孫金秋 徐莞媛 馬杭柯 高 威 歐陽樂飛 高 煥,2,3,4 閻斌倫,2,3,4

脊尾白蝦絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆及其表達特征分析*

孫金秋1徐莞媛1馬杭柯1高 威1歐陽樂飛1高 煥1,2,3,4閻斌倫1,2,3,4①

(1. 江蘇省海洋大學(xué) 江蘇省海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境重點實驗室 江蘇省海洋生物技術(shù)重點實驗室 連云港 222005；2. 江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心 連云港 222005；3. 江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護與利用平臺 南京 210014；4. 江蘇省海洋資源開發(fā)研究院(連云港) 連云港 222005)

本研究根據(jù)脊尾白蝦()轉(zhuǎn)錄組序列，采用cDNA末端快速擴增技術(shù)克隆獲得了脊尾白蝦絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶基因()。該基因cDNA全長為1855 bp，其中，開放閱讀框為1407 bp，5￠端非編碼區(qū)為39 bp，3￠端非編碼區(qū)為409 bp，共編碼468個氨基酸，預(yù)測蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量為152.55 kDa，理論等電點為4.90。同源性分析顯示，脊尾白蝦基因與甲殼類動物真寬水蚤(s)同源性最高，為96%。熒光定量分析結(jié)果顯示，基因在脊尾白蝦眼柄、胃、肝胰腺、心臟、鰓、腸、肌肉、腹索神經(jīng)、皮下脂肪以及卵巢中均有表達，其中，卵巢表達量最高，心臟次之。不同濃度Cd2+脅迫結(jié)果顯示，其在低濃度(0.0100、0.0175和0.021 mmol/L) Cd2+脅迫中的表達模式基本一致，呈先升高后下降再升高再下降的趨勢；而在高濃度(0.0278 mmol/L) Cd2+脅迫中，該基因表達量很低，甚至不表達，說明高濃度Cd2+脅迫可以抑制該基因的表達，具體機制有待進一步研究。

脊尾白蝦；絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶基因；基因克??；組織表達；Cd2+脅迫

絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(Serine hydroxyl methyl- transferase, SHMT)是一類廣泛存在于原核生物和真核生物中含有磷酸吡哆醛(PLP)四聚體的蛋白質(zhì)(Schirch, 2005)，其主要功能是在亞甲基四氫葉酸存在時，催化甘氨酸–絲氨酸相互轉(zhuǎn)化為許多生物合成反應(yīng)提供一碳單元，一碳單位代謝是所有生物尤其是植物體內(nèi)重要的初級代謝反應(yīng)，將氨基酸代謝與核苷酸及一些重要物質(zhì)的生物合成關(guān)聯(lián)起來(Bauwe, 2003)，線粒體為單碳供體如絲氨酸、甘氨酸、肌氨酸和二甲基甘氨酸提供氧化的場所(Tibbetts, 2010)。目前，關(guān)于SHMT的研究在微生物、植物和動物中均有報道(McClung, 2000; Garrow, 1993; Bauwe, 2003; 林穎輝等, 2018)。僅在擬南芥()中就發(fā)現(xiàn)基因的7種亞型：1、2、3、56和7，其中，1和2被認為可能為線粒體型，3為胞質(zhì)型，但胞漿型(4和5)和細胞核(6和7)中的定位仍有待證實(Wei, 2013; McClung, 2000)。

關(guān)于SHMT酶活性質(zhì)和性能等方面的研究多集中在微生物領(lǐng)域(馮炎, 2002; 孔慶勝等, 2010)。在細胞生理學(xué)上，SHMT是葉酸代謝過程中的關(guān)鍵酶之一，參與DNA、RNA合成、甲基供體及甲硫氨酸和輔酶等多種終端產(chǎn)物的合成。SHMT也能夠催化5,10-亞甲基四氫葉酸水解生成5-甲基四氫葉酸。5-甲基四氫葉酸的合成過程被認為是一碳單元和還原性葉酸在細胞中短暫保存的形式。基因在植物中的研究多與生長、抗逆和抗病蟲害有關(guān)(Weinstock, 1970; 朱曉嵐, 2017; 孫潔等, 2016; Sonnewald, 2008)。除此在外，還可通過影響機體的異常甲基化而引起致癌基因的激活和抑癌基因的失活，促進腫瘤的發(fā)生，因此，其在人類中的研究多與腫瘤有關(guān)(王益民等, 2006)。已有研究證實，在癌細胞增殖過程中，線粒體型2的表達顯著升高，胞質(zhì)型1的表達沒有明顯變化(Deberardinis, 2011; Koppenol, 2011)。但該基因在甲殼生物中還未見報道，其生物學(xué)功能尚不清楚。在前期獲得的不同饑餓脅迫條件下的脊尾白蝦轉(zhuǎn)錄組序列中發(fā)現(xiàn)了該基因，本研究旨在通過克隆該基因并進一步闡釋其在脊尾白蝦中的生物學(xué)功能。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗所用脊尾白蝦取自實驗室同一個母本繁育而來的家系成體，選取正常條件下體格健壯、大小均勻的脊尾白蝦3只，分別取其眼柄、胃、肝胰腺、心臟、鰓、腸、肌肉、腹索神經(jīng)、皮下脂肪以及卵巢10個組織用于RNA的提取。

