馮 杰，任立群，陳素賢,萬義增，徐培斌

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室，遼寧 錦州 121000；2. 錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院病理科，遼寧 錦州 121000；3. 吉林大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)藥理與毒理教研室，吉林 長(zhǎng)春 130021；4. 長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)教研室，吉林 長(zhǎng)春 130117)

結(jié)腸癌是常見的惡性腫瘤之一，起病隱匿，易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，發(fā)現(xiàn)時(shí)多為中晚期。奧沙利鉑(oxaliplatin，OXA)是周期非特異性抗腫瘤藥物，可抑制腫瘤細(xì)胞增殖，常用于治療結(jié)腸癌，但長(zhǎng)期使用會(huì)產(chǎn)生腎毒性、耳毒性和骨髓抑制等不良反應(yīng)，降低了患者的生活質(zhì)量[1]。因此，減輕OXA的不良反應(yīng)，提高患者生存質(zhì)量是治療結(jié)腸癌的關(guān)鍵。中藥對(duì)腫瘤細(xì)胞有抑制作用，因價(jià)格低廉、安全無毒，受到人們的高度關(guān)注。葫蘆素B(cucurbitacin B,CUB)是葫蘆素家族成員之一，一種高度氧化的四環(huán)三萜類化合物。國(guó)內(nèi)外研究[2-9]顯示：CUB對(duì)胃癌、結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌、骨肉瘤和淋巴瘤等多種腫瘤有抑制作用。目前國(guó)內(nèi)外尚無CUB聯(lián)合OXA對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制的相關(guān)研究。本研究通過體外實(shí)驗(yàn)觀察CUB聯(lián)合OXA對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖及凋亡的影響，探討其作用機(jī)制，為臨床治療結(jié)腸癌提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器 人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株(吉林大學(xué)藥學(xué)院提供)。CUB(南京景竹生物科技有限公司)，用二甲基亞砜(DMSO)溶解，濃度為1 mol·L-1，置于-20℃冰箱保存，DMSO的濃度控制在0.1%以下。OXA(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)，用時(shí)現(xiàn)配制成100 μmol·L-1。DMEM高糖培養(yǎng)液(美國(guó)Hyclone公司)，優(yōu)質(zhì)胎牛血清(天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司)，DMSO、噻唑藍(lán)(MTT)和碘化啶(PI)(美國(guó)Sigma公司)，Annexin Ⅴ-FITC/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒、總蛋白提取試劑盒、細(xì)胞裂解液、ECL發(fā)光液和Hoechst33258染色液(中國(guó)碧云天公司)，半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶3(cysteiyl aspartate specific protease-3， caspase-3)抗體、活化后的caspase-3(cleaved caspase-3)抗體、B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)抗體和Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)抗體(美國(guó)Abcam公司)，HRP標(biāo)記的山羊抗兔/鼠二抗(北京鼎國(guó)昌盛公司)。倒置相差顯微鏡(日本尼康公司)，DG5031型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(南京華東電子集團(tuán)醫(yī)療裝備有限責(zé)任公司)，電泳槽、流式細(xì)胞儀和CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)SIM公司)，Tanon 4600全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(上海Tanon科技有限公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組 SW480細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次。 將細(xì)胞分為對(duì)照組,10、20和40 μmol·L-1CUB組，OXA組(100 μmol·L-1)和 聯(lián)合組(40 μmol·L-1CUB + 100 μmol·L-1OXA)。

1.3 MTT法檢測(cè)SW480細(xì)胞增殖率 用0.25%胰酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW480細(xì)胞，按每孔5×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。次日，按照實(shí)驗(yàn)分組加藥，培養(yǎng)24 h，每孔加入MTT 20 μL(5 g·L-1)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入DMSO 150 μL ，搖床10 min。設(shè)調(diào)零孔，選擇490 nm波長(zhǎng)，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率=實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 Hoechst33258染色法觀察SW480細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的結(jié)腸癌SW480細(xì)胞接種于6孔板中，分組同上，每孔4×105個(gè)細(xì)胞。加藥培養(yǎng)24 h，PBS洗3遍；加入10%甲醛4℃固定15 min；加入Hoechst33258染色液，室溫孵育2 min；封片后用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)，Images Advanced 3.2成像系統(tǒng)處理圖片。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SW480細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡率 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的結(jié)腸癌SW480細(xì)胞接種于6孔板中，分組同上，每孔4×105個(gè)細(xì)胞。加藥培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，1 000 g離心5 min；1 mL PBS洗滌后，加入1.0 mL 70%乙醇溶液4℃固定過夜；1 000 g離心5 min，預(yù)冷PBS洗2遍；加入0.6 mL PI染液，避光孵育30 min，在1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同細(xì)胞周期細(xì)胞百分率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

