAR模型是預(yù)測化合物毒性的高效模型，它可被用于預(yù)測持久性有機(jī)物(POPs)的芳烴受體配合能力，也可用于預(yù)測PAHs毒性[26-27]。辛醇/水分配系數(shù)(LogP)的值越大，可能對生物體傷害越大[28]。苯并[a]芘、二甲基蒽、三甲基菲和惹烯LogP值分別為5.97、5.69、4.57和5.42。故推測其毒性大小排序為：苯并[a]芘>二甲基蒽>惹烯>三甲基菲。本實驗蝦夷扇貝幼體在暴露于苯并[a]芘、二甲基蒽、三甲基菲和惹烯后，隨暴露時間的延長和PAHs濃度的提高，受精率逐漸降低，幼體死亡率顯著增加，呈現(xiàn)顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系。但利用QSAR模型[26]分析PAHs對蝦夷扇貝幼體的致死毒性的結(jié)果與實驗結(jié)果不完全一致，這可能與蝦夷扇貝幼體細(xì)胞特殊的物質(zhì)性質(zhì)密切相關(guān)，也可能與PAHs對海洋生物作用機(jī)理不同密切相關(guān)，需要進(jìn)一步深入研究。