程國軍，鄒倩，吳和濤，羅莎

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，微生物資源與利用湖北省工程技術(shù)研究中心,武漢 430074)

生物固氮是指固氮微生物將大氣中的氮轉(zhuǎn)變成氨，供植物利用. 華癸中慢生根瘤菌7653R是一類能夠與豆科植物紫云英形成不定型根瘤的革蘭氏陰性細(xì)菌，屬于α-變形菌綱[1]. 它與宿主形成的共生固氮體系，不僅能夠自身固氮，而且也是農(nóng)業(yè)中最大的自然氮源[2].

多銅氧化酶(multicopper oxidase, MCO)又稱藍(lán)色氧化酶，能夠?qū)⒍喾N底物氧化，包括酚類化合物和金屬，并且將O2還原為H2O[3]. 多銅氧化酶家族包括漆酶、抗壞血酸氧化酶、亞鐵氧化蛋白、膽紅素氧化酶、亞銅氧化蛋白、金屬氧化酶以及銅藍(lán)蛋白[4]. MCO對多種生理過程至關(guān)重要，包括木質(zhì)素的形成，木質(zhì)素的降解，抗菌素對真菌的解毒作用，色素沉著以及細(xì)菌中的銅抗性，且與病菌的致病性有密切聯(lián)系，參與病原菌的侵染、擴(kuò)散等過程[5]. 生物體在正常的生理代謝中，可以通過有氧代謝將O2轉(zhuǎn)化為H2O，但當(dāng)O2不能夠被及時(shí)充分還原時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生活性氧(ROS)，并且在環(huán)境脅迫下，也會(huì)導(dǎo)致ROS的產(chǎn)生. 生物體本身具有復(fù)雜的抗氧化系統(tǒng)來清除產(chǎn)生的ROS,但當(dāng)ROS的量超過生物體自身的清除能力時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的氧化損傷[6]. 研究表明大腸桿菌的多銅氧化酶CueO突變體對銅的敏感性與氧化應(yīng)激有關(guān)[7]. 結(jié)核分枝桿菌中的多銅氧化酶MmcO蛋白表現(xiàn)出對黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)中生成的ROS的清除活性，并且具有清除活化THP-1細(xì)胞中生成的ROS的能力[8].

多銅氧化酶可以將O2轉(zhuǎn)化為H2O，且不會(huì)釋放活性氧,降低了氧含量，免除細(xì)胞受活性氧的影響[9].MCO在造紙、紡織、化工和食品工業(yè)中有巨大的應(yīng)用，且能參與根瘤菌和豆科植物共生對重金屬污染的土壤進(jìn)行的生物修復(fù)[10],但MCO在根瘤菌共生固氮和抗氧化方面的功能及其作用機(jī)制還有待深入研究. 本研究在對mco基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上，構(gòu)建M.huakuiimco基因突變株，進(jìn)一步研究了mco基因突變對根瘤菌的生長、抗氧化能力的影響以及與紫云英共生過程中的功能，為闡明多銅氧化酶在根瘤菌中的功能及其作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 菌株質(zhì)粒與培養(yǎng)基

菌株及質(zhì)粒見表1. 培養(yǎng)根瘤菌所用的培養(yǎng)基是TY完全培養(yǎng)基和AMS基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)大腸桿菌所用的培養(yǎng)基是LB培養(yǎng)基，所用的抗生素濃度為卡那霉素(Km)20 μg/mL，四環(huán)素(Tc)2 μg/mL，新霉素(Neo)80 μg/mL，鏈霉素(Str)500 μg/mL.

1.2 主要儀器與試劑

限制性內(nèi)切酶(XbaI、Hind Ⅲ等)、T4 DNA連接酶、TaqDNA聚合酶、DL 2000 DNA Marker、ExTaq酶等(TaKaRa公司)；DNA凝膠回收試劑盒、高純度質(zhì)粒DNA小量試劑盒(TsingKe公司)；PCR儀(Biometra公司)；725型紫外可見分光光度計(jì)(上海光譜儀器)；HT7700型掃描電鏡(日立公司).

表1 菌株，質(zhì)粒及PCR引物Tab.1 The strains, plasmids and PCR primers

注：下劃線為引物序列中的限制性酶切位點(diǎn)

1.3 目的基因的生物信息學(xué)分析

根據(jù)目的基因的ID名稱在NCBI查找目的基因編碼的蛋白質(zhì)序列及名稱，然后利用NCBI中的Blastp在線軟件對其氨基酸序列進(jìn)行同源比對分析.

