復(fù)方維生素E口腔藥膜含量測(cè)定方法研究*

曲 婷，陳 巖，2△，喬宏艷，劉 亮，李小紅

（1．哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，黑龍江 哈爾濱 150001； 2．廈門大學(xué)附屬翔安醫(yī)院藥學(xué)部，福建 廈門 361101）

膜劑為藥物與適宜的成膜材料經(jīng)加工制成的膜狀制劑，供口服或黏膜用［1］。美國(guó)藥典（USP）中也收載了膜劑（Films），簡(jiǎn)單描述其為置于口腔內(nèi)的薄片，可能含有一層或多層，層中可能含有原料藥，通常是由聚合物構(gòu)成的薄膜材料，通過(guò)快速釋放到口腔給藥。復(fù)方維生素E口腔藥膜為我院自制膜劑，臨床主要用于治療口腔潰瘍、皮膚角化癥及濕疹等慢性皮膚?。?-5］?？谇火じ接媚┍《?，能將藥物直接釋放至黏膜表面，快速吸收。與生物黏附凝膠劑相比，膜劑最大的優(yōu)點(diǎn)是成形性好，給藥后可直接黏附于給藥部位，不會(huì)分散，可保持原狀持續(xù)釋藥，故劑量準(zhǔn)確。

維生素E分為合成型（dl-α-生育酚醋酸酯）或天然型（d-α-生育酚醋酸酯）［5］，為微黃色至黃色澄清的黏稠液體，不溶于水，溶于無(wú)水乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑，在空氣中會(huì)緩慢氧化，紫外線照射可使其分解、色漸變深。維生素E是人體非常重要的阻斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的抗氧化劑，通過(guò)影響炎性因子、調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在抑制炎性反應(yīng)、抗自由基、抗衰老、抗癌變過(guò)程中發(fā)揮重要作用［6-8］，具有穩(wěn)定和保護(hù)細(xì)胞膜的作用，在人體正常新陳代謝中不可或缺，已廣泛用于治療多種皮膚?。?-10］。維生素E在本制劑中含量最高，故作為其含量控制指標(biāo)性成分，采用超聲波提取、高效液相色譜法測(cè)定，但此方法回收率低，不適用于藥膜中維生素E的定量。本研究中對(duì)比了超聲波、熱回流、索氏提取、醇沉等提取方法對(duì)藥膜中維生素E的影響，以高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定其含量，作為前處理評(píng)價(jià)指標(biāo)，為膜劑中該藥物的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供準(zhǔn)確可行的檢測(cè)方法，為膜劑中藥物含量測(cè)定前處理方法的選擇提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

Waters 600型高效液相色譜系統(tǒng)（美國(guó)Waters公司），包括2996 PDA檢測(cè)器、717自動(dòng)進(jìn)樣器；SB3200型超聲波儀（必能信超聲＜上海＞有限公司）；AE200型電子天平（梅特勒-托利多儀器＜上海＞有限公司）。

1．2 試藥

維生素E對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為100062-201110，供HPLC測(cè)定，含量為97．7%）；復(fù)方維生素E口腔藥膜（醫(yī)院自制，批號(hào)分別為200171121，20171128，20171130，20171205，20171207，20171212，規(guī)格為每片含維生素E 6 mg）；甲醇與異丙醇均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件

色譜柱：Sinochrom ODS-BP柱（200 mm×4．6 mm，5μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)：284 nm；流動(dòng)相：甲醇-異丙醇（88∶12，V／V）；流速：1．0 mL／min；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：10μL。

2．2 溶液制備

對(duì)照品溶液：稱取維生素E對(duì)照品約100．0 mg，精密稱定，置100 mL棕色容量瓶中，先加入適量無(wú)水乙醇充分溶解，再用甲醇定容至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為1．0 mg／mL的維生素E對(duì)照品貯備液，置4℃冰箱中保存，備用。

