■羅飛亞 楊慧超 劉夢婷 曾建國，3*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南長沙410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)中獸藥湖南省重點實驗室，湖南長沙410128；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸用中藥資源與中獸藥創(chuàng)制國家地方聯(lián)合工程研究中心，湖南長沙410128）

谷物在貯存過程中容易發(fā)生腐爛酸敗現(xiàn)象，尤其是一些油脂類成分含量高的產(chǎn)品，這就給企業(yè)甚至國家造成了巨大的經(jīng)濟損失。變質(zhì)的谷物不僅會導(dǎo)致其營養(yǎng)成分的損失，而且會危害人類健康。而谷物在貯存過程中腐爛酸敗多是由于物理、化學(xué)及微生物影響所致，其中微生物的影響最為明顯[1]。吳國鋒[2]指出我國小麥粉主要是由芽孢菌群、大腸菌群等微生物影響，其中細菌量的典型數(shù)值為104CFU/g，大腸菌群典型數(shù)值為102CFU/g，芽孢菌總數(shù)的典型數(shù)值為103CFU/g。井勇[3]報道谷物霉變主要是由于曲霉菌屬引起。一直以來，人們?yōu)榱私鉀Q谷物在貯存過程中腐爛酸敗的問題，長期的做法是添加防腐劑、防蟲劑等[4]，而此類物質(zhì)多是化學(xué)物質(zhì)，具有一定毒性，對人類的健康存在著極大的安全隱患。因此，尋找一種新型的防霉防腐劑和抗氧化劑來解決谷物在貯存過程發(fā)生的腐爛酸敗問題顯得尤為重要。

植物精油是從芳香植物中提取的一類天然物質(zhì)，我國植物資源豐富，為開發(fā)利用植物精油提供了有利條件。植物精油成分復(fù)雜，多由幾十至上百種化合物組成，大都具有特殊香味，并具有一定的抗菌和抗氧化能力[5]，因此廣泛受到人們的關(guān)注。王放銀等[6]研究表明石香薷精油對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有良好的抑制效果；張有林等[7]研究百里香精油的抗菌及抗氧化活性，結(jié)果顯示百里香精油對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、黑曲霉菌、啤酒酵母菌的抗菌性均表現(xiàn)為敏感型，且其具有較強的抗氧化能力；柴向華等[8]研究表明羅勒精油對霉菌有較好的抑制作用；賈佳等[9]通過肉湯稀釋法和瓊脂擴散法研究迷迭香精油的抑菌活性，結(jié)果表明迷迭香精油具有廣譜抗菌作用。王新偉等[10]研究表明牛至油對面包酵母和黑曲霉菌有較好的抑制作用。而目前對精油的研究大都集中在單一品種的抗菌和抗氧化，缺少對多種植物精油的比較研究，對精油植物資源的研究開發(fā)帶來不便。本文選取了五種植物精油并研究其抗菌、抗氧化作用，為更好地將植物精油開發(fā)成新型的防霉防腐劑提供參考。

1 儀器和材料

1.1 儀器

電子調(diào)溫電熱套（98-1-B型，天津市泰斯特儀器有限公司）；PL203 電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；UV2400型紫外可見分光光度計（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；酶標(biāo)儀（NanoQuant in?finite M200Pro TECAN）；ZHWY-103D 型臺式恒溫振蕩器（上海智誠分析儀器制造有限公司）；SPX-150型生化培養(yǎng)箱（北京市永安光明醫(yī)療儀器廠）；LDZF-75KB-Ⅱ型立體蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）。

1.2 材料

藥材：石香薷（Mosla chinensis Maxim.，湖南新寧）、迷迭香（Rosmarinus officinalis Linn.，湖南長沙）、牛至（Origanum vulgare Linn.，湖南長沙）、百里香（Thymus mongolicus Ronn.，山東青島）、羅勒（Oci?mum basilicum Linn.，山東青島）。

試劑：DPPH(50 mg/瓶)、總抗氧化能力檢測試劑盒(FRAP 法，碧云天生物技術(shù))、吐溫-80、無水硫酸鈉(分析純，500 g/瓶)、沒食子酸丙酯（PG，化學(xué)純，100 g/瓶)、抗壞血酸（VC，1 g/瓶，阿拉?。?、馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基（PDA），水為蒸餾水，tryptone、yeast ex?tract（OXOID），氯化鈉(分析純)、瓊脂粉。

