魏平平 李 鑫 張俊鵬 費(fèi) 凡 馬 賀 高東奎 宋昌斌 陳 濤 劉 鷹

LED光譜對紅鰭東方鲀仔稚魚形態(tài)性狀及生長相關(guān)基因表達(dá)的影響*

魏平平1,3李 鑫1,3張俊鵬1,3費(fèi) 凡1,3馬 賀1,3高東奎1,3宋昌斌4陳 濤5劉 鷹1,2,3①

(1. 大連海洋大學(xué) 大連 116023; 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國家實(shí)驗(yàn)室 青島 266000; 3. 遼寧省水產(chǎn)設(shè)施養(yǎng)殖與裝備工程研究中心 大連 116023; 4. 中國科學(xué)院半導(dǎo)體研究所 北京 100083; 5. 深圳市超頻三科技股份有限公司 深圳 518000)

設(shè)置4種LED光譜環(huán)境，分別為藍(lán)(450 nm)、綠(525 nm)、黃(590 nm)和白(400~780n m)，水溫控制在(22±1)℃，光周期為16L:8D，光強(qiáng)設(shè)為200 mW/m2。研究光譜對紅鰭東方鲀()受精卵孵化和孵化后1~18 d (即實(shí)驗(yàn)第6~23天)仔稚魚形態(tài)性狀(全長、體長、軀干長、尾長、頭長、眼徑和體高)以及生長相關(guān)基因，包括生長激素()、生長激素受體1型()、類胰島素生長因子1型()基因相對表達(dá)量的影響。結(jié)果顯示，藍(lán)、綠、黃光處理組的受精卵比白光處理組早2 d孵化；在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，藍(lán)光處理組中，仔稚魚的全長、體長、軀干長和尾長生長最快，黃光處理組中，頭長、眼徑和體高生長最快。對于生長相關(guān)基因，藍(lán)光下的基因表達(dá)量顯著高于黃、白光組(0.05)，但與綠光組無顯著性差異；不同光譜下，基因的表達(dá)量無顯著性差異。結(jié)果表明，藍(lán)光、綠光和黃光促進(jìn)紅鰭東方鲀受精卵的孵化，藍(lán)光有利于紅鰭東方鲀仔稚魚的生長發(fā)育。本文研究了不同光譜對紅鰭東方鲀仔稚魚早期發(fā)育的形態(tài)性狀及生長相關(guān)基因表達(dá)的影響，為養(yǎng)殖廠對紅鰭東方鲀育苗提供科學(xué)的參考依據(jù)。

LED光譜；紅鰭東方鲀仔稚魚；形態(tài)性狀；生長相關(guān)基因的表達(dá)

光(光周期、光強(qiáng)、光譜)作為重要的環(huán)境因子之一，對許多重要硬骨魚類的胚胎發(fā)育、孵化和攝食有重要影響，包括奇努克三文魚()和比目魚() (Dey, 1990; Helvik, 1993、2010; Mangor- Jensen, 1995)等。在自然海域中，光隨海水的深度增加而快速衰減，光譜成分也發(fā)生了極大的改變，紅色光譜在淺水域占優(yōu)勢，而藍(lán)色光譜能量較高，在深水域占據(jù)主導(dǎo)地位(Tyler, 1968)。隨著光電材料科技的發(fā)展，發(fā)光二極管(LED)在水產(chǎn)中逐步開始應(yīng)用，相比于傳統(tǒng)的燈具，LED燈具有發(fā)光效率高、耗電量少、安全環(huán)保無污染等優(yōu)點(diǎn)。但LED的一些光特性(光強(qiáng)、光譜、光周期)對硬骨魚類的生長、攝食、繁殖的影響還知之甚少(Villamizar, 2009)。已有一些研究表明，光影響水產(chǎn)魚類受精卵孵化、存活和生長發(fā)育(Puvanendran, 2002; Yoseda, 2008)。另外，不適宜的光強(qiáng)或光譜對硬骨魚類的早期發(fā)育產(chǎn)生影響，導(dǎo)致骨骼發(fā)育不全、游泳能力喪失(Battaglene, 1990; Trotter, 2003)。因此，研究光對硬骨魚類的影響可為養(yǎng)殖業(yè)提供科學(xué)的參考依據(jù)。

