中國近海外來囊藻(Colpomenia peregrina)種群遺傳多樣性研究

宋小含 , 孫忠民, 胡自民 段德麟

(1. 中國科學院海洋研究所 海洋大科學研究中心 實驗海洋生物學重點實驗室, 山東 青島 266071; 2. 青島海洋科學與技術試點國家實驗室 海洋生物學與生物技術功能實驗室, 山東 青島 266071; 3. 中國科學院大學, 北京 100049; 4. 中國科學院海洋研究所 海洋生物分類與系統(tǒng)演化實驗室, 山東 青島 266071)

外來囊藻(Colpomenia peregrina Sauvageau)隸屬于Ochrophyta門, 褐藻綱(Phaeophyceae), 墨角藻亞綱(Fucophycidae), 水云目(Ectocarpales), 萱藻科(Scytosiphonaceae), 囊藻屬(Colpomenia), 在溫帶近海潮間帶分布廣泛, 主要生長在坡度較緩的巖石上或附生在其他大型海藻上。

外來囊藻在形態(tài)上呈棕褐色的中空球形或不規(guī)則囊形, 表面隨著藻體的生長發(fā)育出現(xiàn)深淺不一的褶皺。外來囊藻多為一年生, 生活史中有異型世代交替, 生殖期可產(chǎn)生單室孢子囊和多室孢子囊[1]。

由于外形相似, 長期以來囊藻屬物種之間的區(qū)分鑒定始終是一個難題[2]。20世紀初, 法國科學家Sauvageau發(fā)現(xiàn)法國西海岸的一種囊藻在形態(tài)上與囊藻屬的模式種囊藻(Colpomenia sinuosa)有所不同, 它比囊藻更厚且表面光滑, 缺少褶皺和塌陷, 芽孢囊群和褐藻鞭毛起始部位也不同。Sauvageau認為這個形態(tài)種是囊藻的一個變種(Variety), 并將其命名為C. sinuosa var. peregrina。1937年, Hamel將該變種提升至獨立物種水平, 命名為C. peregrine[3]。Clayton通過混合指數(shù)分析(Hybrid Index Analysis)和方差分析(ANOVA), 首次提出區(qū)分外來囊藻和囊藻的3個主要特征: 藻體表面芽孢囊群的形態(tài)呈點狀不連續(xù)或廣泛連續(xù); 孢子囊表面是否有角質層覆蓋; 髓層細胞層數(shù)不同[4]。

外來囊藻呈中空狀, 在藻體完整未受損傷時內部會因光合作用而充滿氧氣。當藻體附生在牡蠣殼上時, 會因氣體的浮力而使牡蠣浮在水面并隨水漂走, 在20世紀曾給法國牡蠣養(yǎng)殖業(yè)帶來損失, 外來囊藻也因此被稱為“牡蠣小偷”[3,5]。除漂浮擴散外, 外來囊藻也可隨牡蠣養(yǎng)殖的跨海區(qū)轉運而被引入新的棲息地, 建立新種群[6]。這一特征使外來囊藻成為研究海洋生物多樣性變動、群體遺傳變異和生物地理格局形成的良好模型。

近年來, 已有研究逐步涉及囊藻屬物種的種群分布變動、入侵路徑及隱存多樣性。Cho等利用核糖體內轉錄間隔區(qū) (internal transcribed spacer, ITS) 和葉綠體核酮糖1,5-二磷酸羧化酶大亞基 (the large subunit of ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase, rbcL)研究了全球范圍內囊藻的遺傳多樣性, 發(fā)現(xiàn)囊藻的ITS標記中存在獨特的串聯(lián)重復序列, 其重復數(shù)可將囊藻分為南半球和北半球兩個不同的地理分布區(qū)[7]。Lee等對19個國家和地區(qū)的囊藻細胞色素氧化酶第Ⅲ亞基(Cytochrome c oxidase subunit 3, cox3)和rbcL序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析, 發(fā)現(xiàn)囊藻種內一個分支在印度洋和大西洋重疊分布, 另一分支僅分布在熱帶地區(qū), 剩余則集中分布在紅海和地中海西部, 這樣的模式可能源于歷史遺存和現(xiàn)代人類干擾[8]。Lee等最近報道西北太平洋地區(qū)可能是外來囊藻的發(fā)源地, 其遺傳多樣性中心可能位于韓國西南海岸, 在距今約2萬年前擴散到西南太平洋和東北太平洋地區(qū), 在最近一個世紀受人類活動干擾入侵到北大西洋[6]。