菌種：大腸桿菌(Escherichiacoli, E.Coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, S.a)、腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis, S.e)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis, B.s)，黑曲霉菌（Aspergillus Niger），所有供試菌種均來自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。

2 方法

2.1 植物精油的提取

參考王書平等[11]方法。將五種藥材切斷至1 cm左右，分別取200 g于圓底燒瓶中，加水1 200～1 600 ml，使水剛好浸沒藥材為宜，震蕩搖勻后，靜置30 min，然后連接揮發(fā)油測定器和冷凝回流管。從冷凝回流管上端加水至揮發(fā)油測定器刻度線，并出現(xiàn)水流入圓底燒瓶的現(xiàn)象為止。然后用電熱套加熱至沸騰，并保持微沸4 h，停止加熱。靜置片刻后，打開揮發(fā)油提取器下端活塞，收集精油，用無水硫酸鈉除水后置于棕色瓶中，4 ℃保存?zhèn)溆?，并計算各藥材的提取率?/p>

2.2 植物精油的抗氧化活性測定

2.2.1 植物精油對DPPH·的清除率的測定

準確稱取0.019 7 g DPPH·溶解于無水乙醇中，定容于250 ml 棕色容量瓶中，即配制成2×10-4mol/l的DPPH·乙醇溶液，低溫儲藏備用；另取適量精油用無水乙醇溶解，分別配制成1、5、10、20、40、80 μg/ml的精油乙醇溶液，低溫儲藏備用。

參照Kaan 等[12]和Thaipong 等[13]的方法。吸取2 ml 2×10-4mol/l 的DPPH·乙醇溶液，再加入2 ml 無水乙醇，置于具塞試管中，記作A0；另取兩根具塞試管各加入2 ml 1 μg/ml 的精油溶液，然后分別加入2 ml 2×10-4mol/l 的DPPH·乙醇溶液、2 ml 無水乙醇溶液，分別記作Ai和Aj。用力搖勻。將A0、Ai和Aj所表示的樣品在室溫暗處靜置反應(yīng)30 min，加入比色皿中，在波長517 nm 處進行吸光度的測定，以無水乙醇作為對照調(diào)零，分別測出A0、Ai和Aj所示樣品的吸光度值。同理分別測定出5、10、20、40、80 μg/ml的精油溶液的吸光度值，并用PG和VC做陽性對照。每個濃度重復(fù)3次，記錄平均值。植物精油對DPPH·的清除率（SR%）按下面公式計算。

2.2.2 植物精油總抗氧化能力的測定（FRAP法）

集控臺上和機旁控制面板上均設(shè)有車鐘顯示板，用于使機旁試車工作人員及時掌握主機的運行狀態(tài)(車令復(fù)示功能)和與集控臺操作人員的通信(輔車鐘通信功能)。

參照陳玉霞等[14]方法。96 孔板的每個檢測孔中加入180 μl FRAP工作液，空白對照孔中加入5 μl蒸餾水，樣品檢測孔內(nèi)分別加入5 μl 不同體積分數(shù)的精油溶液。以Trolox作為陽性對照。37 ℃孵育3～5 min在593 nm 處測定其吸光度。以FeSO4標(biāo)準溶液測定繪制標(biāo)準曲線，樣品的總抗氧化能力以FRAP 值來表示，1 FRAP 值與1 mmol/l FeSO4相當(dāng)。圖1 為FeSO4標(biāo)準曲線，求得其回歸方程為Y=0.306x+0.052 7，相關(guān)系數(shù)為R2=0.999 1。

圖1 FeSO4標(biāo)準曲線

2.3 植物精油的抑菌圈測定

采用濾紙片擴散法[15]，在無菌條件下，吸取2 μl精油于濾紙片（d=6 mm）上，并使其完全均勻分散，自然風(fēng)干，貼到涂抹適宜濃度菌懸液（1×106～107CFU/ml）的培養(yǎng)基平板上，每皿2 片并以無菌水作對照，重復(fù)3 次，37 ℃培養(yǎng)12 h，十字交叉法[16]測定抑菌圈大小。