供試品溶液：取本品20片，剪碎至大米粒大小，得藥膜碎片，備用。1）超聲波提取。稱取相當(dāng)于3片的上述藥膜碎片，精密稱定，置100 mL棕色容量瓶中，加適量無(wú)水乙醇，置超聲波（120 W，40 kHz）中，超聲處理60 min，放冷至室溫，加甲醇至刻度，混勻，0．45μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液Ⅰ。2）熱回流提取。稱取相當(dāng)于3片的上述藥膜碎片，精密稱定，置圓底燒瓶中，加適量無(wú)水乙醇，置加熱套中，熱回流60 min，放冷至室溫，轉(zhuǎn)移至100 mL棕色容量瓶中，加甲醇至刻度，混勻，0．45μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液Ⅱ。3）熱溶醇沉提取。稱取相當(dāng)于3片的上述藥膜碎片，精密稱定，置離心管中，加少量熱水溶解后，邊滴加適量無(wú)水乙醇邊攪拌，離心，上清液轉(zhuǎn)移至100 mL棕色容量瓶中，加甲醇至刻度，混勻，0．45μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液Ⅲ。

陰性對(duì)照品溶液：按處方量稱取處方中除維生素E的其他藥用原料及輔料，按制備工藝制成不含維生素E的陰性制劑，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2．3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示，基線平穩(wěn)，維生素E與雜質(zhì)峰分度良好，空白輔料及雜質(zhì)對(duì)目標(biāo)峰無(wú)干擾，且柱效高，峰形理想。

線性關(guān)系考察：取2．2項(xiàng)下維生素E對(duì)照品貯備液，精密吸取2．5，5．0，10．0，20．0，40．0 mL，分別置50 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，最終配制成質(zhì)量濃度分別為50，100，200，400，800μg／mL的溶液。按擬訂色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，以維生素E質(zhì)量濃度（X，μg／mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y＝3 228．7X-17．083，r＝0．999 9（n＝5）。結(jié)果表明，維生素E質(zhì)量濃度在50～800μg／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

檢測(cè)限與定量限確定：精密吸取2．2項(xiàng)下維生素E對(duì)照品貯備液適量，加甲醇逐級(jí)稀釋后，按擬訂色譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果維生素E的最低檢測(cè)限（LOD）為0．25μg／mL［信噪比（S／N）＝3］，最低定量限（LOQ）為1．0μg／mL［信噪比（S／N）＝10］。

精密度試驗(yàn)：取2．2項(xiàng)下質(zhì)量濃度為8μg／mL的對(duì)照品溶液適量，按擬訂色譜條件連續(xù)測(cè)定3 d，每天重復(fù)測(cè)定6次。結(jié)果維生素E色譜峰面積的日內(nèi)精密度RSD為0．64%（n＝6），日間精密度RSD為1．13%（n＝3），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2．2項(xiàng)下質(zhì)量濃度為8μg／mL的對(duì)照品溶液適量，按擬訂色譜條件分別于室溫條件下放置0，1，2，4，8 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果維生素E峰面積的RSD為0．71%（n＝5），表明供試品溶液室溫放置8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

圖1 高效液相色譜圖

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為20171128）復(fù)方維生素E口腔藥膜6份，按2．2項(xiàng)下“熱溶醇沉提取”方法分別制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算含量。結(jié)果維生素E的標(biāo)示量分別為99．6%，102．7%，104．1%，99．4%，102．4%，100．8%，RSD為1．84%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量（6．09 mg／片）的復(fù)方維生素E口腔藥膜（批號(hào)為20171128）6份，均分為高、低濃度加樣組（n＝3），分別精密加入18 mg和6 mg維生素E對(duì)照品，按2．2項(xiàng)下“熱溶醇沉提取”方法制備加樣回收試驗(yàn)供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）

提取方法確定：取同一批（批號(hào)為20171128）復(fù)方維生素E口腔藥膜，按2．2項(xiàng)下3種提取方對(duì)藥膜進(jìn)行前處理，每種方法平行制備3份供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 3種前處理方法提取維生素E后HPLC檢測(cè)結(jié)果（n＝3）

2．4 樣品含量測(cè)定

分別取復(fù)方維生素E口腔藥膜樣品6批，按2．2項(xiàng)下“熱溶醇沉提取”方法分別制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果（X±s，n＝3）