細(xì)胞分組同上。培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，1 000 g 離心5 min，棄培養(yǎng)液，按照Annexin Ⅴ-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作。在室溫下避光孵育10 min，在30 min內(nèi)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 Western blotting法檢測(cè)SW480細(xì)胞中caspase-3、cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)水平 按照1.5進(jìn)行分組和加藥，24 h后提取細(xì)胞蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度；SDS-PAGE凝膠電泳，統(tǒng)一蛋白上樣量30 μg，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；封閉液封閉1 h，加一抗4℃過夜；次日加HRP標(biāo)記的二抗，搖床1 h，TBST緩沖液20 min/次洗3次，加ECL發(fā)光液，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。通過Tanon 4600全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)顯影拍攝照片，用Image Pro Plus 6.0軟件分析caspase-3、cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白的灰度值,以GAPDH為內(nèi)參對(duì)照，計(jì)算蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 各組SW480細(xì)胞增殖率 與對(duì)照組比較，不同劑量CUB組、OXA組和聯(lián)合組SW480細(xì)胞增殖率明顯降低(P<0.05)；與不同劑量CUB組和OXA組比較，聯(lián)合組細(xì)胞增殖率進(jìn)一步降低(P<0.05)。見表1。

2.2 各組SW480細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn) Hoechst33258染色后觀察SW480細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)：對(duì)照組細(xì)胞的細(xì)胞核藍(lán)色熒光分布均勻；CUB組和OXA組細(xì)胞藍(lán)色熒光較對(duì)照組亮，細(xì)胞核可見濃染致密的顆粒塊狀熒光；與CUB組和OXA組比較，聯(lián)合組細(xì)胞藍(lán)色熒光更亮，細(xì)胞核濃染顆粒更明顯。見圖1(插頁五)。

A:Control group; B-D: 10,20， and 40 μmol·L-1CUB groups; E: OXA group; F: Combination group.
圖1 各組SW480細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn) (Hoechst 33258,×200)
Fig.1 Morphology of SW480 cells in various groups(Hoechst 33258,×200)

表1 各組SW480細(xì)胞增殖率Tab.1 Proliferation rates of SW480 cells in various groups

*P<0.05 compared with control group;△P<0.05 compared with 10 μmol·L-1CUB group;#P<0.05 compared with 20 μmol·L-1CUB group;○P<0.05 compared with 40 μmol·L-1CUB group;□P<0.05 compared with OXA group.

2.3 各組不同細(xì)胞周期SW480細(xì)胞百分率 與對(duì)照組比較，不同劑量CUB組和聯(lián)合組G2/M期細(xì)胞百分率明顯升高(P<0.05)，OXA組、40 μmol·L-1CUB組和聯(lián)合組S期細(xì)胞百分率明顯升高(P<0.05)。見圖2(插頁六)和表2。

A:Control group; B-D:10，20，and 40 μmol·L-1CUB groups; E: OXA group; F: Combination group.
圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組不同細(xì)胞周期SW480細(xì)胞百分率
Fig.2 Percentages of SW480 cells in different cell cycles in various groups detected by flow cytometry

表2 各組不同細(xì)胞周期SW480細(xì)胞百分率Tab.2 Percentages of SW480 cells in different cell cycles in various groups

*P<0.05 compared with control group.

2.4 各組SW480細(xì)胞凋亡率 與對(duì)照組比較，不同劑量CUB組、OXA組和聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)；與不同劑量CUB組和OXA組比較，聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步升高(P<0.05)。見圖3和表3。

A:Control group; B-D: 10，20，and 40 μmol·L-1 CUB groups; E: OXA group; F: Combination group.圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組SW480細(xì)胞凋亡率Fig.3 Apoptotic rates of SW480 cells in various groups detected by flow cytometry

表3 各組SW480細(xì)胞凋亡率Tab.3 Apoptotic rates of SW480 cells in various groups

*P<0.05 compared with control group;△P<0.05 compared with 10 μmol·L-1CUB group;#P<0.05 compared with 20 μmol·L-1CUB group;○P<0.05 compared with 40 μmol·L-1CUB group;□P<0.05 compared with OXA group.

2.5 各組SW480細(xì)胞中caspase-3、cleaved caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平及cleaved caspase-3/caspase-3和Bcl-2/Bax 比值 與對(duì)照組比較，不同劑量CUB組、OXA組和聯(lián)合組SW480細(xì)胞中caspase-3和Bcl-2蛋白表達(dá)水平及Bcl-2/Bax 比值明顯降低(P<0.05)，cleaved caspase-3和Bax蛋白表達(dá)水平及cleaved caspase-3/caspase-3比值明顯升高(P<0.05)；與不同劑量CUB組和OXA組比較，聯(lián)合組細(xì)胞中caspase-3和Bcl-2蛋白表達(dá)水平及Bcl-2/Bax比值明顯降低(P<0.05)，cleaved caspase-3和Bax 蛋白表達(dá)水平及cleaved caspase-3/caspase-3比值明顯升高(P<0.05)。見圖4和表4。