外來囊藻在中國近海潮間帶分布廣泛, 然而關于其在中國境內種群遺傳多樣性和分化的研究尚為空白。本研究采集了來自中國近海13個地點的外來囊藻種群樣本, 應用線粒體cox3標記研究其種群遺傳結構和多樣性分布模式。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2013—2018年間, 我們采集了遼寧、山東、浙江等地13個地點(27.45—39.02°N, 120.96—122.73°E)的外來囊藻樣本, 詳細信息見表1。采集時, 每個采樣點內樣品均間隔10米。樣品沖洗干凈并陰干處理, 24 h后加入變色硅膠干燥保存。

表1 中國近海外來囊藻樣品采集信息 Tab. 1 Details of the sampling of Colpomenia peregrina along the coast of China

1.2 DNA提取與檢測

取0.03 g外來囊藻樣品, 在液氮中預冷后研磨成藻粉, 采用植物基因組DNA提取試劑盒DP305(天根, 北京)進行DNA提取, 操作步驟參照說明書。提取的基因組DNA采用1%瓊脂糖凝膠電泳和微量型分光光度計Nanodrop 2000檢測其濃度和純度, 選擇條帶明亮、A260/280為1.8~2.0的基因組DNA溶液編號并置于–20℃保存。

1.3 線粒體cox3序列擴增、目的條帶檢測與測序

采用褐藻通用引物對F49(5′-CATTTAGTNGAY CCWAGYCCTTGGC-3′)和R20(5′-AACAAARTGCC AATACCAKG-3′)[6], 選用2×EasyTaq MasterMix(康為世紀, 北京), 以提取的基因組DNA為模板擴增外來囊藻線粒體cox3片段。PCR反應體系為50 μL, 包括25 μL 2 × EasyTaq MasterMix, 1 μL DNA溶液(濃度20 mg/L), 1 μL正向引物F49(濃度10 μmol/L), 1 μL反向引物R20(濃度10 μmol/L), 22 μL RNase free Water。反應程序如下: 94℃預變性4 min; 94℃變性1 min, 53℃退火30 sec, 72℃延伸1 min, 共進行35個循環(huán); 72℃延伸10 min。

采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR目的條帶, 條帶單一明亮的PCR產(chǎn)物純化后在ABI3730測序平臺進行正向測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用BioEdit v7.1.4[9]檢查cox3序列峰圖, 選擇峰形良好的序列作為可用數(shù)據(jù)。以GenBank中外來囊藻cox3序列集(JX027338-75)[6]作為參考序列, 采用MEGA v7.0[10]的MUSCLE模型進行序列比對, 確定序列起點和終點, 人工校正去除錯誤堿基與空隙。

1.5 系統(tǒng)進化

基于貝葉斯信息準則(Bayesian Information Criterion, BIC), 采用JModelTest v2.0[11]測得最佳核苷酸替代模型HKY+I(I=0.79)。以同屬物種囊藻(C. sinuosa)和C. claytoniae為外類群, 采用PhyML v3.1[12]進行基于最大似然法(Maximum Likelihood, ML)的系統(tǒng)發(fā)育樹構建, 分支節(jié)點的置信度采用自展檢驗方法(Bootstrap method)估算, 檢驗重復1000次。采用MrBayes v3.2[13]進行基于貝葉斯法(Bayesian Inference, BI)的系統(tǒng)進化樹構建, 運行4條馬爾科夫鏈, 迭代107次, 每100代保留一次, 前104次用作“burn- in”處理, 計算保留樹的拓撲學和后驗概率值。

1.6 種群遺傳結構

采用DNAsp v5.10軟件[14]計算cox3序列的變異位點(Variable sites)和簡約信息位點(Parsimony informative sites), 計算各種群的單倍型數(shù)量、單倍型多樣性(h)和核苷酸多樣性(π)。采用MEGA v7.0的p-distance模型計算所有樣本間平均遺傳距離(genetic distance)。使用Arlequin 3.5.1.2軟件[15]計算群體間兩兩分化系數(shù)(Fst), 1 000次重復抽樣檢驗顯著性。使用Network 4.6軟件[16]中的Median-joining算法構建外來囊藻cox3序列單倍型網(wǎng)絡圖, 分析單倍型間遺傳結構。

2 結果

2.1 外來囊藻cox3序列與系統(tǒng)進化

本研究共獲得301條cox3序列(長度為620 bp), 序列中無堿基插入和缺失, 序列中共檢測到25個變異位點(Variable sites)和19個簡約信息位點(Parsimony informative sites)。Blastn比對顯示每條cox3序列與GenBank中發(fā)表的外來囊藻序列相似度均超過99%。