紅鰭東方鲀()是亞洲地區(qū)(韓國、日本和中國)的重要養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚種。目前，有關(guān)光譜對紅鰭東方鲀仔稚魚生長影響的研究甚少，本研究探究LED光譜對紅鰭東方鲀仔稚魚形態(tài)性狀及生長相關(guān)基因表達(dá)量的影響，為養(yǎng)殖廠對紅鰭東方鲀育苗提供科學(xué)的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用卵取自河北天正實(shí)業(yè)有限公司人工飼養(yǎng)親魚的自然產(chǎn)卵，產(chǎn)卵當(dāng)日，受精卵空運(yùn)至大連海洋大學(xué)水產(chǎn)設(shè)施養(yǎng)殖與裝備工程研究中心，放置于實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中立即進(jìn)行光照實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)于2018年3月16日開始，采用遮光布遮擋自然光，采用4種LED光譜燈(深圳市超頻三科技股份有限公司)，分別為藍(lán)(450 nm)、綠(525 nm)、 黃(590 nm)、白(400~780 nm)，每種光譜設(shè)置2個平行，養(yǎng)殖桶采用圓型桶(直徑為80 cm，水深為60 cm)，水體約250 L(10粒卵/L)，水溫為(22±1)℃，光周期為16L:8D，光強(qiáng)為200 mW/m2，每天08:30采用SRI-2000-UV光譜照度計(jì)(尚澤股份有限公司)于水面5 cm處測定并校準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)第6天，受精卵開始孵化，孵化后的仔魚開口后，按生長期分別投喂輪蟲()(約10個/ml)、鹵蟲()(約5個/ml)，從受精卵孵化出仔魚開始取樣，在實(shí)驗(yàn)第6、7、8、9、12、13、14、15、18、21、23天的09:00取樣，每次隨機(jī)取15~20尾，用戊二醛保存，采用9SMZ 745T/ SMZ1000高級體視顯微鏡[尼康映像儀器銷售(中國)有限公司]測量全長、體長、軀干長、尾長、頭長、眼徑和體高。在實(shí)驗(yàn)第23天，每個處理組取30尾仔稚魚保存于–80℃冰箱，用于測定生長相關(guān)基因的相對表達(dá)量。

1.3 總RNA的提取和生長相關(guān)基因表達(dá)量的測定

將凍存樣品取出后，按照UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒(BBI, A606695)的操作說明書進(jìn)行總RNA的提取。利用微量分光光度計(jì)(SMA4000, Merinton)測定RNA樣品的OD260及OD280值，根據(jù)OD260/OD280的比值判斷總RNA純度；1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量。

表1 定量PCR引物序列

Tab.1 Primer sequence for real-time quantitative PCR

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)表示，使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(One- way ANOVA)和LSD來檢驗(yàn)不同處理組間基因表達(dá)量的差異，<0.05為差異顯著，分析所得數(shù)據(jù)使用Origin 2017軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果

2.1 光譜對紅鰭東方鲀受精卵孵化的影響

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知，在實(shí)驗(yàn)第6天，藍(lán)、綠、黃光處理組的受精卵開始孵化，白光處理組的受精卵在第8天開始孵化(表2)。白光處理組的受精卵與其他光色相比，孵化出仔魚延緩了2 d。

2.2 光譜對紅鰭東方鲀仔稚魚形態(tài)性狀的影響

在孵化后第6、7天，不同光譜下初孵仔稚魚全長未出現(xiàn)顯著性差異，但藍(lán)光組仔稚魚全長平均值高于綠、黃光組。在隨后的生長過程中，白光組仔稚魚全長始終低于其他光照組。在第17天，黃光組仔稚魚全長顯著高于藍(lán)、白光組(0.05)，但藍(lán)光組出現(xiàn)快速生長，在第20天，藍(lán)、黃光處理組仔稚魚的全長顯著高于綠、白光組(0.05)，在第23天，各處理組之間無顯著性差異，但藍(lán)光處理組仔稚魚的全長最大。