3 討論

檢測(cè)方法選擇：除《中國(guó)藥典》規(guī)定的氣相色譜法外，維生素E的含量測(cè)定方法還有氣質(zhì)聯(lián)用法、HPLC法、液質(zhì)聯(lián)用法、紫外分光光度法等［11-17］，但膜劑中維生素E的含量測(cè)定方法尚未見(jiàn)報(bào)道。氣相色譜法所用的內(nèi)標(biāo)物正三十二烷在市場(chǎng)難以購(gòu)買，導(dǎo)致日常分析較困難，且樣品前處理較煩瑣。本研究中采用高效液相色譜儀、外標(biāo)法測(cè)定，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，優(yōu)于氣相色譜儀采用的內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量。

檢測(cè)波長(zhǎng)選擇：取維生素E對(duì)照品溶液，無(wú)水乙醇溶解，甲醇稀釋，在190～450 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，記錄光譜圖，維生素E在204 nm及284 nm波長(zhǎng)處均有吸收峰?？紤]到前者為邊緣吸收，受溶劑等因素的影響較大，故選擇284 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

流動(dòng)相選擇：曾選用以甲醇-水（95∶5，V／V）、甲醇-乙腈（95∶5，V／V）為流動(dòng)相，結(jié)果均因其色譜峰分離效果不好而未被采用。最終采用甲醇-異丙醇（88∶12，V／V）作為流動(dòng)相，可使主峰的保留時(shí)間縮短。采用HPLC法以反相色譜柱進(jìn)行分析［12，18］，多以水和甲醇為流動(dòng)相，易造成脂溶性大分子化合物在柱內(nèi)沉淀，污染色譜柱，也可能使色譜峰峰形不理想。本研究中采用的HPLC法是以甲醇和異丙醇為流動(dòng)相，使脂溶性維生素E不殘留在柱內(nèi)，能減少維生素E的保留時(shí)間，并提高了柱的穩(wěn)定性，保持柱分離效能，延長(zhǎng)其使用壽命。

提取方法選擇：2015年版《中國(guó)藥典》中收載了4種膜劑，含量測(cè)定的前處理方法均經(jīng)過(guò)剪碎、超聲波提取或有機(jī)溶劑熱水浴2個(gè)步驟。其中剪碎過(guò)程費(fèi)時(shí)費(fèi)力，超聲波提取耗時(shí)長(zhǎng)、噪音大，熱水浴耗時(shí)長(zhǎng)，且會(huì)導(dǎo)致有機(jī)溶劑揮發(fā)，存在環(huán)境危害和人體損害。本研究中根據(jù)脂溶性主藥維生素E與水溶性輔料聚乙烯醇的理化性質(zhì)差異，設(shè)計(jì)了將藥膜放入少量純化水中，水浴加熱呈溶解狀態(tài)，將維生素E從藥膜中完全釋放出來(lái)，然后邊滴加適量無(wú)水乙醇邊攪拌，聚乙烯醇遇有機(jī)溶劑變性產(chǎn)生絮狀沉淀，待沉淀不再增加，停止攪拌，離心，取上清液。整個(gè)過(guò)程耗時(shí)短，操作簡(jiǎn)便。本研究中考察了超聲波法、熱回流法、熱溶醇沉法提取藥膜中的維生素E。分別將藥膜剪碎成花生米大小、黃豆大小、大米粒大小，甲醇為提取溶劑，采用超聲波法和熱回流法，分別于提取10，20，30，60，90 min時(shí)取樣，HPLC法測(cè)定維生素E含量。試驗(yàn)結(jié)果表明，2種方法提取率與藥膜的粉碎度和提取時(shí)間、提取溫度成正比，但提取60 min后，提取率不再增加。其中，超聲波法提取不完全，測(cè)定結(jié)果為標(biāo)示量的75．2%；熱回流法提取率高于超聲波法，為標(biāo)示量的93．0%，也未達(dá)到完全提??；熱溶醇沉法提取，HPLC法測(cè)定維生素E含量，結(jié)果為標(biāo)示量的100．1%。表明熱溶醇沉法提取完全，操作簡(jiǎn)便、快捷，低濃度加樣組和高濃度加樣組平均回收率均較高，方法準(zhǔn)確可靠。