ML和BI樹(圖1)顯示本研究的cox3序列聚為一個大分支, 與外類群C. sinuosa和C. claytoniae明顯分開。在中國近海, 來自遼寧大連的2個種群(HN、ZZ)和來自山東煙臺、青島、威海的4個種群(CD、GL、PL、SY)分化為兩個分支, 來自浙江南麂列島的7個種群聚為第三個分支。這表明中國近海外來囊藻種內可能存在3個隱存的遺傳世系。

2.2 種群遺傳結構

在301條cox3序列中共產(chǎn)生26個單倍型, 其中山東榮成高綠(GL)種群和青島第三海水浴場(SY)種群的遺傳多樣性較高(h=0.5221~0.6615,=0.0032~ 0.0050), 浙江南麂列島的龍船礁(LC)、后麂島(HJ)、小虎嶼(XH)、大沙岙(DS)種群遺傳多樣性也較高(h=0.6184~0.8016,=0.0012~0.0039)(表2)。基于全部序列的單倍型多樣性平均值(Hd)為0.775, 核苷酸多樣性()平均值為0.364×10–2, 遺傳距離平均值為0.4%。

基于cox3構建的單倍型網(wǎng)狀圖(圖2)和地理分布圖(圖3)顯示26個單倍型明顯分化為3個遺傳世系, 與進化樹分支結構相互印證, 且3個遺傳世系間沒有共享單倍型。遺傳世系A包含18個單倍型, 其中單倍型Hap2為核心單倍型, 它們全部分布于浙江南麂列島地區(qū); 遺傳世系B包含3個單倍型, 其中Hap11為核心單倍型, 它們主要分布在遼寧大連黃泥川及山東榮成、青島地區(qū); 遺傳世系C包含5個單倍型, 其中Hap1為核心單倍型, 它們主要分布于遼寧大連及山東蓬萊、長島、榮成和青島。

基于線粒體cox3序列的Fst值 (表3)顯示, 13個外來囊藻種群間存在較大的遺傳分化(平均Fst= 0.504), 其中山東、遼寧6個種群與浙江南麂列島7個種群間存在顯著的遺傳分化(平均Fst=0.748), 而山東和遼寧6個種群間存在中等程度的遺傳分化(平均Fst=0.354), 浙江南麂列島7個種群間的遺傳分化程度較低(平均Fst=0.099)。

3 討論

線粒體cox3因其保守型強、進化速率快等特點, 成為囊藻屬新種鑒定、種內種間遺傳變異及譜系結構探究的常用分子標記[6,8,17-18]。本研究利用cox3標記重建了中國近海外來囊藻種內單倍型間的進化關系, 發(fā)現(xiàn)其種內存在明顯的譜系分化, 13個地理種群共分化出3個遺傳世系。種群間兩兩分化Fst系數(shù)顯示13個地理種群間的平均值達0.504, 表明外來囊藻種內遺傳分化顯著, 其中遺傳世系A與遺傳世系B、C間平均Fst值達0.748, 因此我們推測外來囊藻遺傳世系間可能存在過長期的地理隔離。

圖1 基于線粒體cox3序列的系統(tǒng)進化樹 Fig. 1 Phylogenetics trees derived from mitochondrial cox3 sequences of C. peregrina

表2 中國近海外來囊藻種群遺傳多樣性 Tab. 2 Population genetic diversity in C. peregrina along the coast of China

圖2 基于線粒體cox3序列的單倍型網(wǎng)絡圖 Fig. 2 Mitochondrial cox3 haplotype network of C. peregrina

近海海洋環(huán)境變動和氣候變化是影響西太平洋海藻多譜系遺傳結構的重要原因[19-21], 其中第四紀末期海洋環(huán)境變化可能與外來囊藻種群分化有關。作為太平洋西部的邊緣海, 黃渤海和東海在第四紀更新世晚期形成, 并在末次盛冰期(Last Glacial Maximum, LGM)期間經(jīng)歷了劇烈的氣候和環(huán)境變遷。在LGM期間東海的海平面比當前低約150 m, 而黃渤海邊緣海則消失成為陸地[22-23]。海洋、陸地面積的大幅度變化和冰期海岸線的快速移動產(chǎn)生了深刻的環(huán)境影響, 海岸線的重新配置和邊緣海冰期避難所的形成使某些海洋生物多樣性得以存留, 隨著時間的推移, 種群間產(chǎn)生地理隔離并導致遺傳譜系的分化[24-25]。在本研究中, 黃渤海的外來囊藻種群和東海種群間分化顯著, 而這種遺傳分化同樣出現(xiàn)在西北太平洋潮間帶其他海藻物種中。譬如, 羊棲菜(Sargassum fusiforme)的線粒體cox1和cox3單倍型在黃海、東海、南海種群的分布顯示出顯著差異[21-22]; 鼠尾藻(Sargassum thunbergii)的ITS和cox3標記在黃渤海和東海種群中也分化出獨特的單倍型[26]。因此, 我們推測外來囊藻的3個遺傳世系可能具有共同的祖先, 因歷史氣候的變化在邊緣海的不同避難所中分隔開來, 并逐漸產(chǎn)生種內的遺傳分化。

