酶解-乙醇輔助法提取燈籠椒中的辣椒籽油及其抗菌活性研究

毛永楊，楊桐，李智高，蘇濤，田金蘭

(1.大理州食品檢驗檢測院，云南 大理 671000；2.大理市洱海管理局，云南 大理 671000)

辣椒(CapsicumannuumL.)屬于茄科辣椒屬植物，原產(chǎn)地為中美洲和南美洲，至今在我國已有 300 多年的栽培歷史[1]。近年來，我國辣椒年種植面積持續(xù)穩(wěn)定在 147萬公頃以上，是我國種植面積最大的蔬菜作物[2]。2017年的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示：我國辣椒種植面積占世界辣椒種植總面積的 35%；近3年平均年產(chǎn)量2800萬噸，占世界辣椒總產(chǎn)量的46%；年產(chǎn)值逾700億元，占世界蔬菜總產(chǎn)值的 16.67%，辣椒產(chǎn)業(yè)已成為我國最大的蔬菜產(chǎn)業(yè)[3,4]。目前全世界辣椒及其制品的種類高達(dá)1000余種，食辣人群占比超過20%，而在我國食辣人群則多達(dá)40%；在生產(chǎn)大量辣椒及其制品的同時，將伴隨有大量的副產(chǎn)物產(chǎn)生。施曉艷等人的研究表明在干全辣椒中果皮占50%，種子約占39%，其余部分約占11%，辣椒加工過程中占干椒全果質(zhì)量約39%的辣椒籽被廢棄，造成大量辣椒籽的浪費[5]。

辣椒及辣椒籽中均富含脂肪、磷脂、脂溶性維生素、辣椒堿、黃酮、微量元素、茴香腦、色素、芳香化合物等有效成分[6-10]，同時辣椒及辣椒籽的提取物均具有較好的抗氧化和抑菌作用[11,12]。因此，將辣椒籽變廢為寶不僅能夠提高企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益，同時也可為食品生產(chǎn)提供天然、安全的抗菌劑和油料資源。

近年來，隨著對植物油新型提取方法及其組分分析研究的深入，為辣椒籽油的提取及其新功能的開發(fā)利用等提供了較好的理論依據(jù)[13-16]。本研究采用酶解-乙醇輔助法制備辣椒籽油，與傳統(tǒng)方法相比，該方法在提取過程中避免了有毒溶劑的使用，提取的油脂無需過度精煉，能有效降低能耗和節(jié)約成本，可去除油料中的部分有毒因子，同時實驗考察了辣椒油的抗菌活性，以期為食品在生產(chǎn)過程中提供新型的綠色食品添加劑，提高食品的安全性和市場競爭力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

果膠酶、中性蛋白酶、纖維素酶：均購自天津諾奧酶制劑有限公司；MH 培養(yǎng)基、標(biāo)準(zhǔn)菌株：購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；燈籠椒辣椒籽：購于農(nóng)貿(mào)市場。

1.2 儀器與設(shè)備

Milli-Q 超純水處理系統(tǒng)(出水電阻率18.2 MΩ·cm) 美國密利博公司；渦旋振蕩器 美國Thermo 公司；BSP-250生化培養(yǎng)箱 上海博迅實業(yè)有限公司；FE20K plus pH計、AB-204s電子天平 瑞士 Mettler Toledo公司；BSC-1100 II A2生物安全柜 東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 提取方法

去除辣椒籽中的雜質(zhì)，將辣椒籽粉碎后過篩，準(zhǔn)確稱取一定量的過篩后的辣椒籽粉，按比例加入溶劑和酶，在設(shè)定的pH及溫度條件下酶解、浸提，溶劑回收得到辣椒籽油、計算辣椒籽油的提取率。其具體工藝如下：粉碎過篩后的辣椒籽粉→按料液比浸泡→調(diào)節(jié)酶解體系pH 值→特定溫度酶解→水浴高溫滅酶→調(diào)整水分含量→乙醇浸提→抽濾分離→旋蒸回收乙醇→辣椒籽油。提取率的計算公式如下：