表2 光譜對紅鰭東方鲀仔稚魚全長的影響

Tab.2 The effect of spectra on the total length of Takifugu rubripes

注：數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE) (=15)；相同字母代表各處理組間無顯著性差異(>0.05)，不同字母表示各處理間差異顯著(<0.05)，下同

Note: Values are expressed as Mean±SE (=15). The same letter indicates no significant difference between the treatment groups (>0.05), and different letters indicate significant differences between treatments (<0.05), the same as below

第6天，不同光譜組體長未出現(xiàn)顯著性差異，7 d時，綠光組的仔稚魚體長與藍(lán)光組出現(xiàn)顯著性差異(0.05)，7、8 d，黃光組體長顯著高于綠光組(0.05)。同樣，17 d后，藍(lán)光組體長生長較快，在22 d時顯著高于綠光、白光組(0.05)。23 d，藍(lán)光組的體長平均值達(dá)到最高，但與其他光譜組相比，無顯著差異，白光組仔稚魚體長變化情況與全長相似。

第6天，藍(lán)光組紅鰭東方鲀仔魚頭長與綠、黃光組出現(xiàn)顯著性差異(<0.05)，7 d時，不同光譜處理組的差異不顯著，在第11天，黃光組與藍(lán)、綠光組無顯著性差異，但與白光組差異性顯著(<0.05)。在第17天，藍(lán)、綠、黃光組顯著高于白光組(<0.05)。在第23天時，黃光組的頭長最大。

在實(shí)驗(yàn)第6天時，綠光處理組仔稚魚的軀干長與藍(lán)、黃處理組出現(xiàn)顯著性差異(0.05)，第8~11天，仔魚的軀干長逐漸減小，而黃光組仔稚魚的軀干長從第7天開始逐漸增長，在第10天時，黃光組的軀干長顯著高于綠光組(0.05)；17 d后，白光組與綠光組無顯著性差異，第23天，藍(lán)光組下仔稚魚的軀干長最大。

在6、7 d時，不同光譜下仔稚魚的尾長無顯著性差異，在第8天，藍(lán)、白光譜下的尾長與綠光組出現(xiàn)顯著性差異(0.05)，8 d時，藍(lán)、黃、白光組顯著高于綠光組(0.05)，20、23 d，藍(lán)、綠、黃組之間無顯著性差異，且平均值都高于白光組。

圖1 光譜對紅鰭東方鲀仔稚魚形態(tài)性狀的影響

在不同光譜下初孵仔稚魚眼徑無顯著性差異，在第7、8天，綠光組顯著高于藍(lán)光組(0.05)。在第9、10天，各處理組無顯著性差異。11 d后，不同光譜下的眼徑呈現(xiàn)不規(guī)則的“M”型趨勢，在第17天后，黃光組下的眼徑一直高于其他處理組。

對于紅鰭東方鲀仔稚魚的體高，僅在8、14、23 d時，不同處理組之間出現(xiàn)顯著性差異。在第8天，綠光組顯著高于黃光組(0.05)，與藍(lán)、白光組無顯著性差異。14 d，白光組顯著高于藍(lán)、綠光組(0.05)，但與黃光組無顯著性差異；第23天，黃光組與綠光組有顯著性差異(0.05)，與藍(lán)、白光組無顯著性差異。

2.3 光譜對紅鰭東方鲀生長相關(guān)基因表達(dá)量的影響

不同光譜對基因相對表達(dá)量有顯著影響，藍(lán)光下，基因表達(dá)量顯著高于黃、白光組(0.05)，但與綠光組的表達(dá)量無顯著性差異(圖2A)。對于基因，不同光譜下基因的表達(dá)量無顯著性差異，但藍(lán)光下基因的表達(dá)量最高，依次為黃、綠、白光(圖2B)。藍(lán)、綠光下基因表達(dá)量較高，但與黃、白光組的表達(dá)量之間無顯著性差異(圖2C)。

