天津七里海野生葦蘑菌株繼代培養(yǎng)基的篩選

李 倩 李舒婷 王潤楠 于水欣 劉 江 劉西周

（天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津300387）

葦蘑為蠟傘科（Hygrophoropsidaceae）、擬蠟傘屬（Hygrophoropsis）的一種蘑菇[1]，目前僅被發(fā)現(xiàn)生長于天津市寧河區(qū)七里海濕地的蘆葦蕩中，是該區(qū)域內(nèi)一種特有的珍稀野生食用菌[2]。七里海是天津平原殘留的眾多瀉湖之一，位于天津市東北部寧河區(qū)，1992年10月國務(wù)院在此建立“天津古海岸與濕地國家級自然保護(hù)區(qū)”[3]。該地區(qū)的蘆葦叢多年敗葉腐草厚積，盛夏時節(jié)雨水較多，形成了適合于葦蘑生長的底質(zhì)、濕度、溫度和光照環(huán)境[1]。腐爛的蘆葦?shù)叵虑o間仍有良好的通氣孔隙，足以供給菌絲生長所需的氧氣，因此葦蘑可以生長在地下數(shù)十厘米處的腐爛蘆葦腐殖質(zhì)中[4]。人們采集葦蘑后，或鮮食，或曬干食用，口感獨(dú)特、營養(yǎng)豐富，味道鮮美而獨(dú)特，遠(yuǎn)勝于其他蘑菇[1]。近年來，天津七里海地區(qū)生態(tài)環(huán)境被破壞，濕地退化嚴(yán)重，再加上人為地過度采摘，野生葦蘑的產(chǎn)量和品質(zhì)逐年降低，野生葦蘑幾乎絕跡。

圖1 野生葦蘑子實(shí)體

為保護(hù)葦蘑這一獨(dú)特的生物資源，多年來很多學(xué)者一直在研究人工栽培葦蘑技術(shù)，目前僅見天津師范大學(xué)生命科學(xué)院關(guān)于天津市七里海野生葦蘑人工馴化成功的報(bào)道[5]。在實(shí)驗(yàn)室葦蘑菌株通常保藏在PDA綜合培養(yǎng)基上，然而傳代次數(shù)越多，對菌種的創(chuàng)傷就越大[6]，并且易造成菌種退化[7]。查閱國內(nèi)外資料，目前關(guān)于葦蘑的僅有科屬研究[1]、液體培養(yǎng)菌種的優(yōu)化[8-10]、葦蘑多糖提取工藝研究[11]、不同活性抗氧化活性作用研究[12]、人工馴化成功相關(guān)報(bào)道[5]。目前還未見關(guān)于葦蘑菌株退化、老化問題研究報(bào)道。筆者結(jié)合葦蘑的自然生長條件，將稻草、稻草（浸提液）和蘆葦腐殖質(zhì)這3種天然成分作為研究因素，通過單因素與正交試驗(yàn)，優(yōu)化出了一種適合葦蘑菌株繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基，為葦蘑進(jìn)一步批量生產(chǎn)與馴化研究提供理論和實(shí)踐支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

葦蘑子實(shí)體（采自天津七里海，現(xiàn)保存于天津師范大學(xué)蕈菌研究所）、稻草粉、稻草（浸提液）、蘆葦腐殖質(zhì)；馬鈴薯（浸提液）、葡萄糖、MgSO4·7H2O、KH2PO4、瓊脂粉、VB1。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 PDA綜合培養(yǎng)基

馬鈴薯（浸提液）200 g/L，葡萄糖 20 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，KH2PO43 g/L，瓊脂粉20 g/L，VB10.01 g/L

1.2.2 不同稻草粉、稻草（浸提液）、蘆葦腐殖質(zhì)培養(yǎng)基

以PDA綜合培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別加入稻草粉、稻草（浸提液）、蘆葦腐殖質(zhì)作為試驗(yàn)培養(yǎng)基，具體見表1。

