唐自強(qiáng)，馮長君

1. 徐州工程學(xué)院材料與化學(xué)工程學(xué)院，徐州 221018 2. 徐州技師學(xué)院，徐州 221151

分子結(jié)構(gòu)是決定物質(zhì)理化性質(zhì)及其在環(huán)境中遷移轉(zhuǎn)化行為和生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng)的內(nèi)因，因此，結(jié)構(gòu)與性質(zhì)之間具有內(nèi)在聯(lián)系，以數(shù)學(xué)方程形式予以表達(dá)，就形成定量結(jié)構(gòu)-活性相關(guān)關(guān)系(quantitative structure-activity relationship, QSAR)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)診斷為質(zhì)量良好的QSAR模型，可為有機(jī)污染物環(huán)境毒性評估提供參考信息，以降低昂貴的測試費(fèi)用和減少動物實(shí)驗(yàn)[1-8]。

硝基芳烴類有機(jī)物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，種類繁多且復(fù)雜，難以降解，屬高毒污染物。因此，這類化合物一直備受關(guān)注，有些硝基芳烴已被美國環(huán)境保護(hù)局和中國生態(tài)環(huán)境保護(hù)部列入優(yōu)先控制污染物黑名單。為預(yù)測硝基芳烴類化合物生物毒性，閆秀芬等[9]和顧云蘭等[10]采用量化方法研究硝基芳烴對梨形四膜蟲(Tetrahymenapyriformis)的急性毒性(以半數(shù)生長抑制濃度的負(fù)對數(shù)值(pIC50)表征)；何琴等[11]和堵錫華等[12]基于人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法給出45種硝基芳烴對梨形四膜蟲急性毒性的良好QSAR模型；金飆等[13]以量化參數(shù)給出了36種硝基芳烴對梨形四膜蟲急性毒性的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型；Liao等[14]以三維全息原子相互作用矢量場的(three-dimensional holographic vector of atomic interaction field, 3D-HoVAIF)方法建立了上述45種硝基芳烴對梨形四膜蟲急性毒性的QSAR模型。這些研究多為QSAR的二維方法，且所用三維-定量構(gòu)效關(guān)系(3D-QSAR)方法[15-17]中也沒有涉及使用最為廣泛的比較分子力場分析法(comparative molecular force field analysis, CoMFA)。因此，筆者以CoMFA方法建立了45種硝基芳烴對梨形四膜蟲急性毒性pIC50值[14]的3D-QSAR模型，以揭示硝基芳烴分子周圍立體場和靜電場分布對其急性毒性的影響，探討其生物毒性作用的分子機(jī)理。

1 數(shù)據(jù)來源(Data source)

45種硝基芳烴對梨形四膜蟲的急性毒性，以IC50表示，文獻(xiàn)[14]給出其pIC50。硝基芳烴分子的具體結(jié)構(gòu)及pIC50值如表1所示。

表1 硝基芳烴的分子結(jié)構(gòu)與急性毒性pIC50值Table 1 The molecular structures and pIC50 value of acute toxicity of nitroaromatic compounds

2 建模方法(Modeling method)

使用Tripos公司最新版本Sybylx2.1.1分子模擬軟件完成45種硝基芳烴[14]對梨形四膜蟲的急性毒性的3D-QSAR分析及建立CoMFA模型。

2.1 化合物低能構(gòu)象的確定及分子疊合

一般采用分子的最低能量構(gòu)象代替其生物活性構(gòu)象。首先使用Sybylx2.1.1軟件中的Sketch Molecule模塊構(gòu)建45個(gè)硝基芳烴分子[14]的初始三維空間結(jié)構(gòu)，然后通過Minimize模塊，選取Tripos力場，加Gasteiger-Huckel電荷。以此進(jìn)行所有分子的分子力學(xué)優(yōu)化，獲取相應(yīng)最低能量構(gòu)象，并以此構(gòu)象作為分子疊合的生物活性構(gòu)象。

