新冠肺炎藥物鹽酸阿比多爾的結(jié)構(gòu)分析和穩(wěn)定性考察

馬雨璇 王 娜 王 冰 李 鋼

(南京師范大學(xué) 食品與制藥工程學(xué)院 分析測試中心,江蘇 南京 210023)

2019年12月，新型冠狀病毒肺炎(corona virus disease-19，COVID-19)爆發(fā)，是繼嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS)和中東呼吸綜合征(MERS)后，嚴(yán)重危害人類健康的全球突發(fā)公共衛(wèi)生事件之一[1]。國際病毒分類委員會將該病毒命名為嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2)。從2012年開始，冠狀病毒被分為α、β、γ、δ這4種類型，SARS-CoV-2 為β屬，是單股正鏈 RNA 病毒，顆粒呈圓形或橢圓形，有包膜，常為多形性，直徑60～140 nm，具有很強的傳染性且傳播方式多樣，人群普遍易感[2～3]。它主要作用于呼吸道，所以臨床多以發(fā)熱、乏力為主，少數(shù)伴有鼻塞、流涕、咽痛腹瀉等癥狀[2]。發(fā)病一周后重癥患者可能出現(xiàn)低氧血癥和呼吸困難，并伴有休克等癥狀，嚴(yán)重影響患者生命安全[4～6]。

《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第六版)》由國家衛(wèi)健委員會在2月18日發(fā)布，其中明確指出阿比多爾治療SARS-CoV-2效果確切，可廣泛應(yīng)用于臨床。阿比多爾是非核苷類廣譜抗病毒藥，由前蘇聯(lián)研發(fā)，在俄羅斯和中國獲批上市[7～9]。它是一種高選擇性血凝素抑制劑，通過激活2，5-寡聚腺苷酸合成酶來特異性抑制病毒囊膜和宿主細(xì)胞膜的融合，從而抑制病毒的DNA和RNA合成[1,10-13]，并且阿比多爾還能促進(jìn)細(xì)胞自身釋放干擾素，從而發(fā)揮抗病毒作用，能有效緩解 COVID-19患者的癥狀[14-16]。李蘭娟院士團(tuán)隊通過初步體外細(xì)胞實驗證實阿比多爾在較低濃度時可以有效抑制SARS-CoV-2[17，18]。還有報道指出患者在感染早期服用阿比多爾可顯著減少臨床抗菌藥物的使用和SARS-CoV-2并發(fā)癥的發(fā)生且可以縮短病程、減輕癥狀，是一個治療指數(shù)和安全性雙高的藥物[19]。作為新型冠狀病毒肺炎的推薦用藥，鹽酸阿比多爾在疫情期間具有極大的臨床價值。

對鹽酸阿比多爾的X-射線粉末衍射法(PXRD)、差示掃描量熱分析法(DSC)、掃描電子顯微鏡法(SEM)研究，在相關(guān)文獻(xiàn)中未見報道。鹽酸阿比多爾(ArbidolHydrochloride, AH)的化學(xué)名稱為6-溴-4- (二甲胺基甲基) -5-羥基-1-甲基-2- (苯硫甲基) -1H-吲哚-3-羧酸乙酯鹽酸鹽-水合物，分子式為C22H25BrN2O3S·HCI·H2O(如圖1所示)，分子量是531.89。為了增加藥物的穩(wěn)定性將其制備成鹽酸鹽，藥用為一水合物[20]。本文使用質(zhì)譜分析(MS)、傅里葉變換紅外光譜(FTIR)確證樣品化學(xué)結(jié)構(gòu)，檢測結(jié)果與鹽酸阿比多爾化學(xué)結(jié)構(gòu)一致，再利用熱分析(DSC和TGA)、X-射線粉末衍射(PXRD)以及掃描電子顯微鏡(SEM)等儀器測定鹽酸阿比多爾的熔點、分解溫度、晶型結(jié)構(gòu)以及微觀形貌。此外，對鹽酸阿比多爾樣品進(jìn)行高濕、高溫和研磨對晶型的穩(wěn)定性考察，結(jié)果顯示鹽酸阿比多爾樣品晶型在高濕和高溫條件下十分穩(wěn)定沒有發(fā)生變化，不同研磨時間會影響樣品的擇優(yōu)取向。

1 鹽酸阿比多爾樣品的結(jié)構(gòu)確證

1.1 儀器與材料

儀器：日本理學(xué)公司的D/max 2500VL/PC型陽極轉(zhuǎn)靶X射線衍射儀；日本電子公司的JSM-5610型掃描電子顯微鏡；美國 Perkin Elmer公司的Analysis Diamond差示掃描量熱儀和Analysis Pyrisl熱重分析儀；美國瓦里安公司的Varian2200質(zhì)譜儀；德國布魯克公司的VERTEX70型傅里葉變換紅外光譜儀。

