趙媛，孔高茵，周搏，唐軼珣，裴萬敏，潘冰冰

[湖南省人民醫(yī)院（湖南師范大學(xué)第一附屬醫(yī)院） 麻醉醫(yī)學(xué)中心（湖南省圍術(shù)期加速康復(fù)麻醉臨床醫(yī)學(xué)研究中心），湖南 長沙 410005]

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種自身免疫性疾病，常以進(jìn)行性的關(guān)節(jié)腫脹、對(duì)稱性、晨僵及疼痛為臨床表現(xiàn)，對(duì)患者生活質(zhì)量造成很大的影響。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的病理學(xué)改變主要為關(guān)節(jié)腔內(nèi)有大量炎癥細(xì)胞浸潤，呈慢性炎癥增生性改變。細(xì)胞因子是炎癥的主要介質(zhì)，并且導(dǎo)致自身免疫疾病。白細(xì)胞介素-33（Interleukin-33, IL-33）屬于IL-1 細(xì)胞因子家族的成員，參與各種炎癥性疾病的發(fā)病機(jī)制[1]，包括過敏性疾病[2]、自身免疫性疾病[3]、感染性疾病[4]及神經(jīng)性疼痛[5]。有文獻(xiàn)報(bào)道，IL-33/ST2 在以疼痛為重要臨床表現(xiàn)疾病中的適應(yīng)性和先天性免疫應(yīng)答中有很重要的作用[6]。腦和脊髓是人體IL-33 表達(dá)最多的部位[7]，但類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)IL-33 的表達(dá)尚無相關(guān)研究。本研究通過檢測佐劑誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎（adjuvant induced arthritis, AIA）大鼠脊髓中IL-33 的表達(dá)，探討其在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料

清潔級(jí)雄性SD 大鼠，體重200 ～250 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。7370 型熱痛儀（意大利UGO 公司），VonFrey 機(jī)械痛閾測定套件（美國Stoelting 公司），鼠抗β-tublin 多克隆抗體（北京鼎國昌盛公司），兔抗IL-33 多克隆抗體（NBP1-76394）（美國Novus 公司），辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG 和羊抗兔IgG（美國Jackson 公司），完全氟式佐劑（complete Freund's adjuvant, CFA）（F-5881）（ 美 國Sigma 公司）。

1.2 模型復(fù)制與分組

大鼠以每籠2 或3 只群養(yǎng)，適應(yīng)生活環(huán)境3 d 后開始實(shí)驗(yàn)，50 只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（Sham 組）和佐劑性關(guān)節(jié)炎組（CFA 組），每組25 只。Sham 組大鼠左側(cè)足底注射生理鹽水100 μl，CFA 組大鼠左側(cè)足底注射CFA（1 mg/ml）100 μl。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 關(guān)節(jié)形態(tài)學(xué)評(píng)估 關(guān)節(jié)和足趾體積測量使用足趾容積測量儀，測量并計(jì)算大鼠左側(cè)足趾和關(guān)節(jié)的體積，評(píng)價(jià)大鼠足趾和關(guān)節(jié)腫脹程度。

1.3.2 行為學(xué)檢測 行為學(xué)檢測包括機(jī)械痛閾（paw withdrawal threshold, PWT）和熱痛閾（paw with-drawal latency, PWL）檢測，分別于術(shù)前1 天和術(shù)后第1、3、7、14 和21 天檢測兩組大鼠左側(cè)后肢的PWT 和PWL。每間隔5 ～10 min，重復(fù)檢測2 次，取平均值。

1.3.3 脊髓Western blotting 檢測 兩組分別在術(shù)后第1、3、7、14 和21 天處死5 只大鼠，沿棘突切開皮膚并去除棘突和椎板，取出脊髓腰膨大，提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA 法檢測蛋白濃度，每孔蛋白上樣量50 μg，行SDS- PAGE 電泳，濕法轉(zhuǎn)膜將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入IL-33（1 ∶1 000），β-Tublin（1 ∶5 000）一抗，4℃孵育過夜。PBS 洗膜，按一抗種屬來源加入相應(yīng)二抗。加入二抗后常溫反應(yīng)2 h，加入發(fā)光液，運(yùn)行Image Lab 程序發(fā)光，保存條帶。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較做析因設(shè)計(jì)的方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠足趾和關(guān)節(jié)體積的變化