圖2 光譜對紅鰭東方鲀生長相關(guān)基因表達(dá)的影響

Fig.2 The effect of spectra on the expression of growth-related gene in

3 討論

研究表明，魚類受精卵的孵化受溫度、鹽度、pH、溶解氧等環(huán)境因子的影響(楊明秋等, 2012; 戈志強(qiáng)等, 2003)，而光作為重要的環(huán)境因子之一，對魚類受精卵的孵化、仔魚的生長也有著重要的影響(柳學(xué)周等, 2004; Villamizar, 2009; Blanco-Vives, 2010)。本文研究了不同光譜(藍(lán)、綠、黃、白)對紅鰭東方鲀受精卵孵化和仔稚魚形態(tài)性狀的影響。結(jié)果顯示，藍(lán)、綠、黃光處理下的第6天，受精卵開始孵化，且各組之間的全長、體長、尾長、眼徑、體高均無顯著差異，但藍(lán)光下的頭長顯著高于綠、黃光組，綠光下的軀干長顯著高于藍(lán)、黃光組的軀干長。而白光組在第8天開始孵化出仔稚魚。分析認(rèn)為，在藍(lán)、綠和黃處理組中，受精卵受到單色光刺激，促進(jìn)了受精卵的孵化，導(dǎo)致藍(lán)、綠和黃光組中受精卵比白光組提前2 d孵化。Downing等(2002)關(guān)于光譜(藍(lán)、綠和白)對黑線雪魚()受精卵影響研究中，并未發(fā)現(xiàn)光譜對黑線雪魚的孵化有顯著性差異，這可能是由于不同物種對不同光譜的敏感度不同，具有種屬特異性(Boeuf, 1999)。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，藍(lán)光下仔稚魚的全長、體長、軀干長和尾長的平均值最大，黃光下仔稚魚頭長、眼徑和體高的平均值最大。分析認(rèn)為，這可能是由于仔稚魚不同性狀對不同光譜的敏感度不同。藍(lán)色光譜對歐洲舌齒鱸()、塞內(nèi)加爾鰨()、大西洋鱈魚()仔魚的生長有促進(jìn)作用(Villamizar, 2009; Blanco-Vives, 2010; Sierra-Flores, 2016)，這與本研究結(jié)果相似。歐洲舌齒鱸受精卵在孵化后30 d，藍(lán)光可以促進(jìn)其仔魚生長；同時，對于其器官發(fā)育，藍(lán)光下仔稚魚牙齒發(fā)育率為100%，白光、紅光下的發(fā)育率分別為63%、40%，魚鰾也是藍(lán)光下發(fā)育的最好，體長、體重也一樣(Villamizar, 2009)。本研究中，藍(lán)光促進(jìn)了仔稚魚的生長(全長、體長、軀干長和尾長)。由此，可以推測，優(yōu)勢光譜對仔魚生長和器官發(fā)育的影響相似。

環(huán)境因子如溫度、光周期、光譜會影響生物體內(nèi)激素的變化(Kim, 2016)，生長激素軸是脊椎動物生長的調(diào)節(jié)核心，可以通過刺激細(xì)胞分化直接影響生長，導(dǎo)致細(xì)胞增殖，從而促進(jìn)生物的生長(Bj?rnsson, 1997; Duan, 1997; Green, 2010)。本研究中，藍(lán)光下基因的相對表達(dá)量顯著高于黃、白光組，而、基因在不同光譜下的表達(dá)無顯著性差異，但藍(lán)光組基因表達(dá)量均較其他光處理組高。從圖4、圖5可以看到，藍(lán)、黃光組的尾長、頭長發(fā)育較快，在前10 d，頭長處于快速生長階段。對于體高，各光譜處理組總體變化不大，分析認(rèn)為，處理組中的仔稚魚體內(nèi)卵黃囊在不斷消耗，體積逐漸變小，而仔稚魚又在不斷生長，故在實(shí)驗(yàn)前20 d，體高的變化幅度不大，待卵黃囊完全消耗時，體高的發(fā)育出現(xiàn)明顯差異(圖7)。

