謝金芳，孟 琳，高華麗，李雪洋，胡 雪，張穎麗，尹 碩

(1.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院綜合口腔治療科， 吉林 長(zhǎng)春 130021； 2. 吉林大學(xué)口腔醫(yī)院病理科， 吉林 長(zhǎng)春 130021；3. 吉林大學(xué)口腔醫(yī)院牙體牙髓科， 吉林 長(zhǎng)春 130021；4.吉林省長(zhǎng)春市口腔醫(yī)院修復(fù)科， 吉林 長(zhǎng)春 130022)

牙本質(zhì)與牙髓一起構(gòu)成牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體，在保護(hù)和滋養(yǎng)整個(gè)牙齒方面起著至關(guān)重要的作用。牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體的活力極大地影響牙齒的存活和預(yù)后[1-2]。一方面，完整的牙本質(zhì)為牙髓提供了相對(duì)封閉的環(huán)境，保護(hù)牙髓免受細(xì)菌侵入和其他物理或化學(xué)刺激。當(dāng)牙本質(zhì)受損時(shí)，刺激物可通過(guò)牙本質(zhì)小管或暴露的牙髓引發(fā)牙髓炎癥。另一方面，牙髓可通過(guò)成牙本質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞突提供氧氣、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及牙本質(zhì)液來(lái)維持牙本質(zhì)的活力，以保持其礦化程度。齲病、創(chuàng)傷和醫(yī)源性損傷均可使牙本質(zhì)損傷甚至牙髓暴露，導(dǎo)致牙齒支撐力降低、牙髓炎、牙髓壞死，最終可能導(dǎo)致牙齒折裂甚至牙齒脫落[3]。因此，在牙髓暴露的處理中，牙本質(zhì)再生和牙髓活力保持尤為關(guān)鍵[4]。

Matrilin-4是非膠原性細(xì)胞外基質(zhì)蛋白家族的一員。研究[5]顯示：Matrilin-4在健康牙髓組織成牙本質(zhì)細(xì)胞層呈陽(yáng)性表達(dá)，而在深齲牙髓組織中，在齲損下方的成牙本質(zhì)細(xì)胞層及相鄰牙髓細(xì)胞中可見(jiàn)其陽(yáng)性表達(dá)。推測(cè)Matrilin-4可能是牙髓干細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的標(biāo)志，可能與修復(fù)性牙本質(zhì)的形成有關(guān)[6-7]，但將Matrilin-4作為蓋髓劑應(yīng)用于大鼠牙齒的治療尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)構(gòu)建大鼠牙髓機(jī)械性損傷的模型，將Matrilin-4作為蓋髓劑置于牙髓暴露斷面，以牙本質(zhì)涎蛋白(dentin sialoprotein,DSP)作為修復(fù)性牙本質(zhì)形成的特異性標(biāo)志物[8],觀察Matrilin-4蓋髓后成牙本質(zhì)細(xì)胞中DSP的表達(dá)情況,探討Matrilin-4在修復(fù)性牙本質(zhì)形成過(guò)程中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器 8周齡清潔級(jí)雄性Wistar大鼠28只，體質(zhì)量180～220 g，吉林大學(xué)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(吉)2015-0001。水合氯醛、EDTA溶液、4%多聚甲醛和生理鹽水(北京恒業(yè)中遠(yuǎn)化工有限公司)，DSP多克隆抗體(英國(guó)Biorbyt公司)，EDTA抗原修復(fù)液、兔S-P試劑盒和DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物科技有限公司)。膠原蛋白海綿(吉林大學(xué)口腔頜面外科提供)，富士Ⅸ玻璃離子(吉林大學(xué)口腔醫(yī)院提供)，Matrilin-4(美國(guó)Sigma公司)。1/4 鎢鋼球鉆和高速渦輪機(jī)(上海醫(yī)用器械設(shè)備廠)，BX71顯微鏡和照相系統(tǒng)(日本OLYMPUS公司)，自制開口器。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和標(biāo)本制備 28只Wistar大鼠稱體質(zhì)量,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,用3%水合氯醛腹腔注射麻醉(3.5 mL·kg-1)，仰臥位，固定四肢于手術(shù)板上。2% 碘伏溶液消毒口腔，分別于每只大鼠雙側(cè)上頜第一磨牙用1/4球鉆在頜面中央備洞，透粉時(shí)停止操作，探針穿髓，生理鹽水沖洗。無(wú)菌棉球壓迫止血并干燥窩洞后,左側(cè)露髓處放置含Matrilin-4的膠原蛋白海綿(Matrilin-4組)，右側(cè)露髓處放置含PBS的膠原蛋白海綿蓋髓(PBS組)，雙側(cè)均用玻璃離子充填窩洞。以上所有操作均由同一名臨床經(jīng)驗(yàn)豐富的醫(yī)生獨(dú)立完成。分別于蓋髓術(shù)后 3、7、14和28 d心臟灌流固定處死大鼠各7只，迅速分離各大鼠的上頜骨并制備包含雙側(cè)上頜第一磨牙的骨組織塊。然后將各組骨組織塊置于新配置的4%多聚甲醛中,常溫固定48 h后置于100 g·L-1EDTA(pH值為7.4)溶液中脫鈣12周。梯度乙醇脫水、二甲苯透明、常規(guī)石蠟包埋后,平行于牙體長(zhǎng)軸方向行近、遠(yuǎn)中向連續(xù)切片(厚度為5 μm)。