Lane 1: Control group; Lane 2-4: 10,20,and 40 μmol·L-1CUB groups; Lane 5: OXA group; Lane 6: Combination group.
圖4 各組SW480細(xì)胞中caspase-3、cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)電泳圖
Fig.4 Electrophoregram of expressions of caspase-3, cleaved caspase-3,Bax and Bcl-2 proteins in SW480 cells in various groups

3 討 論

細(xì)胞凋亡是由基因控制的一種自主性死亡，腫瘤細(xì)胞的無限增殖使得腫瘤細(xì)胞無法凋亡。因此，治療結(jié)腸癌的關(guān)鍵是抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。OXA是治療結(jié)腸癌的常用化療藥物，但不良反應(yīng)明顯，降低了患者的生存質(zhì)量。因此，尋找高效低毒、增強(qiáng)藥物療效及減輕藥物不良反應(yīng)的新藥物極其重要。CUB是廣泛存在于葫蘆科植物中的一類四環(huán)三萜類化合物，具有多種藥理作用，如抗病毒、抗炎、抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和降血糖等[10]，對(duì)腫瘤細(xì)胞的促凋亡作用引起人們的密切關(guān)注。本研究采用不同濃度CUB、OXA及CUB聯(lián)合OXA作用于人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞，MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，各加藥組細(xì)胞增殖率明顯降低，提示CUB、OXA及兩藥聯(lián)合能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，各加藥組細(xì)胞凋亡率升高，且聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率明顯高于CUB組和OXA組。研究[11]顯示：CUB可將乳腺癌細(xì)胞阻滯在S期和G2/M期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且能增加藥物對(duì)細(xì)胞的靈敏性。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SW480細(xì)胞周期分布，結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，CUB組和聯(lián)合組細(xì)胞中S期和G2/M期細(xì)胞百分率升高，OXA組細(xì)胞中S期細(xì)胞百分率升高。

表4 各組SW480細(xì)胞中caspase-3、cleaved caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平及cleaved caspase-3/caspase-3和Bcl-2/Bax 比值Tab.4 Expression levels of caspase-3,cleaved caspase-3,Bcl-2,Bax proteins in SW480 cells and ratios of cleaved caspase-3/caspase-3 and Bcl-2/Bax in various groups

*P<0.05 compared with control group;△P<0.05 compared with 10 μmol·L-1CUB group;#P<0.05 compared with 20 μmol·L-1CUB group;○P<0.05 compared with 40 μmol·L-1CUB group;□P<0.05 compared with OXA group.

Bcl-2家族在細(xì)胞凋亡中起重要作用，其中Bcl-2基因抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，Bax基因促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡；Bcl-2與Bax既可形成同源二聚體也可形成異源二聚體。當(dāng)Bcl-2水平升高時(shí)，抑制細(xì)胞凋亡；Bax水平升高時(shí)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[12-13]。有研究[14]顯示：結(jié)腸癌細(xì)胞中Bcl-2表達(dá)水平升高，Bcl-2升高抑制Bax表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡。半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶(cysteinylaspartate specific protease，caspase)在細(xì)胞凋亡中起促進(jìn)作用[15]，其中caspase-3在細(xì)胞凋亡過程中是最關(guān)鍵的執(zhí)行者，是caspase家族中的重要成員[16-17]。細(xì)胞凋亡分為受體依賴性途徑和線粒體途徑[18]；當(dāng)線粒體受刺激時(shí)，如感染和DNA損傷，線粒體膜通透性增加，細(xì)胞色素C將通過線粒體膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，與凋亡酶激活因子1(apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1)結(jié)合，激活半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶9(cysteinyl aspartate specific protease-9，caspase-9)，caspase-9活化下游的無活性的caspase-3，激活caspase-3剪切成有活性的cleaved caspase-3，進(jìn)一步激活caspase的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[19-20]。Bcl-2家族可調(diào)控caspase的活化和滅活[21]。本研究采用Western blotting法檢測(cè)各組SW480細(xì)胞中caspase-3、cleaved caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，各加藥組caspase-3和Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低，cleaved caspase-3和Bax蛋白表達(dá)水平升高；與CUB組和OXA組比較，聯(lián)合組細(xì)胞中上述蛋白表達(dá)水平變化更加明顯，提示CUB可以促進(jìn)cleaved caspase-3和Bax蛋白表達(dá)，抑制caspase-3和Bcl-2蛋白表達(dá)，上調(diào)cleaved caspase-3/caspase-3比值，下調(diào)Bcl-2/Bax比值，誘導(dǎo)SW480細(xì)胞凋亡。

綜上所述， CUB能夠抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖，CUB聯(lián)合OXA抑制作用更加明顯。CUB聯(lián)合OXA的具體抗腫瘤機(jī)制還有待后續(xù)研究，且聯(lián)合用藥在動(dòng)物體內(nèi)是否具有抑癌作用還有待進(jìn)一步研究。