2.4 植物精油最低抑菌濃度（MIC）測定

采用二倍稀釋法[17-18]，并稍作改變。將五種精油分別用1%的吐溫-80 水溶液稀釋成160 μl/ml 的溶液。取無菌試管10支，排成一排，編號1～10。除1號管中加入1.6 ml LB 培養(yǎng)基，其余各管各加入1 ml LB 培養(yǎng)基。然后再加入0.4 ml 精油溶液至1 號管，混勻，從1 號管中吸取1 ml 液體加入至2 號管，混勻后吸取1 ml 加入3 號管，以此類推，8 號管中吸取1 ml 液體棄去。9 號管為不含精油溶液的生長對照，10 號管為空白對照。然后在1～8 號每管內(nèi)加入菌液1 ml，使精油濃度最終為0.125～16 μl/ml，最終菌液濃度為1×106～107CFU/ml。將接種好的試管，于37 ℃培養(yǎng)6 h，然后吸取100 μl 涂布瓊脂平板，再于37 ℃培養(yǎng)12 h，觀察，無細菌生長的為最低抑菌濃度（MIC），在此基礎(chǔ)上繼續(xù)培養(yǎng)12 h，仍無細菌生長的為最低殺菌濃度（MBC）。

2.5 植物精油對真菌的抑制作用測定

參考馬萱等[19]的方法。挑取適量黑曲霉菌孢子，接種在PDA 培養(yǎng)基上，于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，倒入5 ml無菌水，輕輕洗下孢子，制成孢子懸浮液，使孢子濃度大約在1×104個/ml。然后用移液槍取100 μl的孢子懸浮液加到已制好的PDA平板上，用滅菌的涂布棒涂勻，將含有2 μl 精油的濾紙片放在培養(yǎng)皿中心，重復(fù)3次，以不加濾紙片作為生長對照，28 ℃培養(yǎng)一周，觀察并記錄霉菌生長情況。

3 結(jié)果

3.1 植物精油的提取結(jié)果分析

實驗結(jié)果表明，植物精油的提取率（v/m）隨時間的延長而增大，在蒸餾4 h 后進而達到飽和。石香薷精油的提取率為1.73%，迷迭香精油的提取率為1.90%，百里香精油的提取率為0.75%，牛至精油提取率為0.30%，羅勒精油的提取率為0.13%。

3.2 DPPH·清除實驗結(jié)果分析

五種植物精油清除DPPH自由基的實驗結(jié)果如圖2所示，五種植物精油對DPPH·的清除率大小與其濃度呈正向相關(guān)。石香薷精油的IC50=1.92 μg/ml，迷迭香精油的IC50=20.36 μg/ml，羅勒精油的IC50＜1 μg/ml，百里香精油的IC50＜1.42 μg/ml，牛至精油的IC50＜1.47 μg/ml?？傮w來看，五種植物精油表現(xiàn)出較強的清除DPPH·的能力。百里香精油對DPPH·的IC50值稍小于牛至精油，但牛至精油在達到飽和點的清除率卻稍大于百里香精油，說明牛至精油清除DPPH·的能力要略強于百里香精油，而抗氧化劑表現(xiàn)出來的抗氧化活性大小一般是酚類＞醛類＞醇類，本研究中所選五種植物精油其化學(xué)成分都含有大量的酚類以及烯烴類化合物，如百里香酚、對傘花烴、香芹酚等[20-24]，因此其具有較強的清除DPPH·的能力。

圖2 五種植物精油對DPPH·的清除率

3.3 總抗氧化能力結(jié)果分析

由圖1 可知，F(xiàn)eSO4標(biāo)準曲線在0.15～1.5 mmol/l之間線性關(guān)系良好。圖3 為五種精油溶液的FRAP值測定結(jié)果?？梢钥闯觯宸N植物精油的總抗氧化能力大小為羅勒精油＞牛至精油＞石香薷精油＞百里香精油＞迷迭香精油，羅勒精油的抗氧化能力遠遠高于其他四種精油，迷迭香精油的總抗氧化能力遠遠低于其他四種精油。同理測得對照組Trolox 的相對總抗氧化能力為2.03±0.11，與其比較而言，本實驗研究的五種植物精油都具有較強的抗氧化能力。

圖3 五種精油的FRAP值

3.4 植物精油的抑菌活性結(jié)果分析

3.4.1 植物精油的抑菌活性(見表1)

如表1所示，五種植物精油對四種病原菌都展現(xiàn)出了抑制作用，其中石香薷精油、百里香精油、牛至精油對S.a 抑制作用較強，而其對E.Coli、B.s、S.e 的抑菌效果相當(dāng)。迷迭香精油對四種病原菌的抑制效果都較差，羅勒精油對S.a的抑制作用一般，但仍要強于其對E.Coli、B.s、S.e的抑制作用。

