■周海霞 房慶峰 李穎穎 羅塞博 戴南平 白寅霜 趙 偉

(1.德州學院生命科學學院 功能性生物資源利用與開發(fā)省高校重點實驗室，山東德州253023；2.山東福洋生物科技有限公司，山東德州253100)

葡萄糖酸鈉在建筑、醫(yī)療、食品行業(yè)中有著廣泛 應用，隨著經(jīng)濟的快速發(fā)展其產(chǎn)量急劇增加。葡萄糖酸鈉的工業(yè)生產(chǎn)是以玉米淀粉為主要原料，在提取獲得葡萄糖酸鈉后，還產(chǎn)生大量剩余母液，這部分液體殘?zhí)钱愄呛扛遊1]，BOD(生物需氧量)高，作為飼料銷售價值低，直接排放造成環(huán)境污染。酵母菌和乳酸菌具有重要的益生作用，在食品或飼料中應用廣泛。釀酒酵母是優(yōu)良的天然單細胞蛋白質(zhì)，含有豐富的維生素和礦物質(zhì)，具有促進食品的消化吸收，促進生長，提高免疫力的作用[2]。雙歧桿菌和乳桿菌是人類和動物益生菌的主要代表，具有抗菌抑菌、促進營養(yǎng)物質(zhì)分解、增強免疫、預防腫瘤等作用[3-4]。即使是益生菌的發(fā)酵產(chǎn)物和滅活菌體也能發(fā)揮益生作用[5-6]。葡萄糖酸鈉母液益生菌再發(fā)酵研究較少，只有少量關于葡萄糖酸鈉作為飼料成分具有益生作用的研究[7]。本研究擬以提取葡萄糖酸鈉后的母液作為營養(yǎng)物質(zhì)，利用釀酒酵母菌、雙歧桿菌及乳酸菌獨特的糖類發(fā)酵能力，探討益生菌發(fā)酵葡萄糖酸鈉母液的可行性。以期在獲得大量益生菌提高葡萄糖酸鈉母液附加值，為葡萄糖酸鈉母液再利用提供方向。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用葡萄糖酸鈉母液從山東福洋生物科技股份有限公司葡萄糖酸鈉母液存放池中直接獲得，深褐色，含白色沉淀。

A 培養(yǎng)液：葡萄糖酸鈉母液25 g、(NH4)2SO42 g、MgSO40.6 g、MnSO40.25 g、水1 000 ml，pH 值6.2～6.6，121 ℃高壓蒸汽滅菌。

B培養(yǎng)液：葡萄糖酸鈉母液25 g、酵母膏3 g、蛋白胨5 g、水1 000 ml，pH值6.8～7.0，121 ℃高壓蒸汽滅菌。

C 培 養(yǎng) 液：(NH4)2SO42 g、MgSO40.6 g、MnSO40.25 g、水1 000 ml，pH值6.2～6.6，滅菌后加入未滅菌葡萄糖酸鈉母液25 g。

0.5%溴甲酚紫：溴甲酚紫0.5 g、水100 ml，用時按照10%的量添加到培養(yǎng)液中滅菌。

釀酒酵母由酵母粉中分離獲得，乳桿菌由乳酸菌酸奶發(fā)酵劑中分離獲得。雙歧桿菌從雙歧桿菌酸奶發(fā)酵劑中分離獲得。

1.2 試驗方法

1.2.1 葡萄糖酸鈉母液培養(yǎng)液利用的初步測定

①分別配制含有溴甲酚紫的A、B、C 培養(yǎng)液，裝入50 ml螺口玻璃瓶中。121 ℃，滅菌20 min，滅菌后立即擰緊帶丁基橡膠塞的厭氧瓶蓋。

②分別按照10%的量接種釀酒酵母菌、乳酸菌、雙歧桿菌、混合菌雙菌1（bio-microbial inoculum，BM1，雙歧桿菌∶釀酒酵母=1∶1）和雙菌2（BM2，乳酸菌∶釀酒酵母=1∶1）。