材料：鹽酸阿比多爾樣品由重慶某公司提供。

1.2 質(zhì)譜分析

以甲醇為溶劑，+ESI源為檢測條件，用Varian2200質(zhì)譜儀檢測樣品。

1.3 傅里葉變換紅外光譜分析

采用KBr壓片法檢測樣品，掃描范圍4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1，掃描次數(shù)32次，用聚苯乙烯膜校正。

1.4 熱分析

差示掃描量熱法分析：稱取樣品約2.5 mg放入鋁坩堝中密封，將坩堝放入DSC中進(jìn)行測試，以氮氣為保護(hù)氣，升溫速率為10 K·min-1，升溫范圍為25～200 ℃，進(jìn)行DSC分析。

熱重分析：稱取樣品約2.5 mg放入坩堝，將坩堝放入TGA中進(jìn)行測試，以氮氣為保護(hù)氣，升溫速率為10 K·min-1，升溫范圍為25～400 ℃，進(jìn)行TGA分析。

1.5 X-射線粉末衍射法分析

測定條件為管壓：40 kV，管流：100 mA，Cu-Kα輻射，石墨彎晶單色器，發(fā)射狹縫(DS)=防散射狹縫(SS)=1°，接收狹縫(RS)=0.15 mm。掃描速度：10°·min-1，步寬：0.02°。

1.6 掃描電子顯微鏡法分析

取樣品粘結(jié)在樣品座上，鍍膜處理后置于掃描電子顯微鏡下觀察形態(tài)結(jié)構(gòu)。測定條件：加速電壓10 kV，加大倍率6 000，樣品臺直徑30 mm。

2 穩(wěn)定性考察

2.1 高濕的影響

為了確保該制劑的有效性和安全性，按照中國藥典2015版第四部“原料藥物與藥物制劑穩(wěn)定性試驗指導(dǎo)原則”，我們考察了鹽酸阿比多爾在25 ℃避光，相對濕度為92. 5%條件下放置的外觀性狀、晶型及吸濕增重等重要指標(biāo)隨時間變化的情況。

2.2 高溫的影響

為考察溫度對藥物原材料晶型的影響，按照中國藥典2015版第四部“原料藥物與藥物制劑穩(wěn)定性試驗指導(dǎo)原則”，將鹽酸阿比多爾于60 ℃下恒溫放置10天，于第五天和第十天取樣進(jìn)行檢測，觀察其晶型隨時間變化的情況。

2.3 研磨的影響

室內(nèi)環(huán)境下，取適量鹽酸阿比多爾樣品置于瑪瑙研缽中，分別研磨5 min、10 min和30 min，然后置于載樣架上，制樣，進(jìn)行PXRD檢測，觀察研磨不同時間對樣品晶型的影響。

3 結(jié)果分析

3.1 質(zhì)譜分析

對鹽酸阿比多爾樣品進(jìn)行質(zhì)譜檢測。鹽酸阿比多爾的分子量為477.4，質(zhì)譜檢測結(jié)果質(zhì)荷比為477.9。通過質(zhì)譜分析可證明樣品的分子量與鹽酸阿比多爾的分子量一致。

3.2 傅里葉變換紅外光譜法分析

圖2為鹽酸阿比多爾的紅外圖譜，圖中3 128 cm-1、1 577 cm-1、1 502 cm-1、1 255 cm-1、741 cm-1、和958 cm-1是樣品苯并吡咯骨架的吸收峰；1 680 cm-1、1 186 cm-1和1 087 cm-1是酯基的吸收峰；1 231 cm-1、1 326 cm-1和3 341 cm-1是酚羥基的吸收峰；1 380 cm-1、1 475 cm-1和2 968 cm-1是甲基的吸收峰；1 417 cm-1和2 902 cm-1是亞甲基的吸收峰；1 131 cm-1是脂肪胺的吸收峰；2 588 cm-1是鹽酸鹽的伸縮振動；3 341 cm-1也是樣品結(jié)晶水的吸收峰；690 cm-1是C-S鍵的吸收峰；484 cm-1是苯環(huán)上溴的吸收峰；3 128 cm-1、1 502 cm-1和782 cm-1也是苯環(huán)的吸收峰。

圖2 鹽酸阿比多爾的紅外圖譜

3.3 熱分析

差示掃描量熱儀分析：圖3是鹽酸阿比多爾的DSC曲線。由圖3可知，鹽酸阿比多爾在120.15 ℃有一個吸熱峰，起始溫度為90.78 ℃，此時測得的熱晗為93.94 J/g，推測為樣品脫去結(jié)晶水導(dǎo)致。在161.35 ℃有一個熱晗為34.04 J/g的吸熱峰，起始溫度為154.06 ℃，為樣品熔融所致，由此可知在這種測試條件下鹽酸阿比多爾的熔點為154.06 ℃。

圖3 鹽酸阿比多爾的DSC曲線

熱重分析：圖4是鹽酸阿比多爾的TGA曲線。由圖4可知，樣品在90.02 ℃發(fā)生第一個分解失重，失去一個結(jié)晶水，失重為3.21%，在188.51 ℃時發(fā)生第二個分解失重，為樣品分解所導(dǎo)致。