Sham 組與CFA 組大鼠足趾和關(guān)節(jié)體積的比較采用析因設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)大鼠足趾和關(guān)節(jié)體積有差異（F=478.846，P=0.000）；②兩組大鼠足趾和關(guān)節(jié)體積有差異（F=612.542，P=0.000）；③兩組大鼠足趾和關(guān)節(jié)體積隨時(shí)間的變化趨勢有差異（F=299.000，P=0.000）。CFA 組大鼠在術(shù)后第3 天開始，足趾和關(guān)節(jié)體積增大，延至整個(gè)觀察期（P＜0.05）。見表1 和圖1。

2.2 各組大鼠PWT 和PWL

Sham 組與CFA 組大鼠PWT 和PWL 變化的比較采用析因設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)大鼠PWT 和PWL 變化有差異（F=151.033 和57.641，均P=0.000）；②兩組大鼠PWT 和PWL 變化有差異（F=431.746 和515.000，均P=0.000）；③兩組大鼠PWT和熱PWL 隨時(shí)間的變化趨勢有差異（F=161.370 和88.342，均P=0.000）。CFA 組大鼠在術(shù)后第6 h 開始，與術(shù)前比較，PWT 和PWL 均降低，延至整個(gè)觀察期（P＜0.05）。見表2、3 和圖2、3。

表1 兩組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)足趾和關(guān)節(jié)體積比較 （±s）

表1 兩組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)足趾和關(guān)節(jié)體積比較 （±s）

注：基值為未用藥前的數(shù)值；①與Sham 組比較，P ＜0.05；②與基值比較，P ＜0.05。

組別 基值 0 h 6 h 24 h 3 d 7 d 14 d 21 d CFA 組 2.25±0.08 2.28±0.07 2.29±0.64 2.30±0.05 2.48±0.04①② 3.08±0.08①② 3.29±0.02①② 3.51±0.06①②Sham 組 2.32±0.01 2.29±0.05 2.30±0.05 2.30±0.40 2.41±0.08 2.76±0.39 2.90±0.47 3.06±0.53②

圖1 兩組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)足趾和關(guān)節(jié)體積變化（±s）

2.3 兩組大鼠脊髓IL-33 蛋白水平表達(dá)變化

兩組大鼠脊髓IL-33 蛋白表達(dá)的比較采用析因設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①Sham 組各時(shí)間點(diǎn)大鼠脊髓IL-33 蛋白表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1356.316，P=23.317）；②CFA 組大鼠脊髓IL-33 蛋白表達(dá)水平從第3 天開始升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=33 423.543，P=0.000）；③CFA 組與Sham 組隨時(shí)間的變化趨勢比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=31856.357，P=0.000）。見表4 和圖4。

表2 兩組術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)PWT 比較 （g，±s）

表2 兩組術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)PWT 比較 （g，±s）

注：基值為未用藥前的數(shù)值；①與Sham 組比較，P ＜0.05；②與基值比較，P ＜0.05。

組別 基值 0 h 6 h 24 h 3 d 7 d 14 d 21 d CFA 組 17.46±2.32 17.47±2.31 3.86±0.30①② 1.69±0.60①② 4.73±0.83①② 1.4±0.34①② 0.61±0.23①② 0.85±0.20①②Sham 組 17.20±2.01 17.20±2.01 16.47±2.01 17.20±2.01 16.47±2.01 15.73±1.64 16.47±2.01 18.53±2.61

表3 兩組術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)PWL 比較 （s，±s）

表3 兩組術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)PWL 比較 （s，±s）

注：基值為未用藥前的數(shù)值；①與Sham 組比較，P ＜0.05；②與基值比較，P ＜0.05。

組別 基值 0 h 6 h 24 h 3 d 7 d 14 d 21 d CFA 組 25.63±1.52 25.63±1.52 6.95±1.71①② 6.9±0.73①② 13.81±0.55①② 11.58±0.65①② 13.69±1.05①② 14.0±1.13①②Sham 組 25.20±2.02 25.24±2.17 25.19±0.52 25.30±0.79 25.57±0.57 25.65±2.17 26.45±2.73 25.93±2.25