1.2 Cd2+脅迫條件的設(shè)置

根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，采用單因子實驗設(shè)計的方法，設(shè)置對照組和4個不同濃度梯度的實驗組：實驗組1 (0.0100 mmol/L)、實驗組2 (0.0175 mmol/L)、實驗組3 (0.0210 mmol/L)和實驗組4 (0.0278 mmol/L)，各梯度以1 mol/L的CdCl2原液進行調(diào)配。脅迫實驗在室內(nèi)獨立養(yǎng)殖箱(長×高×寬為80 cm×60 cm×60 cm)中進行，實驗前在該環(huán)境(室溫20~25℃，鹽度25)下暫養(yǎng)7 d，期間每天換水1次，早晚投喂餌料及吸污各1次。實驗時，每組選擇大小均勻、健壯的脊尾白蝦70尾，期間為避免水環(huán)境中Cd2+濃度變化幅度較大，采取不投餌、不換水的方式。脅迫實驗共進行96 h，分別在0、3、6、12、24、48、72和96 h共8個時間點取樣，每組每次共取3個平行樣品。

1.3 總RNA的提取和cDNA合成

1.3.1 總RNA的提取 用濾紙吸干脊尾白蝦表面的海水后，分別選取脊尾白蝦各組織樣品用于RNA的提取。RNA提取采用UNIQ-10柱式Trizol總RNA提取試劑盒[生工生物工程(上海)]，為防止RNA污染以及降解，提取過程需全程佩戴口罩，勤換手套，并采用RNase Free的實驗器材。1%瓊脂糖凝膠電泳驗證RNA完整性，微量分光光度計UV-Vis測定RNA純度，RNA于–80℃保存。

1.3.2 cDNA第一鏈的合成 以脊尾白蝦各組織混合RNA為模板，一部分直接反轉(zhuǎn)錄為cDNA，合成試劑盒選用PrimerScriptTMRT Master Mix(TaKaRa)。另一部分利用SMARTTMRACE cDNA amplification 試劑盒(TaKaR)，分別合成5￠和3￠RACE-ready cDNA，余下RNA于–80℃保存。

1.4 引物及其序列

實驗所用引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，序列見表1。

1.5 脊尾白蝦SHMT基因的克隆

1.5.1 脊尾白蝦基因cDNA核心片段的克隆 以脊尾白蝦轉(zhuǎn)錄組序列為模板，設(shè)計核心序列引物(表1)。以脊尾白蝦各組織混合cDNA為模板，PCR擴增核心片段，克隆產(chǎn)物通過1.5%瓊脂糖凝膠驗證。切膠純化回收目的產(chǎn)物，膠回收試劑盒選自生工生物工程(上海)有限公司?；厥占兓螽a(chǎn)物經(jīng)克隆轉(zhuǎn)化后送至生工生物工程(上海)有限公司進行測序。

1.5.2 脊尾白蝦基因cDNA 5￠和3￠末端的快速擴增 根據(jù)獲得的脊尾白蝦基因的核心片段，設(shè)計特異性引物IS-DNMT-GSP-1-1用于5￠端的快速擴增，IS-DNMT-GSP2-1、IS-DNMT-GSP-2-2和IS-DNMT-GSP2-5用于3￠端的快速擴增(表1)。25ml反應(yīng)體系，PCR反應(yīng)程序按照TaKaRa RACE擴增試劑盒中的要求進行。反應(yīng)完成后，1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗證，切取目的條帶并回收，克隆測序，方法同上。測序結(jié)果在DNAMAN v6軟件完成拼接，拼接序列在NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進行比對，獲得完整的cDNA序列。