將45個(gè)硝基芳烴分子按照從低至高排序，遵循5∶1原則選取分子2、7、12、17、22、27、32、37、42和45為測試集(test set)，其中，45號為模板分子；余下36個(gè)分子作為訓(xùn)練集(training set)，亦含45號模板分子。在CoMFA研究中，所謂模板分子是指總體生物活性最強(qiáng)的分子。常用的是基于公共骨架的原子契合疊合方法，即保證所有分子取向的一致性，使分子間相互重疊時(shí)的均方根偏差最小。以對梨形四膜蟲的急性毒性pIC50值最大的2,3,4,5-四氯硝基苯分子中的公共骨架，運(yùn)用Align Database模塊分別對訓(xùn)練集和測試集中分子予以疊合。訓(xùn)練集的疊合圖如圖1所示(測試集的疊合圖與圖1相同，故予以省略)，由圖1可知，公共骨架的原子契合非常密切，呈現(xiàn)良好的疊合效果。

2.2 CoMFA模型的建立

采用Tripos標(biāo)準(zhǔn)力場，對訓(xùn)練集和測試集的疊合分子周圍每個(gè)網(wǎng)格點(diǎn)上的立體場(steric, St)和靜電場(electrostatic, El)的場能值進(jìn)行計(jì)算，采用偏最小二乘法(partial least squares, PLS)方法進(jìn)行建模[18-19]。第一步，用逐一剔除法(leave-one-out, LOO)予以交叉驗(yàn)證，即以pIC50為因變量，場能值為自變量建模，得交叉驗(yàn)證系數(shù)(Q2)和最佳主成分?jǐn)?shù)(N)。以Q2衡量模型的穩(wěn)健性與預(yù)測能力，Q2>0.5的模型，才具有95%的可信度[20]，所含機(jī)會相關(guān)的可能性<5%。模型中的化合物數(shù)(m)與變量數(shù)(即最佳主成分?jǐn)?shù))之比稱為樣變比(Sv)。只有滿足Sv≥5的模型，才可能具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義且或然性較低[21-22]。第二步，用非交叉驗(yàn)證的回歸分析，得到非交叉驗(yàn)證判定系數(shù)(R2)、估計(jì)標(biāo)準(zhǔn)誤差(SD)和統(tǒng)計(jì)方差比(F)。一般認(rèn)為，判定系數(shù)(R2)>0.80的方程是合理的，具有良好的擬合能力[23]。最后采用View CoMFA模塊，以三維等勢圖直觀反映出立體場和靜電場對化合物pIC50的貢獻(xiàn)。

3 結(jié)果與討論(Results and discussion)

3.1 CoMFA的3D-QSAR模型

訓(xùn)練集的CoMFA模型：交叉驗(yàn)證部分中Q2=0.738>0.5，N=5，Sv=m/N=7.2>5，表明模型具有很好的預(yù)測能力和穩(wěn)健性；非交叉驗(yàn)證部分中R2=0.932>0.8，顯示急性毒性與場能之間具有良好相關(guān)性；在95%顯著性水平下，訓(xùn)練集的CoMFA模型的F臨界值為F0.05(5,30)=2.53。而模型的F值為82.40，是其臨界值2.53的32倍之多，表明所建模型密切相關(guān)。該模型的SD為0.201，僅是最大差值(ΔS=pIC50 max-pIC50 min=2.74-0.14=2.60)的7.7%，<10%，說明不存在離異點(diǎn)[24]。利用訓(xùn)練集的模型對測試集中分子的pIC50進(jìn)行預(yù)測，以檢驗(yàn)其預(yù)測能力。測試集的pIC50預(yù)測值如表1所示，與相應(yīng)實(shí)驗(yàn)值基本吻合，平均絕對誤差僅為0.28，表明模型確實(shí)具有較好的預(yù)測能力。

