■祝新茗 趙 靜 夏長(zhǎng)革 李沐陽(yáng) 劉洪健 王桂芹*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物生產(chǎn)與質(zhì)量安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)教育部國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春130118；3.吉林省長(zhǎng)春市新立城水庫(kù)管理局，吉林長(zhǎng)春130119；4.吉林省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，吉林長(zhǎng)春130012）

烏鱧(Channa argus)是我國(guó)重要的淡水經(jīng)濟(jì)魚類[1]。在集約化養(yǎng)殖環(huán)境下，烏鱧對(duì)各種病原體的易感性增加[2]，導(dǎo)致流行魚病多發(fā)，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。為使死亡率降低，抗生素及免疫增強(qiáng)劑已用于預(yù)防或治療養(yǎng)殖魚類疾病[3]。然而，使用抗生素作為預(yù)防措施，除了會(huì)影響魚類產(chǎn)品的安全性外，還會(huì)造成環(huán)境污染且會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥菌群[4]。免疫增強(qiáng)劑可以增強(qiáng)魚類的疾病抵抗能力，促進(jìn)魚類固有免疫功能，增強(qiáng)魚類適應(yīng)性免疫能力[5]。因此，開發(fā)綠色經(jīng)濟(jì)的免疫增強(qiáng)劑，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)健康發(fā)展具有重要意義。目前廣泛應(yīng)用的免疫增強(qiáng)劑包括益生菌[6]、維生素E[7]、大黃素[8]、殼聚糖[9]、蝦青素[10]、多糖[11]和黃酮[12]等，在這些免疫增強(qiáng)劑中，植物提取物具有來源廣泛、生物可降解、無耐藥性、性價(jià)比高、環(huán)境友好等諸多優(yōu)點(diǎn)[11]。

沙蔥（Allium mongolicum Regel），百合科（Lilia?ceae Juss），蔥屬（Alliaceae）[13]。生長(zhǎng)于高海拔沙漠地區(qū)和荒漠草原，風(fēng)味獨(dú)特，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，富含脂肪、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、多糖、黃酮等多種營(yíng)養(yǎng)成分[14]。作為一種野生蔬菜，沙蔥及其提取物在促生長(zhǎng)[14]、抗氧化[13]以及抗炎[15]等方面具有一定作用。黃酮類化合物是天然藥物中重要的活性成分，在機(jī)體抗氧化、抗炎、抗病毒、抗癌等方面效果較為顯著。目前許多植物黃酮已被用作免疫增強(qiáng)劑來提高機(jī)體抗氧化、抗炎能力，促進(jìn)機(jī)體免疫應(yīng)答，其中大豆異黃酮、淫羊藿黃酮、芒果葉黃酮、山核桃葉黃酮、棗葉黃酮等在水產(chǎn)動(dòng)物上已有研究。研究表明，大豆異黃酮可以加快魚類生長(zhǎng)，提高免疫、抗氧化及抗病能力[16]。棗葉黃酮在斑馬魚體內(nèi)有良好的抗氧化能力，且對(duì)其體內(nèi)自由基具有良好的清除作用[17]。山核桃葉黃酮可以抑制斑馬魚體內(nèi)凋亡基因的異常表達(dá)，降低活性氧（ROS）水平[18]。沙蔥黃酮可以提高綿羊外周血淋巴細(xì)胞增殖率[15]，加速肉羊生長(zhǎng)，促進(jìn)其生長(zhǎng)相關(guān)激素分泌[14]。

淋巴細(xì)胞（Lymphocyte）是機(jī)體淋巴器官產(chǎn)生的白細(xì)胞，參與機(jī)體特異性免疫反應(yīng)，在機(jī)體免疫應(yīng)答中起主要作用。而魚類淋巴細(xì)胞是數(shù)量最多的一類白細(xì)胞，是魚類免疫學(xué)研究的重要內(nèi)容[19]。本研究旨在研究沙蔥黃酮對(duì)烏鱧血淋巴細(xì)胞活性、抗氧化能力及炎癥相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量的影響。

1 材料與方法

1.1 沙蔥黃酮的制備

本試驗(yàn)采用超聲提取法提取所需沙蔥黃酮[14]，提取時(shí)間為15 min，溫度40 ℃，所用乙醇濃度為75%，料液比1∶30。預(yù)計(jì)黃酮產(chǎn)量為12.85 mg/g 沙蔥粉。使用二甲基亞砜（DMSO）作為溶劑，將沙蔥黃酮配制為不同濃度的儲(chǔ)存液，使用前用RPMI-1640培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋。