1.3 HE 染色觀察大鼠牙髓組織形態(tài)表現(xiàn) 取上述各組大鼠牙體組織切片常規(guī)脫蠟至水,分別經(jīng)蘇木素染色10 min，流水沖洗；1%鹽酸乙醇分化1～3 s，流水沖洗；氨水返藍(lán)5～10 s，0.5%伊紅溶液染色5 min，流水沖洗 5 min；梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察各組大鼠修復(fù)性牙本質(zhì)的形成情況并采集圖像。

1.4 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)大鼠牙本質(zhì)細(xì)胞中DSP陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度 取上述各組大鼠組織切片脫蠟至水,用PBS洗滌并擦干組織周圍的多余水分后,微波抗原修復(fù)后自然冷卻30 min后流水沖洗冷卻至室溫，PBS緩沖液沖洗3 min×3次；滴加內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑室溫孵育10 min，PBS緩沖液沖洗3 min×3次;滴加封閉用正常山羊血清工作液，室溫孵育15 min，傾去血清,不洗；滴加稀釋的DSP抗體(1∶100), 4℃濕盒過(guò)夜;次日37℃復(fù)溫 45 min,PBS緩沖液沖洗3 min×3次；滴加生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG室溫孵育15 min，PBS緩沖液沖洗3 min×3次；滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液室溫孵育15min，PBS緩沖液沖洗3 min×3次；DAB顯色；蘇木素輕度復(fù)染3 min、流水沖洗、分化、返藍(lán)、梯度乙醇水化后、二甲苯透明、中性樹膠封片；顯微鏡下觀察DSP表達(dá)情況并拍照。在高倍鏡下從每張切片的DSP染色陽(yáng)性區(qū)各隨機(jī)選取3個(gè)不重疊區(qū)域,用Image-Pro Plus 6.0 軟件檢測(cè)其陽(yáng)性區(qū)的吸光度(A)值,取均值代表DSP陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠牙髓組織HE 染色結(jié)果 3 d時(shí)，PBS組大鼠穿髓孔下方有炎癥細(xì)胞聚集，并可見(jiàn)擴(kuò)張的血管，穿髓處散在分布牙本質(zhì)碎屑；Matrilin-4組大鼠牙體組織穿髓孔下方有少量炎癥細(xì)胞聚集,并可見(jiàn)明顯擴(kuò)張的血管，未見(jiàn)明顯的前期牙本質(zhì)形成。7 d時(shí)，PBS組大鼠穿髓孔下方炎癥反應(yīng)加重，大量炎癥細(xì)胞聚集并向髓腔方向浸潤(rùn)，可見(jiàn)少量前期牙本質(zhì)形成；Matrilin-4組大鼠穿髓孔下方炎癥反應(yīng)較3 d時(shí)加重，血管擴(kuò)張明顯，成牙本質(zhì)細(xì)胞層及牙本質(zhì)之間可見(jiàn)前期牙本質(zhì)。14 d時(shí)，PBS組大鼠穿髓孔下方炎癥細(xì)胞密集及纖維組織增生，可見(jiàn)前期牙本質(zhì)不均勻增厚而形成修復(fù)性牙本質(zhì)，但未封閉暴露的牙髓組織；Matrilin-4組大鼠穿髓孔下方可見(jiàn)較連續(xù)完整的修復(fù)性牙本質(zhì)橋形成，覆蓋露髓區(qū)域，但修復(fù)性牙本質(zhì)橋之間可見(jiàn)隧道缺陷，牙髓組織中無(wú)明顯炎細(xì)胞浸潤(rùn)。28 d時(shí)，PBS組大鼠穿髓孔下方可見(jiàn)一定量修復(fù)性牙本質(zhì)形成，髓室內(nèi)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)呈變性壞死表現(xiàn) ；Matrilin-4組大鼠穿髓孔下方連續(xù)完整的修復(fù)性牙本質(zhì)橋較14 d時(shí)增厚，牙本質(zhì)橋下面有重組的成牙本質(zhì)細(xì)胞層，無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，牙髓形態(tài)正常。見(jiàn)圖1(插頁(yè)五)。