表1 實驗所用引物

Tab.1 Primers used in the experiment

1.5.3 脊尾白蝦基因DNA全序列的克隆

根據(jù)已獲得的脊尾白蝦基因cDNA序列設(shè)計覆蓋全序列的5對內(nèi)含子驗證引物，分別以脊尾白蝦cDNA、DNA為模板進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物以1%凝膠電泳驗證不同DNA模板中同一引物擴增產(chǎn)物條帶大小是否一致，以此來判定DNA序列中是否存在內(nèi)含子。

1.6 脊尾白蝦SHMT基因的生物信息學(xué)分析

基因的生物信息學(xué)分析主要通過以下程序或軟件進行：利用NCBI對所獲得基因序列進行檢測和氨基酸序列比對；利用ORF Finder (http://www.ncbi.nlm. nih.gov/gorf/gorf.html)軟件進行基因的開放閱讀框預(yù)測以及其所編碼氨基酸序列的分析；利用在線軟件ExPASy Prot Param (http://web.expasy.org/ protparam/)進行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析；利用Compute pI/Mw軟件(http://web.expasy.org/compute_pi/)進行理論等電點和分子量的計算；利用SMART軟件(http://smart.embl- heidelberg.de/index2.cgi)進行信號肽預(yù)測及蛋白結(jié)構(gòu)域的預(yù)測分析；通過在線軟件Cell-PLoc 2.0 (http://www.csbio. sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)對基因進行亞細胞定位；用MEGA6.0軟件進行氨基酸序列的多重比對及NJ系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建。

1.7 脊尾白蝦SHMT基因組織表達水平分析

根據(jù)已獲得的脊尾白蝦基因cDNA全序列設(shè)計熒光定量引物，并以脊尾白蝦18S rRNA作為內(nèi)參基因(表1)進行組織表達分析(薛蓓等, 2017)。

qRT-PCR分析所用試劑選自SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒(TaKaRa)，每個反應(yīng)設(shè)3個平行樣，反應(yīng)體系20ml：2×SYBR Premix ExTMⅡ 10 μl，dd H2O 4 μl，cDNA模板4 μl，Rox Reference DyeⅠ(50×) 0.4 μl，正反向引物(10 μmol/L)各0.8 μl，反應(yīng)程序按照試劑盒要求進行，qRT-PCR擴增在Step One Plus儀器上進行。

1.8 數(shù)據(jù)分析

實驗最終各定量結(jié)果采用SPSS 18.0和Excel軟件進行統(tǒng)計分析，并采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和最小顯著差異法(LSD)比較不同數(shù)據(jù)組間的差異，<0.05表示差異顯著，<0.01表示極顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 脊尾白蝦SHMT基因序列全長及分析

脊尾白蝦cDNA全長為1855 bp (GenBank登錄號：MH013225)，開放閱讀框為1407 bp，5￠非編碼區(qū)為39 bp，3￠非編碼區(qū)為409 bp，共編碼468個氨基酸，預(yù)測蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量為152.55 kDa，理論等電點為4.90。7對內(nèi)含子驗證引物在脊尾白蝦cDNA和DNA中的擴增結(jié)果一致，表明該基因不含內(nèi)含子。應(yīng)用SignalIP軟件對SHMT預(yù)測蛋白信號肽分析，顯示該蛋白不含信號肽序列。亞細胞定位軟件Cell-PLoc 2.0預(yù)測脊尾白蝦定位于線粒體中。

2.2 脊尾白蝦SHMT基因同源性分析

為了解脊尾白蝦基因與其他物種的同源性關(guān)系，從NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中選取15條不同物種的SHMT氨基酸序列，使用MEGA 6.0軟件(Neighbor-Joining法)對脊尾白蝦SHMT進行聚類分析，構(gòu)建進化樹。如圖2所示，脊尾白蝦與甲殼類動物真寬水蚤()聚為一類，且同源性較高，之后與昆蟲類聚為一類。脊椎動物中智人()和猩猩()聚為一類，隨后與小鼠(s)、牛()和斑馬魚()聚為一類。最后，牛的2和植物類、原生動物單獨聚為一類。該聚類結(jié)果符合傳統(tǒng)分類學(xué)結(jié)果。

2.3 脊尾白蝦SHMT的組織表達特征分析

為了解在脊尾白蝦不同組織間的表達特征，利用熒光定量PCR技術(shù)對脊尾白蝦10個組織中mRNA水平進行檢測。結(jié)果顯示(圖3)，在10個組織中均有表達，但不同組織間差異顯著，其中，在卵巢中表達量最高，顯著高于其他各組織(<0.01)，心臟次之。