1.4 基因突變體的構(gòu)建

參考周艷琳等[14]的方法構(gòu)建突變體，具體步驟如下：先提取華癸中慢生根瘤菌7653R的總DNA以及pK19mob的質(zhì)粒DNA,再以華癸中慢生根瘤菌7653R的總DNA為模板，mco的上游引物mcoF和下游引物mcoR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增得到的片段進(jìn)行回收. 將回收的mco基因片段與pK19mob載體分別經(jīng)過XbaI和Hind Ⅲ雙酶切，再用T4 DNA連接酶連接過夜. 然后將酶連產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)DH5α，轉(zhuǎn)化子經(jīng)過酶切和測序驗(yàn)證正確后，獲得陽性轉(zhuǎn)化子pKmco. 以華癸中慢生根瘤菌7653R為受體菌，大腸桿菌pKmco為供體菌，含有pRK2013質(zhì)粒的大腸桿菌為輔助菌進(jìn)行三親本雜交，經(jīng)過抗生素篩選排除假陽性及以mcoMap和pK19A為引物的PCR驗(yàn)證后，獲得mco基因突變株HKmco.

1.5 菌株生長曲線的測定

參照程國軍等[15]的方法測定菌株生長曲線，詳細(xì)過程如下：將野生型根瘤菌7653R和突變體菌株HKmco接種于含有相應(yīng)抗生素的TY斜面上，于30 ℃培養(yǎng)2 d后用AMS液體培養(yǎng)基洗脫，并接種于AMS液體培養(yǎng)基中，使其初始OD600值至0.01，每個(gè)菌做3組重復(fù). 置于30 ℃、180 r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)，每隔12 h取樣測一次OD600值，記錄數(shù)據(jù)，并繪制生長曲線.

1.6 根瘤菌抗氧化活性的測定

將已經(jīng)活化好的華癸中慢生根瘤菌7653R和突變體HKmco接種到TY固體斜面培養(yǎng)基上，于30 ℃恒溫培養(yǎng)3 d后，用無菌水進(jìn)行洗脫并稀釋，使其OD600值為1. 將100 μL菌液涂布在AMS固體培養(yǎng)基上，等待菌液徹底風(fēng)干. 再將浸有不同濃度H2O2和CUOOH的圓形濾紙片分別放置在平板的正中央，每個(gè)平板只放一張濾紙片，每組實(shí)驗(yàn)均3組重復(fù). 將放有濾紙片的平板正置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h后，觀察抑菌圈大小并測量其直徑.

1.7 根瘤菌固氮酶活的測定

無菌蛭石種植紫云英[16]，先將蛭石清洗、晾干后，裝入塑料燒杯中，加入適量無氮的紫云英營養(yǎng)液，用錫箔紙封口，121 ℃滅菌1 h. 紫云英種子先用75%的乙醇浸泡5 min，再用2%的次氯酸鈉溶液浸泡30 min. 用無菌水清洗10次，無菌水浸泡5 h后，再用無菌水清洗3～4次. 挑取大而飽滿的種子置于瓊脂上，置于暗環(huán)境中倒置培養(yǎng)2 d. 待種子發(fā)芽后，將其播種于無菌的蛭石燒杯中，加入適量無氮的紫云英營養(yǎng)液，每顆紫云英根部接種1 mL菌液，保鮮膜封口，每個(gè)菌3組重復(fù). 將其放在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)4周后，統(tǒng)計(jì)根瘤數(shù)量，并用乙炔還原法測定根瘤固氮酶活性[17]. 為了研究mco基因突變后對侵染紫云英形成根瘤的影響，將根瘤用甲苯胺藍(lán)染色后制成石蠟切片，并用光學(xué)顯微鏡觀察切片，進(jìn)一步用掃描電鏡觀察根瘤含菌細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu).

2 結(jié)果與分析

2.1 mco基因的生物信息學(xué)分析

將mco基因編碼的氨基酸序列在NCBI中利用Blastp進(jìn)行同源比對，結(jié)果如圖1所示，華癸中慢生根瘤菌7653R中的mco基因(MCHK_7191)大小為700 bp.mco基因編碼的蛋白質(zhì)是多銅氧化酶，屬于Suf I超家族，該家族是具有3個(gè)銅氧還蛋白結(jié)構(gòu)域的多銅氧化酶，在染色體分配、細(xì)胞分裂、細(xì)胞周期控制、無機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝方面發(fā)揮重要作用. 多銅氧化酶能夠?qū)⒀鯕廪D(zhuǎn)變成水，并清除活性氧，使細(xì)胞免受活性氧的影響，在植物抗氧化能力和生物修復(fù)方面發(fā)揮重要作用.