1.2 試驗(yàn)魚的飼養(yǎng)

試驗(yàn)所用烏鱧[（體質(zhì)量（50±0.12）g/尾]購(gòu)自遼寧劉二堡漁場(chǎng)，暫養(yǎng)于室內(nèi)200 L水族箱中，馴化15 d，試驗(yàn)溫度(26±2) ℃；pH值(7.1±0.1)；氨氮含量＜0.02 mg/l；亞硝酸鹽含量＜0.05 mg/l，溶解氧＞5.0 mg/l，每日飽食投喂兩次（8:00、16:00），每2 d更換半箱水。取樣前停食24 h，使用MS-222（200 mg/l）進(jìn)行麻醉，隨機(jī)抽取5尾魚，通過尾靜脈穿刺取血，而后立即轉(zhuǎn)移到無菌封頂預(yù)冷（4 ℃）抗凝管（氯化鈉415 mmol/l、檸檬酸鈉30 mmol/l、葡萄糖100 mmol/l、檸檬酸26 mmol/l、乙二胺四乙酸30 mmol/l，pH值4.6）中。

1.3 烏鱧血淋巴細(xì)胞的分離培養(yǎng)

烏鱧血淋巴細(xì)胞的分離參照謝昆等[20]的方法。將抽取的血液與磷酸緩沖鹽溶液（PBS）以1∶2 比例混合稀釋，將稀釋后的血液平鋪在淋巴細(xì)胞分離劑（北京索萊寶科技有限公司）表面，600×g離心20 min，小心吸取淋巴細(xì)胞層，加入等量的RPMI-1640 液，600×g離心20 min；棄掉上清液，以上述方法離心2次，棄上清液，獲得細(xì)胞沉淀，通過血細(xì)胞計(jì)數(shù)器測(cè)定細(xì)胞數(shù)。將細(xì)胞放入含有20%胎牛血清（Gibco）和1%青霉素（北京索萊寶科技有限公司）的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)前測(cè)定培養(yǎng)基中活細(xì)胞數(shù)量（臺(tái)盼藍(lán)染色法），調(diào)整至活細(xì)胞密度為1×106個(gè)/ml。

在細(xì)胞懸液中加1%的沙蔥黃酮稀釋液，調(diào)整沙蔥黃酮濃度分別為0（對(duì)照）、25、50、100、200 μg/ml，將調(diào)整好的細(xì)胞懸液加入96 孔板中，每孔加入3 ml細(xì)胞懸液，每組5個(gè)重復(fù)。置于27 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后198×g 離心5 min。收集細(xì)胞液氮速凍后在-80 ℃下儲(chǔ)存以測(cè)量抗氧化參數(shù)及相對(duì)基因表達(dá)。

1.4 烏鱧血淋巴細(xì)胞活性測(cè)定

采用MTT 法對(duì)烏鱧血淋巴細(xì)胞活性進(jìn)行測(cè)定，對(duì)照組和添加組每孔分別抽取100 μl細(xì)胞液轉(zhuǎn)入96孔U 型細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入10 μg/l Con A 100 μl，在27 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)至20 h 時(shí)，每孔加入5 mg/ml 噻唑藍(lán)（MTT）20 μl，再放入培養(yǎng)箱中孵育4 h，培養(yǎng)結(jié)束后600×g離心10 min，棄上清液，每孔加入100 μl 二甲基亞砜，震蕩10 min，570 nm 處測(cè)定各孔吸光度值。

1.5 抗氧化指標(biāo)測(cè)定

總超氧化物歧化酶（T-SOD）、過氧化氫酶（CAT）、總抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）等抗氧化指標(biāo)的測(cè)定嚴(yán)格按照南京建成生物工程研究所提供試劑盒說明進(jìn)行操作。