A-D: PBS group； E-H: Matrilin-4 group; A,E: 3 d; B,F: 7 d; C,G: 14 d; D,H: 28 d.
圖1 不同時(shí)間各組大鼠牙髓組織形態(tài)表現(xiàn)(HE，×200)
Fig.1 Morphology of pulp tissue of rats in various groups at different time(HE，×200)

2.2 各組大鼠成牙本質(zhì)細(xì)胞中DSP陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度 3 d時(shí)，PBS組大鼠穿髓孔下方的成牙本質(zhì)細(xì)胞無(wú)明顯DSP陽(yáng)性表達(dá)；Matrilin-4組大鼠穿髓孔下方的成牙本質(zhì)細(xì)胞DSP呈弱陽(yáng)性表達(dá)。7 d時(shí)，PBS組大鼠穿髓孔下方的成牙本質(zhì)細(xì)胞DSP呈弱陽(yáng)性表達(dá)；Matrilin-4組大鼠穿髓孔下方的成牙本質(zhì)細(xì)胞DSP呈陽(yáng)性表達(dá)，強(qiáng)度高于3 d時(shí)。14 d時(shí)，PBS組大鼠穿髓孔下方的成牙本質(zhì)細(xì)胞DSP呈陽(yáng)性表達(dá),但其強(qiáng)度較同時(shí)段Matrilin-4組弱；Matrilin-4組大鼠穿髓孔下方的成牙本質(zhì)細(xì)胞DSP呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，此時(shí)陽(yáng)性表達(dá)達(dá)高峰。28 d時(shí)，PBS組大鼠穿髓孔下方的成牙本質(zhì)細(xì)胞DSP呈弱陽(yáng)性表達(dá)，其強(qiáng)度較同時(shí)段Matrilin-4組弱；Matrilin-4組大鼠穿髓孔下方的成牙本質(zhì)細(xì)胞DSP呈弱陽(yáng)性表達(dá)。見(jiàn)圖2(插頁(yè)五)。

A-D: PBS group ；E-H: Matrilin-4 group; A,E: 3 d; B,F: 7 d; C,G: 14 d; D,H: 28 d.
圖2 不同時(shí)間各組大鼠成牙本質(zhì)細(xì)胞中DSP表達(dá)情況(免疫組織化學(xué)， ×200)
Fig.2 Expressions of DSP in odontoblasts of rats in various groups at different time(Immunohistochemistry,×200)

與PBS組比較, 實(shí)驗(yàn) 3、7和14 d時(shí)Matrilin-4組大鼠牙髓組織中DSP陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度明顯升高(P<0.01)，28 d 時(shí)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

3 討 論

牙髓作為牙組織中唯一的軟組織，具有形成、營(yíng)養(yǎng)、感覺(jué)和防御功能，其對(duì)維持牙體組織的強(qiáng)度發(fā)揮重要的作用。外傷性或機(jī)械性刺激等均可造成牙髓暴露，不能及時(shí)有效的治療終將導(dǎo)致牙髓感染、壞死甚至根尖周炎等不可逆性損傷。一旦牙髓壞死，牙本質(zhì)就無(wú)法獲得供應(yīng)并逐漸變脆，從而導(dǎo)

表1 不同時(shí)間各組大鼠成牙本質(zhì)細(xì)胞中DSP陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度Tab.1 Positive expression strengths of DSP in odontoblasts in two groups at different time

*P<0.01 compared with PBS group.

