王 琪，王 楠，林 琳

(1.大連市婦幼保健院檢驗科，遼寧大連116033；2.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗科，遼寧大連116011)

microRNA(miRNA)是一類保守進化的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，長度約為22個核苷酸，在細胞中可以起到重要的調(diào)節(jié)作用[1-2]。miRNA最早是在研究線蟲突變體遺傳時發(fā)現(xiàn)的，lin-4可對線蟲的發(fā)育起到延緩作用[3]。REINHART等[4]隨后又在線蟲中發(fā)現(xiàn)了let-7。而let-7基因及其靶基因的突變均可以使線蟲在發(fā)育過程中形態(tài)改變。

人們目前發(fā)現(xiàn)了約3 000個miRNA[5]，與人類相關(guān)的miRNA為332個。MURAKAMI等[6]通過對癌旁組織與肝癌組織中miRNA的表達情況進行分析，發(fā)現(xiàn)miR-18、pre-miR-18和miR-22在癌組織中存在高表達。國內(nèi)也基于基因芯片技術(shù)對肝癌細胞中miRNA的表達情況進行分析，發(fā)現(xiàn)了高表達的miRNA-224[7]。

本實驗設(shè)計了與肝癌相關(guān)miRNA-224的反義寡核苷酸(AMO-miR-224)，通過實驗確定AMO-miR-224在肝癌細胞中起到的作用。反義技術(shù)基于堿基互補原理，用特定互補的DNA或RNA或其化學(xué)修飾產(chǎn)物，阻斷蛋白的轉(zhuǎn)錄翻譯，使得該基因不能正常表達。本研究假設(shè)：miRNA-224可能在SMMC-7721的生長凋亡過程起到重要作用，隨即將反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染進細胞，觀察轉(zhuǎn)染后腫瘤細胞生物學(xué)活性的改變。

1 材料與方法

1.1材料 細胞株購自中國遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)院；胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司；1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司。

1.2儀器與試劑 針對miRNA-224的反義寡核苷酸，dNTP和RNaseFree H2O購自美國Takara公司；0.25%胰酶-0.02%乙二胺四乙酸細胞消化液購自美國Gibco公司；LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司；Rnase Inhibitor購自美國Promega公司；凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；Hairpin-itTMmiRNAs購自美國Gimma有限公司。

1.3設(shè)計反義寡核苷酸序列 根據(jù)MiRBase官網(wǎng)提供的miRNA基因序列，設(shè)計相應(yīng)的反義寡核苷酸序列，隨后使用BLAST軟件進行分析確認(rèn)，同時找到一條隨機合適的對照序列[8]，miRNA-224：5′-CAA GUC ACU AGU GGU UCC GUU-3′(21 bp)；AMO-miR-224：5′-AAC GGA ACC ACT AGT GAC TTG-3′(2 bp)；隨機對照序列：5′-ATT AGC GAC GAT GGT GUG GTA-3′(21 bp)。由中國大連寶生物公司對以上的序列進行合成，全硫代修飾，PAGE純化。

1.4熒光定量PCR(qPCR)檢測 培養(yǎng)SMMC-7721與張氏肝細胞，取對數(shù)生長期細胞，離心去上清后，使用試劑提取RNA。使用Hairpin-itTMmiRNAs qPCR試劑盒檢測miRNA-224的表達情況。

1.5建立AMO-miR-224作用于SMMC-7721的細胞模型 取對數(shù)生長期SMMC-7721細胞，在24孔板內(nèi)以4×104cells/mL的水平接種，每組均做3次重復(fù)孔。待細胞貼壁后，去除上清，使用含LipofectamineTM2000-AMO的RPMI-1640培養(yǎng)液，進行轉(zhuǎn)染(6 h)。