圖1 脊尾白蝦SHMT基因的DNA全長序列及其編碼的氨基酸序列

加粗部位為起始密碼(ATG)和終止密碼(TGA)，方框內(nèi)為甘氨酸富集區(qū)域(GLQGGP)，下劃線部位為加尾信號(AATAA)

The bold sections were the start codon (ATG) and the stop codon (TGA), the letters in box indicated conserved glycine rich region, and the underlined sections were the tailing signal (AATAA)

圖2 脊尾白蝦SHMT系統(tǒng)進化樹分析

圖3 脊尾白蝦SHMT在不同組織中的表達特征

E: 眼柄; S: 胃; HE: 肝胰腺; H: 心臟; G: 鰓; I: 腸; M: 肌肉; V: 腹索神經(jīng); SAT: 皮下脂肪組織; O: 性腺不同字母表示不同組織的表達量差異顯著(<0.05)

E: Eyestalk; S: Stomach; HE: Hepatopancreas; H: Heart; G: Gill; I: Intestines; M: Muscle; V: Ventricular nerve; SAT: Subcutaneous fat tissue; O: Ovarybar of each column with different small letters mean significant difference (<0.05)

2.4 不同濃度Cd2+脅迫下脊尾白蝦SHMT的表達特征

不同濃度的Cd2+脅迫下，脊尾白蝦的qRT-PCR結(jié)果見圖4。脊尾白蝦含量在對照組中顯示出相對平穩(wěn)的趨勢，實驗組1 (0.0100 mmol/L)和實驗組2 (0.0175 mmol/L)均表現(xiàn)出自3 h開始升高后下降再升高的趨勢，不同的是，實驗組1 (0.0100 mmol/L)經(jīng)下降后，相對于對照組，在96 h極顯著升高(<0.01)，實驗組2 (0.0175 mmol/L)經(jīng)下降后在24 h表現(xiàn)出相對于對照組極顯著升高(<0.01)；實驗組3 (0.0210 mmol/L)在6 h開始有相對于對照組的極顯著升高(<0.01)，隨后下降再升高；實驗組4 (0.0278 mmol/L)表現(xiàn)出相對于對照組的極顯著降低(<0.01)，幾乎不表達。

圖4 不同濃度Cd2+脅迫下脊尾白蝦體內(nèi)SHMT基因的表達量隨時間的變化

*表示與對照組相比差異顯著(<0.05)，**表示與對照組相比差異極顯著(<0.01)

*and ** represent significant difference (<0.05) and highly significant difference (<0.01) between test and control, respectively

3 討論

通過將絲氨酸和四氫葉酸轉(zhuǎn)化為甘氨酸和N5,N10亞甲基四氫葉酸，為核苷酸、蛋白質(zhì)和甲基的生物合成過程提供活化的一碳單元。研究表明，絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶中均含有一個保守的甘氨酸富集區(qū)域GLQGGP，可能在與5'-磷酸吡哆醛結(jié)合過程中發(fā)揮重要作用，說明是以磷酸吡哆醛為輔酶進行反應(yīng)的(Usha, 1994)。進化樹分析發(fā)現(xiàn)，其與甲殼動物真寬水蚤胞質(zhì)型聚為一類，而亞細胞定位軟件預(yù)測脊尾白蝦定位于線粒體，因此，還需要進一步的研究進行驗證。

在研究脊尾白蝦組織表達特異性中發(fā)現(xiàn)，其在卵巢中表達量極顯著高于其他各組織，該表達模式與在斑馬魚中的表達模式相似，同時，支持了可能是母系必需基因的觀點(Chang, 2007; Vatcher, 1998)。除此之外，有研究發(fā)現(xiàn)，在家蠶()的脂肪體和表皮中表達量最高，可能在絲素合成過程中有重要作用(李俊龍, 2014)。據(jù)此，推測脊尾白蝦卵巢中的高表達可能也與其發(fā)育有關(guān)。