其次, 海流系統(tǒng)也是驅使海藻遷移和空間分布的重要因素[27]。黑潮是當前影響中國海域海洋生物地理分布的主要海流系統(tǒng), 它對生物多樣性和種群結構產(chǎn)生重大影響[22,28-29]。因此, 黑潮驅動的水體交換可能會促進外來囊藻在不同邊緣海之間的擴散, 并影響種群的遺傳分化。

圖3 基于單倍型的外來囊藻遺傳世系地理分布圖(底圖審圖號: GS(2019)1824號) Fig. 3 Geographical distribution of cox3 genetic lineages in C. peregrina

外來囊藻在中國主要分布于黃渤海和東海地區(qū), 單倍型分析發(fā)現(xiàn)分布于浙江南麂列島的遺傳世系A 具有最多的特有單倍型, 表明此處外來囊藻的遺傳多樣性最高。這可能與南麂列島獨特的地理位置和潮間帶環(huán)境有關。南麂列島位于浙江省南部海域外側, 與陸地最近距離超過30英里。遠離陸地的地理位置使得南麂列島受河流和淡水團的影響較小。因此, 該地區(qū)的海水鹽度、溫度和光照等環(huán)境因素比較穩(wěn)定, 有利于海洋生物多樣性的形成[30]。此外, 南麂列島島嶼眾多, 既有陡峭的懸崖, 也有平坦的沙灘, 潮間帶范圍廣泛, 附生的牡蠣等貝類為海洋生物的生長提供了獨特的生長環(huán)境, 十分有利于物種多樣性和遺傳多樣性的形成[31-33]。最后, 南麂列島海域受黑潮和江浙沿岸流兩大水系的交互影響, 北上的南海暖流和臺灣暖流與南下的黃海冷水團和江浙沿岸流在不同的季節(jié)影響著南麂列島的水環(huán)境[34]。浙南沿岸上升流將深水區(qū)的營養(yǎng)鹽帶到表層, 為該海域提供了豐富的營養(yǎng)物質和適宜的水文環(huán)境, 這對促進海藻等海洋生物生長發(fā)育起到重要作用[35]。

Lee等分析了12個國家的外來囊藻cox3序列, 計算得種內平均遺傳分歧為3.1%, 囊藻屬平均遺傳分歧為11.2%[6]。本研究中外來囊藻cox3序列數(shù)據(jù)與Lee等的報道具有可比性, 計算得序列間平均遺傳分歧為0.4%, 表明我國近海外來囊藻的遺傳變異程度在世界范圍內處于較低水平。同時, Lee等認為外來囊藻可能是最具入侵性的褐藻之一, 發(fā)源于西北太平洋地區(qū), 其遺傳多樣性中心位于韓國西南海岸, 且根據(jù)其遺傳分歧大小推斷外來囊藻在更新世前就已發(fā)生進化, 最早可能分化于晚中新世托爾頓階(7.2-11.6 Ma)[6]。而中國近海外來囊藻是否自韓國引入, 何時開始進化, 又存在著怎樣的種群時空變動格局, 這些問題都有待后續(xù)分析和解答。

本研究利用線粒體cox3序列分析了中國近海外來囊藻種群多樣性和遺傳分化, 對重新認知中國近海囊藻屬物種分布和多樣性提供了重要參考, 但外來囊藻在中國近海的具體分布界限仍不明確, 種群時空變動格局也尚不清楚, 這需要在后續(xù)研究中進行廣泛的連續(xù)采樣和深入的數(shù)據(jù)分析。

表3 外來囊藻線粒體cox3序列種群間兩兩遺傳分化Fst系數(shù) Tab. 3 Pairwise Fst values between Colpomenia peregrina populations inferred from mtDNA cox3

4 結論

本研究通過擴增外來囊藻線粒體cox3序列、分析種群系統(tǒng)進化關系及遺傳結構發(fā)現(xiàn), 中國近海外來囊藻種內存在明顯的譜系分化, 13個地理種群分化為3個遺傳世系, 可能因歷史上黃渤海和東海邊緣海環(huán)境變化、黑潮等海流影響而導致; 南麂列島種群的遺傳多樣性高, 這可能與南麂列島獨特的地理位置、復雜的潮間帶環(huán)境以及黑潮和江浙沿岸流的影響有關。