③37 ℃，培養(yǎng)12～48 h，在丁基橡膠賽上插入一次性無菌注射器，收集產(chǎn)生的氣體，防止壓力過大，觀察變色、產(chǎn)氣和菌體生長情況。出現(xiàn)變色、產(chǎn)氣、鏡檢有菌體生長現(xiàn)象的均標記為陽性。

1.2.2 葡萄糖酸鈉母液滅菌溫度優(yōu)化

①配制含溴甲酚紫的A 培養(yǎng)液，分裝于螺口玻璃瓶中，121 ℃，滅菌20 min，做不長菌的陰性對照。

②取2.5 g/100 ml葡萄糖酸鈉母液，直接放無菌三角瓶底部，于恒溫水浴鍋及高壓滅菌鍋中按70、80、90 ℃處理1 min、115 ℃處理30 min、120 ℃處理15 min。

③將殺菌消毒后的葡萄糖酸鈉母液10 ml 與高壓蒸汽滅菌的A 液90 ml 在無菌條件下分別混合均勻，接入釀酒酵母菌、乳酸菌、雙歧桿菌、雙菌劑1 和雙菌劑2，37 ℃，培養(yǎng)24～48 h，觀察培養(yǎng)基是否變色、產(chǎn)氣，并鏡檢是否有菌生長。

1.2.3 生長曲線的測定

①挑取釀酒酵母、雙歧桿菌和乳酸菌分別接種于A 培養(yǎng)液中，搖床震蕩過夜培養(yǎng)，以獲得處于生長對數(shù)期的活化種子液。

②將活化好的釀酒酵母菌、乳酸菌、雙歧桿菌、雙菌劑1 和雙菌劑2 按10%的接種量接入A 培養(yǎng)液中，并置于37 ℃下培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；每隔4 h取樣，10倍梯度稀釋，并涂布平板。

③以培養(yǎng)時間（h）為橫坐標，各時間所對應的活菌濃度（CFU/ml）為縱坐標，繪制各菌的生長曲線并計算代時[8]。

式中：t1、t2——選取微生物進入指數(shù)生長期后，細胞數(shù)量增長最快的兩個時間點（h）；

x1、x2——t1、t2時間點分別對應的每毫升培養(yǎng)液中可培養(yǎng)的細胞數(shù)量（CFU/ml）。

2 結(jié)果

2.1 葡萄糖酸鈉母液培養(yǎng)液利用的初步測定

將釀酒酵母菌、雙歧桿菌、乳酸菌、雙菌劑1、雙菌劑2分別接種于121 ℃高壓蒸汽滅菌后的含溴甲酚紫的A、B 培養(yǎng)液和C 培養(yǎng)液中，于37 ℃下培養(yǎng)。顏色由紫色變成黃色，并產(chǎn)生氣體，鏡檢出現(xiàn)大量菌體的培養(yǎng)物均在表1標記為陽性。

表1 中可以看出，B 培養(yǎng)液按照5 種方式接菌后都出現(xiàn)產(chǎn)酸、產(chǎn)氣和菌體生長現(xiàn)象；A 培養(yǎng)液都沒有產(chǎn)酸產(chǎn)氣現(xiàn)象，鏡檢幾乎無菌體發(fā)現(xiàn)，延長培養(yǎng)時間，無變化；接菌的C培養(yǎng)液，產(chǎn)氣和產(chǎn)酸迅速，鏡檢后發(fā)現(xiàn)不僅接入的菌能夠生長，而且還有其他形狀的桿菌和酵母菌生長。

對比A、B 培養(yǎng)液培養(yǎng)結(jié)果得出，121 ℃高壓蒸汽滅菌的A 培養(yǎng)液中葡萄糖酸鈉母液的營養(yǎng)物質(zhì)、無機氮鹽和礦物質(zhì)不足以供試驗所用3 種益生菌單一或混合生長，可能需要提供生長因子或天然有機氮源才能生長。對比A、C 培養(yǎng)液培養(yǎng)結(jié)果得出，在(NH4)2SO4、MgSO4、MnSO4存在下，未經(jīng)加熱的葡萄糖酸鈉母液能夠供益生菌生長，而121 ℃滅菌后的則不能。需要對A 培養(yǎng)液的滅菌溫度進一步優(yōu)化。