重金屬鎘(Cd)是目前近海主要污染物之一，在水體中不易降解，水生物通過食物鏈的富集可達到數(shù)千乃至萬倍，且不易排出體外(張瑞等, 2013; 冼健安等, 2012; van Hattum, 1989)。脊尾白蝦養(yǎng)殖和繁育近海海域區(qū)域受到重金屬鎘污染的問題越來越受到關(guān)注(李先超, 2011)。研究表明，鎘可對甲殼動物產(chǎn)生的不利影響是多方面的，主要表現(xiàn)在體內(nèi)主要抗氧化酶活、代謝酶活、細胞結(jié)構(gòu)的損傷以及抑制卵巢發(fā)育(Wu, 2004; Zhang, 2014; 李文艷等, 2008)。除此之外，還會影響多種生物出現(xiàn)異常甲基化以及某些功能基因的表達(王子成等, 2009; 王丙蓮等, 2006; Zhang, 2015)，因此，希望通過脊尾白蝦體內(nèi)在應(yīng)對Cd2+脅迫的表達特征，來分析其可能具備的生物學(xué)功能。本研究發(fā)現(xiàn)，在低濃度實驗組(實驗組1、實驗組2和實驗組3)中均表現(xiàn)出波動狀態(tài)；但在高濃度實驗組(實驗組4)，其表達量明顯下降，這說明長時間低濃度Cd2+的脅迫可能導(dǎo)致機體的適應(yīng)，這與李文艷等(2008)的研究結(jié)果一致。但高濃度的Cd2+脅迫可能對機體損傷較大，使其代謝機制出現(xiàn)異常，直接表現(xiàn)為氨氮排泄量增加，耗氧量(O/N)降低(Zhang, 2014)，的表達相應(yīng)受到抑制。其內(nèi)在的作用機制還有待進一步研究。

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Cloning and Expression Analysis of Serine Hydroxyl Methyltransferase () Genes from

SUN Jinqiu1, XU Wanyuan1, MA Hangke1, GAO Wei1, OUYANG Lefei1, GAO Huan1,2,3,4, YAN Binlun1,2,3,4①

(1. Jiangsu Key Laboratory of Marine Bioresources and Environment, Jiangsu Key Laboratory of Marine Biotechnology, Jiangsu Ocean University, Lianyungang 222005; 2. Co-Innovation Center of Jiangsu Marine Bio-Industry Technology, Lianyungang 222005; 3. Jiangsu Provincial Infrastructure for Conservation and Utilization of Agricultural Germplasm, Nanjing 210014; 4. Marine Resource Development institute of Jiangsu (Lianyungang), Lianyungang 222005)

In this study, based on the transcriptome ofunder hunger stress,genes were obtained by rapid amplification of cDNA ends (RACE) (GenBank accession No: MH013225). The full-length cDNA of thegene was 1855 nucleotides and contained an open reading frame (ORF) of 1407 bp, encoding a protein of 468 amino acid residues, with the predicted molecular weight of 152.55 kDa, and theoretical isoelectric point of 4.90. Multiple sequence alignment and phylogenetic analysis indicated thatgene is most homologous (96%) with that of. The expression pattern ofgene in different tissues was analyzed by qRT-PCR. The results showed thatgene was expressed in all tissues of. Transcript levels were high in the heart and ovary and were significantly higher in the ovary than in the other tissues. The results of different concentrations of Cd2+stress showed that the expression patterns of lower cadmium stress were basically the same, showing a trend of alternately first increasing and then decreasing. Under high concentration of Cd2+stress, the expression level was extremely low; and not even detected in these tissues. This suggests that high concentration of Cd2+stress can inhibit the expression of thegene. The specific mechanism needs further study.

; Serine hydroxyl methyltransferase; Gene cloning; Tissue expression; Cd2+stress

S917.4

A

2095-9869(2020)01-0127-08

10.19663/j.issn2095-9869.20181229001

* 江蘇省高等學(xué)校自然科學(xué)研究重大項目(17KJA240001)、江蘇省“六大人才高峰”創(chuàng)新人才團隊項目(2016- HYGC-CXTD-004)和淮海工學(xué)院研究生創(chuàng)新項目(XKYCXX2017-21)共同資助 [This work was supported by Natural Science Foundation of Jiangsu Higher Education Institutions of China (17KJA240001), “Six Talent Summit” Innovative Talent Team of Jiangsu (2016-HYGC-CXTD-004), and Huaihai Institute of Technology Graduate Innovation Project (XKYCXX2017-21)]. 孫金秋, E-mail: 1171840685@qq.com

閻斌倫，教授，E-mail: yanbinlun1962@163.com

2018-12-29,

2019-01-22

http://www.yykxjz.cn/

孫金秋, 徐莞媛, 馬杭柯, 高威, 歐陽樂飛, 高煥, 閻斌倫. 脊尾白蝦絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆及其表達特征分析. 漁業(yè)科學(xué)進展, 2020, 41(1): 127–134

Sun JQ, Xu WY, Ma HK, Gao W, Ouyang LF, Gao H, Yan BL. Cloning and expression analysis of serine hydroxyl methyltransferase (SHMT) genes from. Progress in Fishery Sciences, 2020, 41(1): 127–134

YAN Binlun, E-mail:yanbinlun1962@163.com

(編輯 馮小花)