圖1 華癸中慢生根瘤菌7653R中MCO蛋白結(jié)構(gòu)域分析Fig.1 Analysis of the protein domains of MCO in M. huakuii 7653R

2.2 紫云英根瘤菌mco基因突變株的構(gòu)建

以華癸中慢生根瘤菌7653R的總DNA為模板，mcoF/mcoR為引物擴(kuò)增出700 bp左右的目的片段(圖2). 擴(kuò)增片段與載體pK19mob經(jīng)雙酶切后連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)DH5α. 轉(zhuǎn)化子經(jīng)過質(zhì)粒酶切及測序驗(yàn)證正確后，經(jīng)過三親本雜交，最后通過抗性篩選及以mcoMap/PK19A或mcoMap/PK19B為引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，擴(kuò)增出了1.2 kb左右的片段(圖3)，mco基因缺失突變株HKmco構(gòu)建成功.

M) DL2000 DNA Marker；1) mco 基因圖2 mco基因的PCR擴(kuò)增Fig.2 Identification of mco gene by PCR

M) DL2000 DNA Marker; 1)7653R；2) Hkmco；3)7653R；4) HKmco圖3 Hkmco菌落PCR驗(yàn)證Fig.3 Verification of Hkmco by conlony PCR

2.3 mco基因突變對菌株生長的影響

將野生型根瘤菌7653R和構(gòu)建的突變體HKmco分別接種于AMS培養(yǎng)基中，使其初始OD600值為0.01，每隔12 h取樣測OD600值，繪制生長曲線. 如圖4所示，突變體與野生型菌株的生長趨勢基本一致，表明mco基因突變對根瘤菌在AMS培養(yǎng)基上的生長沒有影響.

圖4 7653R和HKmco菌株在AMS培養(yǎng)基中的生長情況Fig.4 The growth of M. huakuii 7653R and HKmco in AMS medium

2.4 mco基因突變對根瘤菌抗氧化能力的影響

將野生型7653R和HKmco突變體用無菌水洗脫并適當(dāng)稀釋后，涂布于AMS平板上，在平板正中央放置沾有不同濃度的H2O2和CUOOH的濾紙片，培養(yǎng)36 h，測量抑菌圈直徑. 結(jié)果如表2所示，在沾有濃度為0.5、5 mmol/L的H2O2的濾紙片周圍，HKmco形成的抑菌圈直徑大小與野生型華癸中慢生根瘤菌7653R在同一濃度H2O2的濾紙片周圍形成的抑菌圈直徑相比沒有顯著差異；但是對于濃度為0.1、1 mmol/L的CUOOH，HKmco突變體形成的抑菌圈直徑為4.73、6.80 cm，顯著大于野生型華癸中慢生根瘤菌7653R在同濃度的CUOOH濾紙片周圍形成的抑菌圈. 結(jié)果表明，mco基因突變不會(huì)影響紫云英根瘤菌抗無機(jī)氧化物H2O2的能力，但是會(huì)嚴(yán)重影響紫云英根瘤菌抗有機(jī)氧化物CUOOH的能力.

表2 不同濃度H2O2和CUOOH的抑菌能力Tab.2 Tolerance of stains to different concentrations of H2O2and CUOOH

注：*表示在0.05水平上mco基因突變株與野生型7653R存在顯著差異

2.5 mco基因突變對根瘤菌共生固氮的影響

將紫云英接種菌液，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4周后取出，統(tǒng)計(jì)根瘤數(shù)量，并用乙炔還原法測定根瘤固氮酶活性. 結(jié)果表明接種突變株HKmco的紫云英形成的根瘤數(shù)量與接種野生型7653R的紫云英相比無顯著差異，但是與野生型相比，接種HKmco突變體的紫云英根瘤的乙炔還原活性降低了29.8%(表3). 石蠟切片結(jié)果如圖5 A和B所示，在接種野生型根瘤菌的根瘤中，細(xì)胞形態(tài)比較規(guī)則，大部分細(xì)胞大而飽滿，含菌細(xì)胞數(shù)量較多. 而突變體的根瘤內(nèi)部的含菌細(xì)胞數(shù)量明顯減少，且細(xì)胞外部形態(tài)有些許變形. 掃描電鏡觀察根瘤菌含菌細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖5 C和D所示，在相同的放大倍數(shù)下，野生型7653R根瘤內(nèi)部的類菌體形狀規(guī)則，大多呈長條形，而接種突變體HKmco根瘤類菌體形態(tài)不規(guī)則. 研究結(jié)果表明，mco基因突變會(huì)減少根瘤含菌細(xì)胞數(shù)量，并導(dǎo)致其固氮活性降低，mco基因在根瘤菌固氮方面發(fā)揮著重要的作用.