2.2 葡萄糖酸鈉母液滅菌溫度優(yōu)化

鑒于121 ℃高壓蒸汽滅菌可能破壞了葡萄糖酸鈉母液中的生長因子成分，對葡萄糖酸鈉母液進行70、80、90 ℃巴氏殺菌和115、120 ℃滅菌，觀察釀酒酵母菌、雙歧桿菌、乳酸菌和雜菌生長，以確定較合適的滅菌溫度，進一步驗證葡萄糖酸鈉母液的生長作用。試驗結(jié)果見表2。

表1 各菌在葡萄糖酸鈉母液中的生長情況

表2 葡萄糖酸鈉母液不同滅菌溫度對微生物生長的影響

由表2 結(jié)果看出，用70～90 ℃的巴氏水浴消毒法加熱葡萄糖酸鈉母液后，釀酒酵母菌、雙歧桿菌、乳酸菌都能夠生長，但是鏡檢時發(fā)現(xiàn)大量形態(tài)差異大，運動能力強的桿菌，判斷是葡萄糖酸鈉母液中存在的極少量雜菌大量繁殖而來，巴氏消毒不能有效殺死這些雜菌。120 ℃滅菌能夠殺死雜菌，但是3 種益生菌卻不能生長。只有115 ℃滅菌時，雜菌得到有效控制，3種益生菌能夠正常生長。綜上，A培養(yǎng)液比B培養(yǎng)液更有利于生產(chǎn)上使用，引入物質(zhì)少，考慮效益，所以用A 培養(yǎng)液。C 培養(yǎng)液加入沒滅菌的葡萄糖酸鈉母液，出現(xiàn)染菌現(xiàn)象，不能使用。因此后續(xù)試驗采用115 ℃，30 min蒸汽滅菌A培養(yǎng)液進行生長曲線測定。

2.3 益生菌生長曲線測定

將10%體積的釀酒酵母菌、雙歧桿菌、乳酸菌、雙菌劑1、雙菌劑2分別接種到A培養(yǎng)液后，測定生長曲線。為方便比較雙菌劑中的釀酒酵母菌生長，釀酒酵母菌在37 ℃條件下培養(yǎng)。單菌培養(yǎng)曲線見圖1～圖3。

從圖1酵母菌的生長曲線看出，釀酒酵母在A培養(yǎng)液中生長4 h左右進入對數(shù)期；培養(yǎng)至12 h，釀酒酵母菌到達穩(wěn)定期，最高濃度為7.5×107CFU/ml。37 ℃培養(yǎng)時，釀酒酵母菌在A培養(yǎng)液中的代時約為1.50 h。

從圖2雙歧桿菌的生長曲線數(shù)據(jù)得出，雙歧桿菌在37 ℃培養(yǎng)條件下，16 h時進入對數(shù)期；培養(yǎng)32 h達到穩(wěn)定期，雙歧桿菌活菌最高含量達到4.5×109CFU/ml。在A培養(yǎng)液，37 ℃培養(yǎng)，雙歧桿菌生長代時為1.36 h。

圖1 釀酒酵母菌在A培養(yǎng)液中的生長曲線

圖2 雙歧桿菌在A培養(yǎng)液中的生長曲線

圖3 乳酸菌在A培養(yǎng)液中的生長曲線

乳酸菌單菌培養(yǎng)生長曲線見圖3。在A 培養(yǎng)液中，37 ℃條件下，乳酸菌培養(yǎng)8 h進入對數(shù)期，12 h達到穩(wěn)定期。乳酸菌濃度最高達到5.7×109CFU/ml，由計算得出，在A液培養(yǎng)液中，37 ℃條件下，乳酸菌生長代時為0.81 h。

釀酒酵母菌和其他菌在進行雙菌培養(yǎng)時，有可能起到促進作用也有可能起到抑制作用[9]。本試驗將雙歧桿菌、乳酸桿菌分別和釀酒酵母菌混合，等體積制成雙菌劑，接入A 培養(yǎng)液中培養(yǎng)，繪制各自生長曲線。