1.3.2 提取方法的優(yōu)化

實驗分別考察了辣椒籽的粉碎粒度、料液比、單一酶及復(fù)合酶、酶添加比例、酶解體系的pH值、酶解溫度及酶解時間對辣椒籽油提取率的影響。同時對酶解后的乙醇提取條件進(jìn)行了優(yōu)化。

1.3.2.1 辣椒籽的粉碎粒度對提取率的影響

分別準(zhǔn)確稱取20 g(精確至0.1 g)未粉碎、粉碎后過40，60，80，100目篩的辣椒籽粉，分別加入100 mL無水乙醇， 80 ℃水浴浸提 6 h，回收溶劑，計算提取率。

1.3.2.2 料液比對提取率的影響

準(zhǔn)確稱取 10 g(精確至0.1 g) 80 目的辣椒籽粉，分別加入30，40，50，60，70，80，90，100 mL超純水，將 pH 調(diào)至5.5，加入活化的1%纖維素酶、1%的中性蛋白酶和1%的果膠酶， 50 ℃水浴酶解 5 h，然后升溫至 85 ℃，恒溫10 min使酶滅活，調(diào)整水分后加入 8倍體積的無水乙醇于 80 ℃下浸提2 h，計算提油率，確定最佳用量比。

1.3.2.3 酶種類及添加量對提取率的影響

稱取 10 g(精確至0.1 g)80 目的辣椒籽粉，選取 60 mL(1∶6)的超純水，分別加入 1%的中性蛋白酶、果膠酶、纖維素酶； 0.5%中性蛋白酶+0.5%纖維素酶，0.5%纖維素酶+0.5%果膠酶，0.5%果膠酶+0.5%中性蛋白酶，0.5%纖維素酶+0.5%果膠酶+0.5%中性蛋白酶， pH 為5.5，50 ℃水浴酶解 5 h，然后升溫至 85 ℃，恒溫10 min使酶滅活，調(diào)整水分后加入 8倍體積的無水乙醇于 80 ℃下浸提2 h，計算提取效率。同時參照上述方法，分別加入 0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%、1.2%、1.5%的果膠酶和中性蛋白酶，考察復(fù)合酶添加量對提取率的影響。

1.3.2.4 酶解pH值對提取率的影響

分別稱取 10 g(精確至0.1 g)80 目的辣椒籽粉，選取 60 mL(1∶6)的超純水，將pH值分別調(diào)節(jié)至3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，加入0.8%的中性蛋白酶和1%的果膠酶。

50 ℃水浴酶解 5 h，然后升溫至 85 ℃，恒溫10 min使酶滅活，調(diào)整水分后加入 8倍體積的無水乙醇于80 ℃下浸提2 h，計算提取效率，確定最佳pH值。

1.3.2.5 酶解溫度對提取效率的影響

分別稱取 10 g(精確至0.1 g)80 目的辣椒籽粉，選取 60 mL(1∶6)的超純水，將pH值分別調(diào)節(jié)至5.5，加入0.8%的中性蛋白酶和1%的果膠酶；分別在30，35，40，45，50，55，60，65，70 ℃溫度下酶解 5 h，然后升溫至 85 ℃，恒溫10 min使酶滅活，調(diào)整水分后加入 8倍體積的無水乙醇于 80 ℃下浸提2 h，計算提取率，確定最佳酶解溫度。

1.3.2.6 酶解時間對提取率的影響

分別稱取 10 g(精確至0.1 g)80 目的辣椒籽粉，選取 60 mL(1∶6)的超純水，將pH值分別調(diào)節(jié)至5.0，加入0.8%的中性蛋白酶和1%的果膠酶；分別在50 ℃下酶解3，3.5，4，4.5，5，5.5，6 h，然后升溫至85 ℃，恒溫10 min使酶滅活，調(diào)整水分后加入8倍體積的無水乙醇于 80 ℃下浸提2 h，計算提取率，確定最佳酶解時間。

1.3.3 辣椒籽油抗菌活性測定方法[17]