表3 HKmco的共生性狀Tab.3 Symbiotic phenotype of 7653R and HKmco

注：數(shù)據(jù)是3次重復(fù)的平均值，每列數(shù)值后面的相同字母表示在0.05水平上沒有顯著差異(P≤0.05)，n為對照，未接種

A)、 C) M.huakuii 7653R；B)、D)M.huakuii HKmco圖5 接種4周的根瘤石蠟切片和掃描電鏡結(jié)構(gòu)圖Fig.5 Structure of 4 weeks nodules of paraffin sections and scanning electron microscope

3 討論

根瘤菌侵染植物，產(chǎn)生根瘤并固氮，固氮酶在其中發(fā)揮了重要的作用. 而固氮酶需要在低氧環(huán)境下才能保證其不會(huì)遇氧失活.mco基因在抗氧化方面發(fā)揮重要作用，通過構(gòu)建M.huakuiimco基因突變株，本文研究了mco基因在抗氧化和共生固氮方面的作用.

研究發(fā)現(xiàn)紫云英根瘤菌mco基因編碼多銅氧化酶，該基因突變對華癸中慢生根瘤菌7653R的自身生長沒有影響. 多銅氧化酶家族成員漆酶基因lac2突變體在宿主植物組織內(nèi)部的侵襲后生長沒有缺陷[5].mco基因突變株HKmco對無機(jī)氧化物H2O2不敏感，但當(dāng)CUOOH濃度為0.1、1 mmol/L時(shí)，mco基因突變會(huì)嚴(yán)重影響紫云英根瘤菌抗有機(jī)氧化物CUOOH的能力，說明mco基因突變會(huì)顯著影響紫云英根瘤菌抗有機(jī)氧化物CUOOH的能力. 黃紅莉等研究了低氧預(yù)處理后小鼠抗枯烯過氧化氫能力的變化，經(jīng)過多次低氧預(yù)處理后，小鼠的抗枯烯過氧化氫能力顯著降低，推測是熱休克蛋白在發(fā)揮作用[18].研究表明，多銅氧化酶家族中的銅藍(lán)蛋白CP是一種多功能酶，既有鐵氧化酶活性，又具有依賴于谷胱甘肽GSH的過氧化物酶活性，但CP蛋白與典型的GSH過氧化物酶不同，典型的GSH過氧化物酶對無機(jī)過氧化物H2O2的活性更高，而CP蛋白對有機(jī)氫過氧化物的活性更高，例如叔丁基氫過氧化物. CP蛋白對有機(jī)氫過氧化物的活性可以用于除去細(xì)胞外液中的有機(jī)氫過氧化物，例如脂質(zhì)氫過氧化物[19]. CUOOH作為一種有機(jī)氫過氧化物，可以結(jié)合在脂質(zhì)等上面，從而對細(xì)胞中的脂質(zhì)造成傷害，而多銅氧化酶具有對有機(jī)氫過氧化物的活性，可以消除體內(nèi)的氫過氧化物，這可能是mco基因突變株Hkmco對CUOOH敏感的原因. 而mco基因突變對華癸中慢生根瘤菌的抗無機(jī)過氧化物H2O2的能力沒有明顯影響，可能是由于根瘤菌本身具有GSH過氧化物酶，即使mco基因突變，根瘤菌也可以利用GSH過氧化物酶來清除H2O2.

紫云英盆栽實(shí)驗(yàn)表明,接種突變株HKmco的紫云英形成的根瘤數(shù)量與接種野生型7653R的紫云英相比無顯著差異，但其固氮酶活性與野生型相比降低了29.8%，且接種突變株HKmco的根瘤類菌體數(shù)量比野生型少. MCO能夠消耗分子氧，降低氧含量，而根瘤菌固氮酶進(jìn)行固氮需要厭氧環(huán)境，MCO在根瘤菌固氮方面發(fā)揮重要的作用.本研究表明，mco基因突變會(huì)影響根瘤菌抗氧化和共生固氮能力，而多銅氧化酶相關(guān)基因在根瘤菌共生固氮中的作用機(jī)制值得深入研究.