圖4 BM1在A培養(yǎng)液中的生長曲線

圖5 BM2在A培養(yǎng)液中的生長曲線

雙歧桿菌和釀酒酵母菌混合接種到葡萄糖酸鈉母液后，37 ℃培養(yǎng)，定時取樣繪制生長曲線見圖4。

從圖4 中可以看出，37 ℃培養(yǎng)條件下，雙歧桿菌和釀酒酵母菌兩種菌混合培養(yǎng)比各自單獨培養(yǎng)的生長曲線表現(xiàn)為適應期延長，穩(wěn)定期拖后?；旌吓囵B(yǎng)時，雙歧桿菌最高濃度達到1.8×108CFU/ml，代時為1.80 h；釀酒酵母菌最高濃度達到3.5×107CFU/ml，代時為2.10 h。雙歧桿菌和釀酒酵母菌都比單獨培養(yǎng)時濃度降低（4.3×109CFU/ml 和4.0×107CFU/ml），代時延長（0.44 h和0.60 h）。

乳酸菌與釀酒酵母菌等量混合后的菌液在A 培養(yǎng)液中的生長曲線見圖5。

對比乳酸菌與釀酒酵母菌兩種菌單獨培養(yǎng)的生長曲線菌和混合培養(yǎng)生長曲線，可以看出混合后兩種菌同樣表現(xiàn)為適應期延長，穩(wěn)定期拖后，濃度明顯低于各自單獨培養(yǎng)。乳酸菌與釀酒酵母混合培養(yǎng)時，乳酸菌最高濃度達到5.6×109CFU/ml，代時為1.42 h；釀酒酵母菌最高濃度達到3.8×107CFU/ml，代時為2.52 h，均比單獨培養(yǎng)時濃度降低（0.1×109CFU/ml 和3.7×107CFU/ml），代時延長（0.61 h和1.02 h）。

3 討論

3.1 葡萄糖酸鈉母液培養(yǎng)液利用的初步測定

本試驗所用葡萄糖酸鈉母液，是以玉米淀粉為原料酶法生產(chǎn)葡萄糖酸鈉提取產(chǎn)物后剩余的褐色液體。該液體經(jīng)前期測定得出，固體含量50%，葡萄糖酸鈉25%，總糖22%，其中單糖2%，麥芽糖5%，雙糖和多糖15%左右，含有較多異糖，與其他方法生產(chǎn)葡萄糖酸鈉殘?zhí)欠治鲇邢嗨浦嶽1]。葡萄糖酸鈉母液中碳源含量較高，因此在試驗中將其作為碳源利用。由于玉米本身營養(yǎng)豐富，玉米淀粉的生產(chǎn)過程中不可避免地要帶入其他營養(yǎng)物質(zhì)，酶法生產(chǎn)葡萄糖酸鈉過程結(jié)束后，這些營養(yǎng)物質(zhì)將被保留在剩余的溶液中，因此在將葡萄糖酸鈉母液作為碳源使用時，還需要考慮其它營養(yǎng)物質(zhì)對微生物生長是否有影響。

釀酒酵母菌、雙歧桿菌和乳酸菌這3種益生菌具有利用葡萄糖、半乳糖等單糖和一些低聚糖的特性，能在只有生長因子、碳源、銨鹽和礦物質(zhì)元素的簡單培養(yǎng)基上生長，是利用葡萄糖酸鈉母液的理想菌株。121 ℃高壓滅菌后，葡萄糖酸鈉母液加入酵母粉和蛋白胨后可以使本試驗的3種益生菌生長，推斷出葡萄糖酸鈉母液可以作為碳源。121 ℃高壓滅菌后，葡萄糖酸鈉母液加入無機鹽不能使3種益生菌生長，而未滅菌葡萄糖酸鈉母液加入無機鹽能夠使3 種益生菌單獨生長或混合生長，同時伴有雜菌生長。此處試驗不能排除是雜菌在生長過程中提供了某些物質(zhì)供給接入益生菌生長，需要進一步證實，但更有可能葡萄糖酸鈉母液不僅僅是提供微生物生長所需碳源，其中可能存在某些生長因子，為接入菌株正常生長代謝所必需，121 ℃高壓蒸汽滅菌破壞了葡萄糖酸鈉母液中的生長因子成分，造成接入的菌株不能生長。