1.6 熒光定量PCR測(cè)定

收集每組培養(yǎng)基中懸浮細(xì)胞，采用TRIzol試劑盒法（大連Takara 公司）提取總RNA，使用NanoDrop 2000 分光光度法（Thermo scientific，USA）分析RNA濃度及質(zhì)量，按照TRIzol 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒法（大連Ta?kara 公司）法將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以β-actin 為內(nèi)參基因，使用Takara Premix Ex TaqTM П熒光定量試劑盒進(jìn)行測(cè)定，引物序列見表1。PCR 反應(yīng)體系 包 括SYBR qPCR Mix（10 μl），上游和下游引物（10 mmol/l，1 μl），cDNA（1 μl），ddH2O（7 μl）。PCR 反應(yīng)條件為預(yù)變性（95 ℃、30 s）；40 個(gè)循環(huán)（95 ℃、5 s；60 ℃、30 s）。

表1 引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)所得Ct 值采用2?ΔΔCt法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。試驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用Tukey 多重比較分析組間差異顯著性，若P＜0.05 則表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 沙蔥黃酮對(duì)烏鱧血淋巴細(xì)胞活性的影響(見表2)

表2 沙蔥黃酮對(duì)烏鱧血淋巴細(xì)胞活性的影響

如表2 所示，與對(duì)照組相比，隨著沙蔥黃酮濃度的增加，烏鱧血淋巴細(xì)胞活性呈先上升后下降的趨勢(shì)。培養(yǎng)24 h后，各添加組血淋巴細(xì)胞活性均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），其中100 μg/ml 處理組血淋巴細(xì)胞活性最高。

2.2 沙蔥黃酮對(duì)烏鱧血淋巴細(xì)胞抗氧化能力的影響(見表3)

由表3 可知，隨著沙蔥黃酮?jiǎng)┝康脑黾?，烏鱧血淋巴細(xì)胞T-AOC、NO、CAT、T-SOD及GSH-Px水平都呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，MDA 含量呈現(xiàn)與之相反的趨勢(shì)。50、100、200 μg/ml 添加組T-AOC、NO 水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），其余添加組與對(duì)照組無顯著差異（P＞0.05）；100、200 μg/ml 添加組CAT 水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），其余添加組CAT水平與對(duì)照組無顯著差異（P＞0.05）；所有添加組T-SOD、GSH-Px水平均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；100 μg/ml 添加組MDA 含量顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），其余添加組MDA水平低于對(duì)照組，但差異不顯著（P＞0.05）。

表3 沙蔥黃酮對(duì)烏鱧血淋巴細(xì)胞抗氧化指標(biāo)的影響

2.3 沙蔥黃酮對(duì)烏鱧血淋巴細(xì)胞基因相對(duì)表達(dá)量的影響(見表4)

如表4 可知，沙蔥黃酮促進(jìn)烏鱧血淋巴細(xì)胞HSP70、HSP90、IκBα、GR 基因的表達(dá)，抑制IL-1、TNF-α、IL-8、NF-κB p65 基因的表達(dá)。隨著沙蔥黃酮濃度的升高，HSP70、HSP90、IκBα、GR 相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，IL-1、IL-8、TNFα、NF-κB p65 的相對(duì)表達(dá)量則呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)。100 μg/ml 添加組IL-1、TNF-α相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）；50、100、200 μg/ml 添加組NF-κB p65 相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）；所有添加組IL-8 相對(duì)表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。50、100、200 μg/ml 添加組GR 相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；100 μg/ml 添加組HSP70、HSP90、IκBα相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。

表4 沙蔥黃酮對(duì)烏鱧血淋巴細(xì)胞基因相對(duì)表達(dá)量的影響

3 討論

3.1 沙蔥黃酮對(duì)烏鱧血淋巴細(xì)胞活性的影響

淋巴細(xì)胞是一種重要的白細(xì)胞，其細(xì)胞活性的高低可以在一定程度上反映機(jī)體的免疫水平。研究表明香菇多糖、靈芝多糖、枸杞多糖可有效提高黃顙魚免疫細(xì)胞活性[21-23]；金蕎麥根提取物可提高雞脾淋巴細(xì)胞活性[24]；滸苔多糖能使小鼠淋巴細(xì)胞活性提高[25]；苜蓿多糖可促進(jìn)小鼠淋巴細(xì)胞增殖[26]；沙蔥黃酮能夠促進(jìn)肉羊外周血淋巴細(xì)胞增殖[15]等。與上述研究結(jié)果相似，本試驗(yàn)中100 μg/ml 沙蔥黃酮添加組烏鱧血淋巴細(xì)胞活性最強(qiáng)，其余各組均顯著高于對(duì)照組。