圖4 鹽酸阿比多爾的TGA曲線

3.4 X-射線粉末衍射法分析

用PXRD檢測鹽酸阿比多爾樣品，衍射圖譜呈現(xiàn)出尖銳的衍射峰，表明該樣品以結(jié)晶形式存在，且結(jié)晶度較高。經(jīng)由計算機(jī)軟件分析圖譜，先采取平滑處理、背景扣除、剝離Kα2峰，再進(jìn)行全譜擬合，得到該樣品的衍射角度(2θ/°)分別為4.80、7.63、9.29、9.55、11.74、15.70、16.74、19.09、21.14、21.76、22.98、23.32、23.71、25.29、28.79，晶面間距d(nm)分別為1.84、1.15、0.95、0.93、0.75、0.56、0.53、0.46、0.42、0.41、0.39、0.38、0.38、0.35、0.31，相對豐度/%)分別為100.0、21.4、20.2、7.4、12.4、7.1、3.6、32.8、8.3、7.0、7.3、19.(I/I03、14.0、16.5、19.5，平均晶粒尺寸為100.7 nm，其衍射圖譜見圖5。

圖5 鹽酸阿比多爾的PXRD圖譜

3.5 掃描電子顯微鏡法分析

鹽酸阿比多爾的掃描電鏡圖如圖6所示。由圖6可知，鹽酸阿比多爾樣品外觀形貌呈長條狀，寬度大約為1 μm左右。

圖6 鹽酸阿比多爾的SEM圖譜

3.6 高濕穩(wěn)定性影響

取鹽酸阿比多爾樣品分成A、B兩份敞口放置在以飽和硝酸鉀溶液營造相對濕度為92.5%的密閉容器中，避光放置10天，在第五天和第十天分別對A樣品進(jìn)行外觀性狀觀察和稱重，對B樣品取出部分進(jìn)行PXRD檢測。結(jié)果如圖7和表1所示，鹽酸阿比多爾樣品在高濕環(huán)境下穩(wěn)定，晶型的2θ、d值和I/I0基本沒有變化，在高濕環(huán)境下樣品顏色一直呈白色，沒有發(fā)生改變，吸重在5%以下。綜合判斷鹽酸阿比多爾在高濕(RH=92.5%)環(huán)境下穩(wěn)定。根據(jù)藥典無須進(jìn)行RH=75%環(huán)境下的濕度穩(wěn)定性考察。

圖7 不同天數(shù)的高濕PXRD圖譜

表1 鹽酸阿比多爾的高濕數(shù)據(jù)Tab.1 high humidity data of Arbidol Hydrochloride

3.7 高溫穩(wěn)定性影響

取鹽酸阿比多爾樣品敞口放置在恒溫烘箱內(nèi)，溫度設(shè)置為60 ℃，避光放置10天，在第五天和第十天分別取樣進(jìn)行PXRD檢測。結(jié)果如圖8所示，鹽酸阿比多爾樣品在高溫環(huán)境下穩(wěn)定，晶型的2θ、d值和I/I0基本沒有變化。根據(jù)藥典無須進(jìn)行40 ℃環(huán)境下的溫度穩(wěn)定性考察。

圖8 不同天數(shù)的高溫PXRD圖譜

3.8 研磨穩(wěn)定性影響

圖9是鹽酸阿比多爾樣品用瑪瑙研缽研磨5 min、10 min和30 min的PXRD圖譜。從圖中可以看出，衍射圖譜隨著研磨時間的增加發(fā)生了改變。樣品經(jīng)過研磨后，減少了擇優(yōu)取向，部分強峰變?nèi)?，弱峰變強，尤其?θ為4.8°的峰(最強峰)強度降低最明顯，其他峰強度與之相比(I/I0)，比值增加。在標(biāo)記①②③④⑤處可明顯看出隨研磨時間增長，部分小峰消失，衍射峰峰型變寬，這是由于研磨導(dǎo)致晶粒變小，晶型藥物出現(xiàn)向非晶態(tài)轉(zhuǎn)化的趨勢。因此在制劑過程中要注意研磨對鹽酸阿比多爾晶型的影響，以免晶型變化影響生物利用度。

圖9 研磨不同時間的PXRD圖譜

4 討論

在對藥物藥理作用研究前必須建立一系列系統(tǒng)的表征方法，以確保該生產(chǎn)藥物是目標(biāo)藥物。對藥物晶型進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征是臨床用藥的前提，也是藥物穩(wěn)定性考察的基礎(chǔ)和依據(jù)。本文通過質(zhì)譜分析(MS)、傅里葉變換紅外光譜分析(FT-IR)、差示掃描量熱分析(DSC)、熱重分析(TGA)、X射線粉末衍射分析(PXRD)和掃描電子顯微分析(SEM)等現(xiàn)代分析手段對樣品進(jìn)行表征，為藥物的生產(chǎn)制備、儲存鑒定以及定量分析提供參考依據(jù)。