采用倍比稀釋法對提取的辣椒籽油進(jìn)行稀釋，分別稀釋成 1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1024共10個稀釋度，在一次性無菌培養(yǎng)皿中分別加入1 mL不同濃度的稀釋液和 14 mL 高壓蒸汽滅菌后冷卻至45 ℃左右的MH培養(yǎng)基充分混勻，培養(yǎng)基凝固后備用。平板內(nèi)分別以1 mL無菌蒸餾水代替辣椒籽油制備陽性對照平板。菌液配制：將各活化后的標(biāo)準(zhǔn)菌株用無菌生理鹽水調(diào)至菌液濃度為1.0×106CFU/mL。最低抑菌濃度(MIC)測定及結(jié)果判定：采用多點接種儀將實驗菌株的菌液加入不同濃度梯度的含辣椒籽油平板和陽性對照平板，并以生理鹽水代替菌液作陰性對照。(37±1) ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，觀察各菌株在含不同濃度辣椒籽油平板中的生長情況；并以無細(xì)菌生長平板內(nèi)辣椒籽油的最小濃度作為其對該菌株的最低抑菌濃度(MIC)。

2 實驗結(jié)果

本研究分別對辣椒籽油的提取方法進(jìn)行了優(yōu)化，對辣椒籽油的抗菌活性進(jìn)行了考察,對辣椒籽油的揮發(fā)性成分進(jìn)行了初步分析，以期為辣椒籽油的初步應(yīng)用提供參考。

2.1 辣椒籽油提取方法的優(yōu)化

2.1.1 辣椒籽的粉碎粒度對辣椒籽油提取率的影響

實驗考察了辣椒籽的粉碎粒度對辣椒籽油提取率的影響，實驗結(jié)果見圖1。

圖1 粉碎粒度對辣椒籽油提取率的影響Fig.1 Effect of particle size on extraction rate of Capsicum seed oil

由圖1可知，粒度從 40目增加到80目時，提取率逐漸升高，在80目時提取率達(dá)到最高。當(dāng)粒度達(dá)到100目提取率略有下降。這主要是由于辣椒籽的破碎程度越高，粉碎時間就越長，粉碎機(jī)的產(chǎn)熱量越大造成油分損失，從而影響提油的效果，故在實驗中選取辣椒籽粉的粒度為80目。

2.1.2 料液比對辣椒籽油提取率的影響

實驗對水-酶反應(yīng)體系的料液比進(jìn)行了考察，實驗結(jié)果見圖2。

圖2 料液比對辣椒籽油提取率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of Capsicum seed oil

由圖2可知，隨著料液比的增大，辣椒籽油的提取率逐漸增大。當(dāng)料液比為1∶6時，辣椒籽油的提取率為21.26%，達(dá)到最大，說明在此條件下酶解體系反應(yīng)最充分。因此，實驗中選擇1∶6為最佳料液比。

2.1.3 酶種類及添加量對辣椒籽油提取率的影響

實驗對中性蛋白酶、果膠酶、纖維素酶以及這3種酶不同組合方式的辣椒籽油提取率進(jìn)行了比較分析，同時對酶的添加量進(jìn)行了考察，結(jié)果見圖3和圖4。

圖3 單一酶和復(fù)合酶對辣椒籽油提取率的影響Fig.3 Effect of single enzyme and compound enzymes on extraction rate of Capsicum seed oil

注：1表示1% 中性蛋白酶；2表示1% 果膠酶；3表示1%纖維素酶；4表示0.5%中性蛋白酶+0.5%纖維素酶；5表示0.5%纖維素酶+0.5%果膠酶；6表示0.5%果膠酶+0.5%中性蛋白酶；7表示0.5%纖維素酶+0.5%果膠酶+0.5%中性蛋白酶。

由圖3可知，復(fù)合酶的提取率優(yōu)于單一酶的提取率；0.5%果膠酶+0.5%中性蛋白酶與 0.5%纖維素酶+0.5%果膠酶+0.5%中性蛋白酶的提取率基本一致。在實際應(yīng)用中考慮到酶的經(jīng)濟(jì)成本，選取中性蛋白酶和果膠酶作為復(fù)合酶體系。

實驗考察了中性蛋白酶和果膠酶復(fù)合體系中酶的添加量，實驗結(jié)果見圖4。

圖4 酶添加量對辣椒籽油提取率的影響Fig.4 Effect of the additive amount of enzymes on extraction rate of Capsicum seed oil