圖2 兩組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)PWT 的變化 （±s）

圖3 兩組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)PWL 的變化 （±s）

表4 兩組大鼠脊髓IL-33 蛋白水平表達(dá)比較 （±s）

表4 兩組大鼠脊髓IL-33 蛋白水平表達(dá)比較 （±s）

注：①與Sham 組比較，P ＜0.05；②與24 h 比較，P ＜0.05。

組別 24 h 3 d 7 d 14 d 21 d CFA 組 7 678.62±161.90 12 889.60±135.55①② 18 861.37±167.64①② 20 114.61±78.47①② 19 434.54±514.97①②Sham 組 7 073.99±141.04 7 023.81±91.95 7 145.91±143.82 7 014.39±97.03 7 018.73±90.58

圖4 兩組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)脊髓IL-33 的表達(dá)

3 討論

10年前IL-33 被確認(rèn)為IL-1 家族中的一員，認(rèn)為在先天和適應(yīng)性方面起著關(guān)鍵免疫作用，IL-33 與其獨(dú)特的受體ST2 在炎癥和免疫介導(dǎo)的疾病中起重要作用[8]。IL-33 主要表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞的細(xì)胞核，在炎癥刺激下，警示組織損傷或應(yīng)激[9]。有研究表明，在CIA 模型中，IL-33 可以加重關(guān)節(jié)炎的癥狀[4]，在RA 大鼠的滑膜中可以檢測到IL-33 和ST2，其中IL-33 水平較高[10]。提示類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎與外周IL-33 升高關(guān)系密切。

在所有器官研究中，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的IL-33 表達(dá)水平最高，IL-33 和ST2 由多種細(xì)胞表達(dá)，IL-33 通過大膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞[11]表達(dá)，ST2 通過小膠質(zhì)細(xì)胞[12]表達(dá)。有研究顯示[13]，在CFA小鼠中，脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞在關(guān)節(jié)炎發(fā)作后第10 天開始增加。IL-33 像IL-1 其他細(xì)胞因子一樣，會(huì)導(dǎo)致周圍神經(jīng)系統(tǒng)炎癥疼痛和調(diào)解抗原誘導(dǎo)的皮膚和關(guān)節(jié)的痛覺過敏，VERRI 等[14]研究表明，IL-33 可能誘發(fā)小鼠關(guān)節(jié)和皮膚痛覺過敏的產(chǎn)生，提示IL-33 在關(guān)節(jié)炎疼痛中起關(guān)鍵作用。但CFA 大鼠脊髓是否會(huì)出現(xiàn)IL-33 相應(yīng)的表達(dá)變化尚無相關(guān)研究。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，大鼠足底注射CFA 后6h 開始出現(xiàn)PWT 和PWL 明顯下降，到第3 天兩者都有輕度恢復(fù)繼之下降的過程，總體呈下降的趨勢，提示實(shí)驗(yàn)組大鼠注射CFA 后6 h 即出現(xiàn)痛覺過敏。觀察到大鼠足趾和關(guān)節(jié)變化也提示關(guān)節(jié)炎的形成。與此同時(shí)檢測相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的脊髓IL-33 蛋白，發(fā)現(xiàn)第3 天脊髓IL-33蛋白水平開始明顯升高，此后一直持續(xù)到第21 天。該結(jié)果提示，當(dāng)CFA 大鼠形成早期的痛覺過敏時(shí)，脊髓IL-33 并未參與，3 d 后脊髓IL-33 明顯升高，說明CFA 大鼠后期的痛覺過敏形成與脊髓IL-33 相關(guān)。

綜上所述，根據(jù)IL-33 在AIA 大鼠脊髓的表達(dá)，筆者認(rèn)為IL-33 在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疼痛過敏中扮演重要角色，如果通過調(diào)控脊髓IL-33 水平進(jìn)而調(diào)節(jié)其炎癥反應(yīng)和中樞敏化，有可能減輕類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的疼痛，但是這需要更進(jìn)一步和大樣本的研究。