1.6SMMC-7721細胞的凋亡情況及AMO-miR-224對SMMC-7721的最佳作用水平與作用時間 流式細胞儀檢測AMO-miR-224作用后SMMC-7721細胞的凋亡情況及臺盼藍拒染法篩選AMO-miR-224對SMMC-7721的最佳作用水平與作用時間。實驗設(shè)計3組：AMO-miR-224組、隨機對照組、空白對照組，每組AMO-miR-224的水平為別為0.05、0.10、0.20、0.30、0.60 μmol/L，空白對照組加入與藥物同體積的1640培養(yǎng)基。分別培養(yǎng)24、48、72 h后取出一定量的細胞懸液，計數(shù)各組的活細胞數(shù)(臺盼藍拒染法),重復(fù)3次實驗，計算出平均值后進行進一步分析。從而確定后續(xù)實驗所需要的最佳作用水平和時間。后續(xù)實驗仍設(shè)計3組。所選取的AMO-miR-224水平為0.3 μmol/L，培養(yǎng)時間為48 h。流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，重復(fù)3次。

1.7qPCR檢測經(jīng)AMO-miR-224作用后SMMC-7721細胞miRNA-224的水平變化 仍使用終水平為0.3 μmol/L的AMO-miR-224，培養(yǎng)48 h。提取細胞的總RNA。qPCR檢測各組miRNA-224的表達情況。

2 結(jié) 果

2.1SMMC-7721與張氏肝細胞中miRNA-224的表達情況 目的基因miRNA-224在SMMC-7721細胞中表達量(管家基因U6校正后)為22.42，而在張氏肝細胞表達量(校正后)為2.35，SMMC-7721中目的基因miRNA-224的表達量為張氏肝細胞的9.54倍，即miRNA-224在SMMC-7721細胞表達高于張氏肝細胞。見表1。

表1 目的基因miRNA-224相對表達量

2.2AMO-miR-224對SMMC-7721的最佳作用水平與作用時間 作用水平在0.2 μmol/L時出現(xiàn)對細胞的抑制，當(dāng)水平為0.6 μmol/L時較多細胞漂浮，形態(tài)不完整，表面隨AMO-miR-224水平的增加，細胞發(fā)生凋亡增加，高水平時死亡數(shù)明顯增加，呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系，最終選擇的AMO-miR-224的最佳作用水平為0.3 μmol/L。終水平為0.3 μmol/L的AMO-miR-224轉(zhuǎn)染SMMC-7721 48 h后開始抑制細胞生長，細胞凋亡率明顯增加，因此,選擇48 h為后續(xù)實驗的作用時間，且隨時間增加死亡細胞增多，呈現(xiàn)出顯著的時效關(guān)系。見圖1、2。

注：縱坐標(biāo)為細胞存活數(shù)。

圖1不同水平AMO對細胞的生長抑制作用

注：縱坐標(biāo)為細胞存活數(shù)。

圖2不同時間AMO對細胞的生長抑制作用

2.3最佳作用水平與最佳作用時間的AMO-miR-224轉(zhuǎn)染SMMC-7721對細胞形態(tài)的影響 SMMC-7721細胞為貼壁生長的長梭形，細胞界限清晰。轉(zhuǎn)染后細胞的胞質(zhì)出現(xiàn)空泡(脂質(zhì)體形成)，同時細胞出現(xiàn)皺縮，胞質(zhì)顆粒增多，細胞碎片化等細胞死亡的表現(xiàn)。當(dāng)水平為0.3 μmol/L時，細胞逐漸死亡，胞質(zhì)量下降，細胞輪廓不清。見圖3。

2.4流式細胞儀檢測AMO-miR-224作用后SMMC-7721細胞的凋亡情況 水平為0.3 μmol/L的AMO-miR-224作用于SMMC-7721細胞48 h后，AMO-miR-224組與隨機對照組相比，細胞發(fā)生凋亡的比率都有明顯的升高(包括早期凋亡與晚期凋亡)，說明AMO-miR-224可抑制miRNA-224的表達，促進SMMC-7721細胞的凋亡。見表2。