表1 供試培養(yǎng)基配比 g/L

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 不同含量稻草粉、稻草（浸提液）、蘆葦腐殖質(zhì)單因素試驗(yàn)

將葦蘑子實(shí)體通過組織分離獲得菌種接種到PDA綜合培養(yǎng)基中，29℃培養(yǎng)20 d后，選取葦蘑菌落邊緣生長點(diǎn)部位，用直徑為1 cm的打孔器取葦蘑菌絲塊，分別接種到20種培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基（PDA綜合培養(yǎng)基）中，每種培養(yǎng)基做3個重復(fù)。29℃培養(yǎng)29 d，采用十字交叉法每隔三天測量菌落直徑[5]，并觀察記錄菌落褐變、老化的程度。

1.3.2 正交設(shè)計(jì)優(yōu)化培養(yǎng)基配方試驗(yàn)

大多數(shù)食用菌能在PDA綜合培養(yǎng)基上正常生長，但是PDA綜合培養(yǎng)基的營養(yǎng)豐富，保藏過程中盡量選擇使用營養(yǎng)相對貧瘠的培養(yǎng)基[13]，因此將稻草粉、稻草（浸提液）、蘆葦腐殖質(zhì)和PDA綜合培養(yǎng)基中的葡萄糖含量作為四個因素，根據(jù)單因素的梯度篩選試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)（表2），試驗(yàn)方法同單因素試驗(yàn)。通過正交試驗(yàn)結(jié)果分析，得到理論最佳繼代培養(yǎng)基配方，并進(jìn)行驗(yàn)證。

表2 培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) g/L

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 不同稻草粉含量培養(yǎng)基中葦蘑菌落大小及菌絲老化程度

由表3可見，培養(yǎng)至第12天稻草粉5 g/L培養(yǎng)基中葦蘑菌絲菌落直徑最大，同時其菌落未出現(xiàn)褐變和老化現(xiàn)象。

表3 稻草粉含量對葦蘑菌落大?。ㄖ睆剑┑挠绊?/p>

2.1.2 稻草（浸提液）含量培養(yǎng)基中葦蘑菌落大小及菌絲老化程度

由表4可見，培養(yǎng)至第12天稻草（浸提液）50 g/L培養(yǎng)基中葦蘑的菌落直徑最大，同時其菌落沒有出現(xiàn)老化、褐變現(xiàn)象。

表4 稻草（浸提液）含量對菌落大小（直徑）的影響

2.3 不同蘆葦腐殖質(zhì)含量培養(yǎng)基中葦蘑菌落大小及菌絲老化程度

由表5可見，培養(yǎng)至第12天蘆葦腐殖質(zhì)10 g/L培養(yǎng)基中的葦蘑菌落直徑最大，同時菌落未現(xiàn)老化。

表5 不同蘆葦腐殖質(zhì)含量對葦蘑菌落大小（直徑）的影響

2.2 正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)結(jié)果見表6。由表6可見，影響菌絲體生長的最重要因素是培養(yǎng)基中葡萄糖含量，其次是稻草（浸提液），稻草粉，蘆葦腐殖質(zhì)；1號培養(yǎng)基、4號培養(yǎng)基和5號培養(yǎng)基的菌落直徑都達(dá)到了6 cm以上，其中5號培養(yǎng)基的菌落直徑最大。

表6 培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

由圖2可見，第15天時，4號培養(yǎng)基和5號培養(yǎng)基的菌落都已經(jīng)出現(xiàn)了老化現(xiàn)象，而1號培養(yǎng)基的菌落仍然是白色且沒有出現(xiàn)任何老化的現(xiàn)象。因此，正交試驗(yàn)結(jié)果表明，最適合葦蘑菌絲體生長的是1號培養(yǎng)基即葡萄糖10 g/L，馬鈴薯（浸提液）200 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，KH2PO43 g/L，瓊脂粉20 g/L，VB10.01 g/L，稻草粉 2.5 g/L，稻草（浸提液）25 g/L，蘆葦腐殖質(zhì)5 g/L。正交試驗(yàn)中理論上的最佳培養(yǎng)基配方是A2B1C2D1，即葡萄糖10 g/L，馬鈴薯（浸提液）200 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，KH2PO43 g/L，瓊脂粉 20 g/L，VB10.01 g/L，稻草粉 5 g/L，稻草（浸提液）25 g/L，蘆葦腐殖質(zhì)10 g/L。