3.2 葡萄糖酸鈉母液滅菌溫度優(yōu)化

從巴氏消毒和高溫蒸汽滅菌的結(jié)果可以得出，葡萄糖酸鈉母液不僅僅提供微生物生長所需碳源，其中存在某些生長因子不能耐受121 ℃高壓蒸汽滅菌。低溫殺菌雖然可以最大程度保留其營養(yǎng)成分，特別是生長因子不受損壞，但不能有效排除雜菌干擾試驗。115 ℃，30 min 蒸汽滅菌可以在殺滅其中雜菌的基礎上，仍然使葡萄糖酸鈉母液營養(yǎng)成分不被破壞，供給釀酒酵母菌、雙歧桿菌、乳酸菌益生菌的生長。對于葡萄糖酸鈉母液無機鹽培養(yǎng)基來說115 ℃，30 min是最適合的滅菌溫度。

3.3 益生菌生長曲線測定

本試驗中兩種菌的混合培養(yǎng)比單獨培養(yǎng)時，生長代時有所延長，總生長量有所下降，釀酒酵母菌并沒有為雙歧桿菌和乳酸菌生長提供額外營養(yǎng)物質(zhì)，甚至相互抑制。這可能與兩種菌共同生長時競爭營養(yǎng)物質(zhì)和釋放抑制產(chǎn)物有關[10-11]。

培養(yǎng)液不同，培養(yǎng)條件不同都會導致同一菌的代時和菌體生長量的差異。有報道乳酸菌與釀酒酵母菌混合培養(yǎng)試驗中，乳酸菌濃度達到2.8×108CFU/ml[9]；糞腸球菌和釀酒酵母混合培養(yǎng)時，兩者濃度分別達到3.8×108CFU/ml 和2.4×108CFU/ml[12]，相比較本試驗雙菌培養(yǎng)中，乳酸菌濃度可達到5.6×109CFU/ml，相對較高；釀酒酵母菌濃度可達到3.8×107CFU/ml，濃度略低。由于釀酒酵母菌是優(yōu)質(zhì)單細胞蛋白，其生長能提高發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)含量，增加發(fā)酵產(chǎn)物作為飼料的營養(yǎng)價值，因此作為飼料用途，將釀酒酵母菌與其它益生菌混合培養(yǎng)仍具有一定優(yōu)勢。經(jīng)過上述益生菌發(fā)酵后，溶液中仍然存在部分葡萄糖酸鈉，已有研究表明葡萄糖酸鈉可提高肉雞的生長性能，降低料肉比，提高飼料效率，同時改善腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)[7]。因此本試驗獲得的益生菌發(fā)酵液，具有較高的飼料應用價值。

4 結(jié)論

本試驗利用葡萄糖酸鈉母液總糖含量較高兼有生長因子的特點，將其作為營養(yǎng)物質(zhì)，配制含無機鹽的培養(yǎng)液，用釀酒酵母菌、雙歧桿菌、乳酸菌進行發(fā)酵。試驗表明葡萄糖酸鈉母液25 g、(NH4)2SO42 g、MgSO40.6 g、MnSO40.25 g、水1 000 ml、pH值6.2～6.6，115 ℃，滅菌30 min，釀酒酵母菌（7.5×107CFU/ml）、雙歧桿菌（4.5×109CFU/ml）、乳酸菌（5.7×109CFU/ml）都能較好的生長；微生物混合培養(yǎng)濃度雖然不如單菌培養(yǎng)，但是作為飼料仍然具有較高的應用價值。

通過添加少量無機鹽的方式讓釀酒酵母菌、雙歧桿菌、乳酸菌三種益生菌利用葡萄糖酸鈉母液發(fā)酵，成本不高，但提高葡萄糖酸鈉母液作為飼料的營養(yǎng)價值，增加了附加值。本試驗為葡萄糖酸鈉母液再利用提供一個高效、低成本的參考方法。