3.2 CoMFA等勢圖

圖2(a)為訓(xùn)練集中以pIC50最高的分子45號為模板的CoMFA模型的三維立體作用分布圖，其中，綠色區(qū)域表示增大取代基體積有利于提高化合物的急性毒性，黃色區(qū)域?yàn)闇p小立體位阻有利于提高急性毒性。由立體場的空間分布可知，在硝基的2、3和6位的3個(gè)位置上引入體積較大基團(tuán)，相應(yīng)化合物的pIC50升高。例如，在硝基的2、3和6位的3個(gè)位置上，溴取代的化合物急性毒性pIC50值高于氯取代的。分子17號強(qiáng)于12號，26號強(qiáng)于16號，29號強(qiáng)于23號。尚需指出，圖2(a)中未出現(xiàn)黃色區(qū)域，這可能因?yàn)樵诒江h(huán)上的所有取代基的體積都比梨形四膜蟲體內(nèi)靶標(biāo)提供的空穴要小，不存在空間位阻。

圖1 訓(xùn)練集的三維疊合圖Fig. 1 The three dimensional view of all the aligned molecules in training set

圖2 CoMFA模型的立體場(a)與靜電場(b)等勢圖注：CoMFA表示比較分子力場分析。Fig. 2 CoMFA contour maps for (a) steric field and (b) electrostatic fieldNote: CoMFA stands for comparative molecular force field analysis.

圖2(b)為45號分子周圍的靜電場分布圖，藍(lán)色區(qū)域?yàn)樵龃蠡鶊F(tuán)正電性有利于化合物活性的提高，紅色區(qū)域則表示引入帶負(fù)電荷的基團(tuán)對活性有利。由靜電場的空間分布可知，僅有一塊藍(lán)色區(qū)域在硝基的2、3位，且覆蓋苯環(huán)2、3位上的碳原子；紅色區(qū)域較多，表現(xiàn)出硝基的2、3位之間以及較遠(yuǎn)離3位的2個(gè)紅色區(qū)域?qū)毙远拘杂绊戄^大。如在硝基的2、3位的2個(gè)位置上，氟(負(fù)電性最強(qiáng)的取代基)取代的化合物急性毒性pIC50值強(qiáng)于氯(負(fù)電性較弱)取代的。分子34號強(qiáng)于21號，37號強(qiáng)于32號。

訓(xùn)練集模型的立體場和靜電場對pIC50值的貢獻(xiàn)率依次為39.0%和61.0%，表明靜電場強(qiáng)于立體場。其中，靜電場主要為電荷庫倫力、氫鍵和配位作用。苯環(huán)上連有負(fù)電基團(tuán)(—F、—Cl)等，使苯環(huán)上正電荷量增加，易進(jìn)攻梨形四膜蟲體內(nèi)酶、蛋白質(zhì)等生物大分子的重要功能基團(tuán)(如帶有負(fù)電荷的巰基、羥基和氨基等),從而影響梨形四膜蟲的正常生理功能，導(dǎo)致生物中毒。另外，苯環(huán)上的負(fù)電基團(tuán)可與靶標(biāo)內(nèi)金屬離子形成配位鍵。對于立體場，一般包含空間位阻和疏水作用。其中，取代基體積越大，相應(yīng)分子疏水性越強(qiáng)，脂溶性越好，越易被細(xì)胞膜富集而產(chǎn)生生物毒性。顧云蘭等[10]以量化參數(shù)建立了化合物的三元數(shù)學(xué)模型，模型中的變量包括苯環(huán)上凈電荷增量(ΔQR)、分子體積(V)和最低空軌道能。顯然，本研究結(jié)果與之基本一致。

綜上所述，本研究結(jié)果表明：

(1)基于CoMFA方法研究硝基芳烴對梨形四膜蟲急性毒性pIC50值的三維定量構(gòu)效關(guān)系：N=5，Sv=7.2，Q2=0.738，R2=0.932，F(xiàn)=82.40，顯示良好的相關(guān)性、穩(wěn)定性和預(yù)測能力。

(2)所建CoMFA模型的三維等勢圖較好地解釋了硝基芳烴對梨形四膜蟲急性毒性pIC50值的影響，主要表現(xiàn)在苯環(huán)的2、3-位上鍵合體積較大的負(fù)電基團(tuán)(如—F、—Cl等)利于急性毒性的增強(qiáng)。