圖2 培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗(yàn)第15天菌落

通過驗(yàn)證，理論最佳培養(yǎng)基第15天菌落直徑如表7所示，結(jié)果表明，正交試驗(yàn)的最優(yōu)培養(yǎng)基1號培養(yǎng)基和理論最佳培養(yǎng)基的菌落直徑相近。

表7 正交試驗(yàn)理論最佳培養(yǎng)基的菌落直徑

由圖3可知，理論最佳培養(yǎng)基在第15天時菌落呈白色，出現(xiàn)了少量菌核，菌核是真菌菌絲在不良環(huán)境條件下經(jīng)無性繁殖形成的一種致密而堅(jiān)硬的組織結(jié)構(gòu)，是真菌的營養(yǎng)貯藏和休眠器官[14]。而1號培養(yǎng)基的菌落在15 d時為白色且菌絲致密，并未出現(xiàn)老化現(xiàn)象，推測可能與培養(yǎng)基中營養(yǎng)相對貧乏有關(guān)，因此葦蘑菌株在1號培養(yǎng)基上生長優(yōu)于理論最佳培養(yǎng)基。

培養(yǎng)至39 d，九種培養(yǎng)基的菌落如圖4所示，菌絲都已長滿平板，3號、4號、6號和8號培養(yǎng)基上的菌落由中心向外出現(xiàn)了褐變現(xiàn)象且出現(xiàn)了較多菌核，這表明這四種培養(yǎng)基不適合葦蘑實(shí)驗(yàn)室日常的保種；1號、2號、5號、7號和9號培養(yǎng)基上的菌落呈現(xiàn)白色，2號、5號、7號和9號培養(yǎng)基中的菌落有老化現(xiàn)象。

圖3 正交試驗(yàn)1號培養(yǎng)基和理論最佳培養(yǎng)基第15天菌落對比

圖4 培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗(yàn)第39天菌落對比

由圖5可見，培養(yǎng)至39 d時，理論最佳培養(yǎng)基中的菌落出現(xiàn)了大量菌核，而1號培養(yǎng)基中的菌落仍然為白色且未出現(xiàn)菌核。葦蘑菌絲體在傳統(tǒng)的PDA綜合培養(yǎng)基上生長至39 d時，菌落出現(xiàn)了大量菌核并且已經(jīng)褐變和老化，表明1號培養(yǎng)基克服了葦蘑菌絲體不能較長時間繼代保藏的問題，方便實(shí)驗(yàn)室葦蘑菌絲體的日常繼代保種。

3 小結(jié)

試驗(yàn)結(jié)果表明最適合葦蘑菌絲體日常繼代保種的培養(yǎng)基配方是葡萄糖10 g/L，馬鈴薯（浸提液）200 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，KH2PO43 g/L，瓊脂粉20 g/L，VB10.01 g/L，稻草粉 2.5 g/L，稻草（浸提液）25 g/L，蘆葦腐殖質(zhì)5 g/L。該培養(yǎng)基29℃培養(yǎng)葦蘑39 d，未出現(xiàn)菌絲老化褐變現(xiàn)象。

圖5 正交試驗(yàn)1號培養(yǎng)基和理論最佳培養(yǎng)基第39天菌落對比

與其他試驗(yàn)最大的不同是在培養(yǎng)基中加入了天然成分，初步解決了實(shí)驗(yàn)室無法較長時間繼代保藏葦蘑菌株且易老化的問題，優(yōu)化出一種在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中適合葦蘑菌絲生長的繼代培養(yǎng)基配方，為葦蘑菌株的繼代培養(yǎng)和菌株保藏、深入研究以及規(guī)?；囵B(yǎng)提供了保障。