3.2 沙蔥黃酮對(duì)烏鱧血淋巴細(xì)胞抗氧化能力的影響

抗氧化是抗氧化自由基的簡(jiǎn)稱，機(jī)體受到外界刺激，體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的自由基，過量的自由基會(huì)使細(xì)胞代謝紊亂，從而威脅養(yǎng)殖動(dòng)物的健康。T-SOD、CAT、T-AOC、GSH-Px 是抗氧化系統(tǒng)中的最主要的酶，能夠有效清除自由基；NO是由一氧化氮合酶催化精氨酸產(chǎn)生的氣體信號(hào)分子，具有廣譜殺菌性，一定程度的NO 可以反映機(jī)體固有免疫情況。MDA 是體內(nèi)脂質(zhì)過氧化物，過量產(chǎn)生會(huì)破壞細(xì)胞膜完整性被破壞、使細(xì)胞發(fā)生突變、對(duì)抗氧化防御系統(tǒng)造成損傷。有報(bào)道稱，黃芪多糖可以提高雜交鱧抗氧化能力[27]；大豆異黃酮可以使大鼠體內(nèi)抗氧化能力得到提高[28]；蘆葦黃酮類提取物可以增強(qiáng)大鼠血清中GSH-Px、SOD活性，降低MDA含量[29]；沙蔥黃酮可以降低山羊紅細(xì)胞中MDA含量，提高T-SOD、CAT、GSH-Px水平[30]，也可以使小鼠血清和肝臟中抗氧化酶類的含量和活性升高，MDA 含量下降[31]。本試驗(yàn)結(jié)果表示，在一定劑量范圍內(nèi)，沙蔥黃酮可以提高烏鱧血淋巴細(xì)胞中T-AOC、T-SOD、CAT、GSH-Px 以及NO 的水平，抑制MDA的生成，提高細(xì)胞抗氧化活性，這與以上報(bào)道所得結(jié)論一致。

3.3 沙蔥黃酮對(duì)烏鱧血淋巴細(xì)胞基因相對(duì)表達(dá)量的影響

NF-κB是主要的促炎轉(zhuǎn)錄因子，它可被炎性細(xì)胞因子、氧化應(yīng)激物、病毒和細(xì)菌產(chǎn)物等多種細(xì)胞外信號(hào)激活[32]。IL-1、IL-8 和TNF-α是有效的促炎因子，通過調(diào)節(jié)其他細(xì)胞因子的表達(dá)進(jìn)而誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。GR 是核激素受體轉(zhuǎn)錄因子[33]。GR 可與NF-κB 信號(hào)通路相互作用共同影響炎癥基因的表達(dá)水平[34]。熱休克蛋白（HSP）是一類伴侶蛋白，包括HSP70 和HSP90，在GR 蛋白復(fù)合物形成過程中起重要作用[35]。研究表明，可可黃酮會(huì)下調(diào)NF-κB信號(hào)通路中炎癥因子的表達(dá)[36]；韓國(guó)薊馬齒黃酮具有良好的抗炎作用[37]；中草藥提取物可以上調(diào)團(tuán)頭魴體內(nèi)HSP70 的表達(dá)水平[38]。蒲黃總黃酮能使Ⅱ型糖尿病大鼠血漿IL-6 水平降低[39]。穗花杉雙黃酮可減少急性肝損傷大鼠體內(nèi)炎癥細(xì)胞因子的釋放[40]。染料木黃酮可抑制脂肪細(xì)胞NF-κB 通路的激活[41]。藍(lán)莓葉總黃酮通過影響炎癥相關(guān)因子表達(dá)，從而減輕炎癥反應(yīng)[42]。Chen等[43]研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加谷氨酰胺可以顯著提高鯉魚幼魚GR 表達(dá)及HSP70 水平。本試驗(yàn)結(jié)果表明，不同濃度沙蔥黃酮可提高烏鱧血淋巴細(xì)胞HSP70、HSP90、GR、IκBα基因的表達(dá)，抑制IL-1、IL-8、TNF-α、NFκB p65 基因的表達(dá)，這與上述研究結(jié)果基本一致，這證明沙蔥黃酮可以調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答以及免疫相關(guān)基因的表達(dá)。

4 結(jié)論

綜上所述，100～200 μg/ml 沙蔥黃酮在一定程度上能夠有效提高烏鱧血淋巴細(xì)胞活性、抗氧化能力、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答以及免疫相關(guān)基因的表達(dá)。