由圖4可知，中性蛋白酶的最佳添加量為0.8%，果膠酶的最適添加量為1%。

2.1.4 酶解pH值及溫度對提取率的影響

實驗分別考察了酶解體系的pH值及溫度對辣椒籽油提取率的影響，實驗結(jié)果見圖5和圖6。

圖5 pH對辣椒籽油提取率的影響Fig.5 Effect of pH on extraction rate of Capsicum seed oil

由圖5可知， 當(dāng)pH值從3.0增加到5.5時辣椒籽油的提取率逐漸增大，當(dāng)pH值大于5.5時提取率逐漸下降。這主要是由于酶的活性受pH值的影響較大，過高或過低的pH值均會抑制酶的活性，從而導(dǎo)致辣椒籽油的提取率降低。因此，酶解體系的最適pH為5.5。

圖6 溫度對辣椒籽油提取率的影響Fig.6 Effect of temperature on extraction rate of Capsicum seed oil

由圖6可知，隨著溫度的升高，辣椒籽油的提取率先升高后下降，在50 ℃時提取率達(dá)到最高值21.39%。這主要是由于中性蛋白酶和果膠酶的最適溫度在40～50 ℃，故在實驗中選擇50 ℃為酶解體系的最適酶解溫度。

2.1.5 酶解時間對提取率的影響

實驗考察了酶解時間對辣椒籽油提取率的影響，見圖7。

圖7 酶解時間對提取率的影響Fig.7 Effect of enzymolysis time on extraction rate of Capsicum seed oil

由圖7可知，隨著酶解時間的增加，提取率逐漸增加，在5.5 h時提取率達(dá)到最高值21.57%，時間超過5.5 h后提取率基本趨于穩(wěn)定，故實驗中選取5.5 h作為最佳酶解時間。

2.1.6 辣椒籽油的抗菌活性

實驗對提取出的燈籠椒辣椒籽油抗菌活性進(jìn)行了初步分析，詳細(xì)實驗結(jié)果見表1。

表1 辣椒籽油的抗菌活性實驗結(jié)果Table 1 Results of antibacterial activity test of Capsicum seed oil

實驗結(jié)果表明，辣椒籽油是一種具有廣譜抑菌作用的活性物質(zhì)，其對酵母菌、枯草芽孢桿菌、普通變形桿菌、蠟樣芽孢桿菌等大部分細(xì)菌有較好的抑制作用，其中燈籠椒辣椒籽油對啤酒酵母的抑菌效果最好，其最低抑菌濃度為(MIC)為2.03 mg/mL，其次為枯草芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌，其最低抑菌濃度(MIC)分別為4.06 mg/mL和8.13 mg/mL；對黑曲霉、化膿性鏈球菌和沙門氏菌無明顯的抑菌作用。

3 結(jié)論

本研究采用水酶-乙醇法提取辣椒籽中的油分，對提取工藝中的辣椒籽粉的粒度、酶的種類、料液比、酶解pH值、酶解溫度、酶的添加量、酶解時間等工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，同時對辣椒籽油的抗菌活性進(jìn)行了初步分析。結(jié)果表明，水酶-乙醇法提取辣椒籽油分的最佳工藝參數(shù)為辣椒籽粉的粒度為80目、料液比為1∶6、復(fù)合酶為0.8%的中性蛋白酶和1%的果膠酶、酶解體系的最適pH、最適溫度、最適酶解時間分別為5.5、50 ℃和5.5 h；在最佳工藝條件下，辣椒籽油的提取率可達(dá)21.57%。辣椒籽油是一種具有廣譜抑菌作用的活性物質(zhì)，其對啤酒酵母菌、枯草芽孢桿菌、普通變形桿菌、蠟樣芽孢桿菌等大部分細(xì)菌有較好的抑制作用；對黑曲霉、化膿性鏈球菌和沙門氏菌無明顯抑菌作用。本研究成果為辣椒籽油的初步應(yīng)用提供了數(shù)據(jù)支持，同時為今后研發(fā)新型綠色食品添加劑提供了參考。