2.5qPCR檢測經(jīng)AMO-miR-224作用后SMMC-7721細胞miRNA-224的水平變化 經(jīng)AMO-miR-224作用后，AMO組細胞中miRNA-224表達量(U6校正后)為0.29，而隨機對照組細胞(U6校正后)為4.11，隨機對照組中miRNA-224的表達量為AMO組的14.17倍。即與隨機對照組相比，miRNA-224在AMO組細胞中的表達是下調(diào)的，反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染細胞后，使細胞miRNA-224表達下調(diào)，其后續(xù)所產(chǎn)生的對細胞的作用也受到抑制。見表3。

表2 AMO-miR-224(0.3 μmol/L)作用SMMC-7721后細胞凋亡比率

注：AMO-miR-224組與隨機對照組比較，*P<0.05。

注：A表示正常SMMC-7721細胞形態(tài)；B表示轉(zhuǎn)染后SMMC-7721細胞形態(tài)；C表示水平為0.3 μmol/L時細胞形態(tài)。

圖3細胞形態(tài)

表3 3組細胞目的基因miRNA-224的相對表達量情況

3 討 論

本研究采用反義技術(shù)探討miRNA-224在肝癌細胞中的作用。有研究者針對多種miRNA(如miRNA-194)設(shè)計了反義寡核苷酸，結(jié)果顯示其設(shè)計的反義寡核苷酸有抑制小鼠不同組織中相應(yīng)miRNA的表達的作用，表明可以利用相應(yīng)miRNA的反義寡核苷酸抑制該miRNA的表達，從而研究使用反義寡核苷酸對miRNA在細胞生長、腫瘤發(fā)生等不同情況下起到的作用。

經(jīng)qPCR實驗證實，miRNA-224在SMMC-7721肝癌細胞中有明顯的高表達(為張氏肝細胞的9.54倍)。眾所周知，SMMC-7721是甲胎蛋白陽性的經(jīng)典肝癌細胞株,被廣泛應(yīng)用于肝癌相關(guān)的研究當(dāng)中，而張氏肝細胞為人源的正常肝細胞,結(jié)果表明，相比于正常肝細胞，miRNA-224在肝癌細胞中高表達，國外文獻中也有關(guān)于此類結(jié)果的相應(yīng)報道[6-7]。

本研究經(jīng)臺盼藍拒染法實驗從細胞水平上證實AMO-miR-224可以抑制肝癌細胞的生長。而流式細胞術(shù)的結(jié)果表明，當(dāng)AMO-miR-224轉(zhuǎn)染后，SMMC-7721細胞與隨機對照組(隨機序列轉(zhuǎn)染的SMMC-7721細胞)相比，發(fā)生凋亡的(包括早期、晚期凋亡)細胞的百分率都明顯升高，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。該結(jié)果表明miRNA-224有促進肝癌細胞生長的作用。新加坡國立大學(xué)生物學(xué)研究所WANG等[11]提出，miRNA-224的靶基因是凋亡抑制因子-5(API-5)，miRNA-224可能是通過影響API-5轉(zhuǎn)錄后的表達水平從而發(fā)揮作用，但具體機制還需要進一步的研究。

當(dāng)正常細胞癌變時，細胞往往會對生長抑制信號不敏感，從而降低細胞凋亡的水平，獲得了無限增殖能力[10-11]。而本實驗利用反義寡核苷酸的作用，AMO-miR-224通過與miRNA-224結(jié)合，發(fā)揮反義技術(shù)從而抑制miRNA-224的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞的增殖受到抑制，細胞凋亡，表明miRNA-224促進肝癌細胞的生長過程，從而推測miRNA-224在肝癌中可能發(fā)揮癌基因的作用。

本研究證明針對miRNA-224設(shè)計的反義寡核苷酸AMO-miR-224可以抑制SMMC-7721的生長，并且可以使腫瘤細胞發(fā)生凋亡，降低SMMC-7721細胞中miRNA-224的表達水平，為肝癌的診斷和治療提供一個新的靶點、思路[12]。