綜上所述，藍(lán)、綠、黃光處理組的受精卵比白光處理組早2 d孵化；在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(第23天)，藍(lán)光處理組仔稚魚的全長、體長、軀干長和尾長生長最快，黃光處理組頭長、眼徑和體高生長較快。對于生長相關(guān)基因，藍(lán)光下的生長相關(guān)基因相對表達(dá)量最高，對于基因，不同光譜下基因的相對表達(dá)量無顯著性差異，因此，建議在紅鰭東方鲀受精卵孵化時，可采用藍(lán)色光譜照射，以減少孵化時間，促進(jìn)仔魚生長，縮短養(yǎng)殖周期，節(jié)約成本。

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Effects of LED Spectra on Morphological Characters and Gene Expression of Growth inLarvae

WEI Pingping1,3, LI Xin1,3, ZHANG Junpeng1,3, FEI Fan1,3, MA He1,3, GAO Dongkui1,3, SONG Changbin4, CHEN Tao5, LIU Ying1,2,3①

(1. Dalian Ocean University, Dalian 116023; 2. Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266000; 3. Liaoning Aquaculture Facilities and Equipment Engineering Research Center, Dalian 116023; 4. China Academy of Sciences Institute of Semiconductors, Beijing 100083; 5. Led Cooler Technology Co. Ltd, Shenzhen 518000)

Four LED spectral parameters were set, which were blue (450 nm), green (525 nm), yellow (590 nm), and white (400~780 nm), water temperature was controlled at (22±1)℃, photoperiod was 16L:8D. The light intensity was set at 200 mW/m2. The results showed that the fertilized eggs ofunder the blue, green and yellow light hatched 2 days earlier than the white light. At the end of the experiment, the full length, body length, trunk length and tail length of the larvae under the blue light were the most. Under yellow light, the head length, eye diameter, and body height showed the fastest growth. For growth genes, the expression of growth hormone () gene under the blue light was significantly higher than yellow and white light group (<0.05), but there was no significant difference with green light group. There was no significant difference in gene expression for growth hormone receptor 1 () and insulin-like growth factor type() under different spectra, but the expression ofgene under blue light was the highest. The results showed that LED spectrum (blue, green, and yellow) promoted the hatching of the fertilized eggs of, and the blue spectrum is beneficial to the growth and development of thelarvae. The paper provided a scientific reference for the incubation of.

LED Spectrum;larvae; Morphological character; Gene expression of growth

S965.335

A

2095-9869(2020)01-0162-07

10.19663/j.issn2095-9869.20181207001

* 國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2017YFB0404000)資助 [This work was supported by National Key Research and Development Program (2017YFB0404000)]. 魏平平, E-mail: 335613556@qq.com

劉 鷹，教授，E-mail: yingliu@dlou.edu.cn

2018-12-07,

2019-01-02

http://www.yykxjz.cn/

魏平平, 李鑫, 張俊鵬, 費(fèi)凡, 馬賀, 高東奎, 宋昌斌, 陳濤, 劉鷹. LED光譜對紅鰭東方鲀仔稚魚形態(tài)性狀及生長相關(guān)基因表達(dá)的影響. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2020, 41(1): 162–168

Wei PP, Li X, Zhang JP, Fei F, Ma H, Gao DK, Song CG, Chen T, Liu Y. Effects of LED spectra on morphological character and gene expression of growth inlarvae. Progress in Fishery Sciences, 2020, 41(1): 162–168

LIU Ying, E-mail: yingliu@dlou.edu.cn

(編輯 馮小花)