3.4.2 植物精油的MIC和MBC測定結(jié)果

采用肉湯稀釋法測定了五種植物精油的MIC 和MBC，植物精油對四種病原菌的MIC 和MBC 見表2。石香薷精油對S.a、B.s、S.e的MIC值為1 μl/ml，MBC值分別為2、1、2 μl/ml，對E.coli 的MIC 值為2 μl/ml，MBC 為4 μl/ml，顯示了石香薷精油具有較強的抑菌和殺菌能力。同樣牛至精油和百里香油也具有良好的抑菌能力，MIC 在1～4 μl/ml 之間。而迷迭香精油和羅勒精油的抑菌能力就顯得較弱，這也與抑菌圈實驗結(jié)果具有一致性，其對四種病原菌的MBC 值更是達到了16 μl/ml，但迷迭香精油對S.e 的MIC 和MBC值一樣，都為4 μl/ml。

表1 五種植物精油對不同菌種的抑菌圈的影響(mm)

表2 植物精油對四種病原菌的MIC和MBC(μl/ml)

3.4.3 植物精油對黑曲霉菌的抑制結(jié)果分析(見表3)

由表3 可知，其中石香薷精油組在培養(yǎng)前3 d 都無霉菌生長，培養(yǎng)至第4 d 開始有少量霉菌生長，至第7 d 大量生長至一皿；百里香精油組在第3 d 開始有霉菌生長，培養(yǎng)第5 d 霉菌開始大量生長；而牛至精油是在培養(yǎng)第2 d 開始有霉菌生長，培養(yǎng)至第5 d有霉菌大量生長?？梢钥闯霰狙芯恐校戕妇蛯γ咕种菩Ч詈?，其次是百里香精油、牛至精油，而迷迭香精油和羅勒精油對霉菌幾乎沒有抑制作用。

表3 植物精油對黑曲霉菌的抑制作用

4 討論

我國芳香植物資源豐富，在植物精油的原料選擇方面有著獨特的優(yōu)勢。本研究中石香薷、迷迭香、百里香等植物精油的提取率較高，分別達到了1.73%、1.90%、0.75%。選擇精油提取率較高的植物開發(fā)利用，可以極大的節(jié)約成本。

本研究通過DPPH·清除實驗和FRAP 法測定了五種精油的抗氧化能力，結(jié)果顯示五種植物精油對DPPH·都表現(xiàn)出了較強的清除能力，其中羅勒精油清除DPPH·的能力最強，IC50＜1 μg/ml，而石香薷精油、百里香精油、牛至精油的IC50值相當(dāng)，迷迭香的IC50值高于其他四種精油。另外，五種植物精油的總抗氧化能力也和清除DPPH·的能力表現(xiàn)出一致性，羅勒精油的總抗氧化能力最強，其FRAP值達到了1 536.67，相比之下迷迭香精油的總抗氧化能力很低，其FRAP 值只有22.14，與報道相差較大[26]，可能是由于地域原因?qū)е戮椭杏行Щ瘜W(xué)成分含量不同，從而影響其清除自由基的能力。

本研究中五種植物精油在抑制微生物生長方面表現(xiàn)出不同的能力，其中石香薷精油、百里香精油、牛至油展現(xiàn)出了廣譜抗菌作用，不僅對實驗中四種供試細菌有較好的抑制效果，而且對黑曲霉菌也表現(xiàn)出了較強的抑制作用，尤其對S.a 的抑制作用最為明顯（抑菌圈大于30 mm）。相比之下，迷迭香精油對四種供試細菌的抑菌能力較弱，羅勒精油對S.a 有較明顯的抑制作用，但其殺菌濃度較高，而羅勒精油和迷迭香精油對黑曲霉菌都沒有抑制作用。

植物精油可作為一種新型的天然、綠色、無毒的防霉防腐劑開發(fā)應(yīng)用，前景廣闊。本研究表明石香薷精油、百里香精油、牛至精油具有良好的抗菌抗氧化作用，而羅勒精油具有極強的抗氧化能力，但其抗菌作用略弱，后期考慮復(fù)配精油進行深入研究。同時希望通過更深入的研究挖掘出更多芳香植物精油[27-28]，以便在將來替代化學(xué)類防霉防腐劑應(yīng)用于生活的各個領(lǐng)域。