致牙齒折裂或牙冠變色[9]。尤其對(duì)根尖未發(fā)育完成的年輕恒牙，保存其牙髓活性可促進(jìn)牙根繼續(xù)發(fā)育及生理性牙本質(zhì)的形成[10]。直接蓋髓術(shù)作為牙髓暴露的重要治療方法，需要對(duì)暴露的牙髓組織充分保護(hù)而不損傷其活力和功能[11-12]，并刺激牙髓細(xì)胞分化為成牙本質(zhì)樣細(xì)胞，促進(jìn)受損的牙髓愈合及形成修復(fù)性牙本質(zhì)[13]。氫氧化鈣作為最常用的蓋髓劑，可成功誘導(dǎo)硬組織屏障和反應(yīng)性牙本質(zhì)形成[4]，但其修復(fù)性牙本質(zhì)橋可出現(xiàn)明顯的隧道缺陷，滲透性差，易受細(xì)菌重新定植，最終可能導(dǎo)致牙髓治療失敗[14]。三氧化鈣無(wú)機(jī)聚合物(mineral trioxide aggregate, MTA)因其良好的封閉性及生物性能成為近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于活髓保存治療中[15]，但其臨床操作較困難且治療后引起牙冠變色[16-20]。有研究[21]表明：MTA因釋放較高濃度有害金屬離子，具有潛在細(xì)胞毒性。Marilin-4廣泛分布于疏松和致密結(jié)締組織、皮膚、消化道上皮組織、骨、軟骨、血管壁和神經(jīng)系統(tǒng)[7]，新生小鼠切牙始基、人牙髓細(xì)胞和深齲成牙本質(zhì)細(xì)胞中也存在Matrilin-4的表達(dá)[8]。推測(cè)Marilin-4可能與牙本質(zhì)形成有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)將Marilin-4作為蓋髓劑用于大鼠機(jī)械性牙髓損傷的治療,并以 PBS作為對(duì)照,觀察Marilin-4及PBS蓋髓后牙髓組織的炎癥反應(yīng)、修復(fù)性牙本質(zhì)的形成及成牙本質(zhì)細(xì)胞中DSP的表達(dá)情況,以探討Marilin-4作為新型蓋髓劑的可行性。本研究中HE染色結(jié)果顯示:3 d時(shí)PBS組大鼠穿髓孔下方有炎癥細(xì)胞聚集及擴(kuò)張的血管，7 d時(shí)穿髓孔下方炎癥反應(yīng)加重且向髓腔方向浸潤(rùn),可見(jiàn)少量前期牙本質(zhì)形成，14 d時(shí)可見(jiàn)修復(fù)性牙本質(zhì)的形成，28 d時(shí)雖有一定量修復(fù)性牙本質(zhì)形成，但髓室內(nèi)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)呈變性壞死表現(xiàn)；Matrilin-4組大鼠3 d時(shí)穿髓孔下方有少量炎癥細(xì)胞聚集,并可見(jiàn)明顯擴(kuò)張的血管，14 d時(shí)穿髓孔下方可見(jiàn)連續(xù)完整的修復(fù)性牙本質(zhì)橋形成,無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。由此可推測(cè)Marilin-4具有一定的抗炎作用，可以促進(jìn)血管再生及修復(fù)性牙本質(zhì)的形成。本研究中免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：3 d時(shí)Marilin-4組大鼠成牙本質(zhì)細(xì)胞中DSP呈弱陽(yáng)性表達(dá),隨后逐漸增強(qiáng)并于蓋髓后14 d達(dá)到最高峰， 28 d 時(shí)DSP陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度減弱，且蓋髓后各時(shí)間段DSP陽(yáng)性表達(dá)均強(qiáng)于PBS組；與 PBS 組比較, Marilin-4組大鼠在 3、7、14 d 時(shí)DSP陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度明顯升高，術(shù)后 28 d 時(shí)DSP陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究結(jié)果提示：Marilin-4可增強(qiáng)成牙本質(zhì)細(xì)胞和牙髓細(xì)胞的活躍性,調(diào)節(jié)成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞[22]，促進(jìn)修復(fù)性牙本質(zhì)的形成，推測(cè)Marilin-4可作為一種良好的蓋髓劑。

綜上所述, 將Marilin-4作為蓋髓劑用于大鼠機(jī)械性損傷的露髓處,在一定程度上可增強(qiáng)成牙本質(zhì)細(xì)胞的活躍性并促進(jìn)修復(fù)性牙本質(zhì)的形成。Marilin-4可以作為一種良好的蓋髓劑,與氫氧化鈣和MTA等蓋髓劑聯(lián)合應(yīng)用于臨床,改善現(xiàn)有的蓋髓劑的不足之處，本研究為開發(fā)新的蓋髓劑提供了理論依據(jù)。