蔡蕭君，頡彥鵬，胡 楊，劉 松，王 磊

（黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，哈爾濱 150036）

抑郁癥是一種情緒低落、對活動反感的狀態(tài)，常會干擾患者日常生活，給患者及其家庭和社會帶來沉重的負擔(dān)[1]。然而，由于抑郁癥發(fā)病機制的復(fù)雜性，其病因仍不清楚[2]。與合成抗抑郁藥相比，中藥在疾病的預(yù)防和治療中起著至關(guān)重要的作用，因為它的不良反應(yīng)相對較少，安全性更高[3]。桔梗是一種傳統(tǒng)的中藥，已被廣泛用于治療痰多、咳嗽、咽喉痛[4-6]。此外，桔梗葉還含有豐富的化學(xué)成分，如必需氨基酸，特別是谷氨酸和精氨酸、膳食纖維和礦物質(zhì)、多酚、三萜皂苷、酚酸、聚乙炔、甾醇和類黃酮[6-9]。同時，桔梗葉還可通過改善H22荷瘤小鼠的免疫系統(tǒng)和誘導(dǎo)細胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用[7]。

代謝組學(xué)被認為是探索含有多種生物化學(xué)成分的藥物潛在機制的有力工具，它提供了可能構(gòu)成病理生理狀態(tài)的多種生化途徑的總體概述，因此，有利于抑郁癥等多功能疾病的研究。本研究采用代謝組學(xué)方法，研究了桔梗葉對脂多糖刺激小鼠模型的抗抑郁作用，并驗證了其潛在的生物標志物及相關(guān)的代謝途徑，以期為桔梗的后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑 Ekspert ultra LC100液相色譜儀、ABSciex Triple TOF 5600+質(zhì)譜儀（美國ABSciex集團公司）；Progenesis QI（美國Waters集團公司）；KDC-160HR型高速低溫離心機（中國科大創(chuàng)新股份公司）；桔梗葉采自吉林省，經(jīng)蔡蕭君教授鑒定為正品。將桔梗葉風(fēng)干、研磨并過篩（40目）以獲得均勻粉末。然后用70%甲醇在80℃下（每次3 h）萃取粉末3次。過濾后，將提取液合并濃縮蒸發(fā)得到桔梗葉提取物；乙腈和甲醇為超高效液相色譜-質(zhì)譜（UPLC-MS）級（比利時費希爾化工公司）；甲酸（美國Sigma Aldrich公司）；去離子水（中國A.S.Watson集團有限公司）；脂多糖購自Sigma Aldrich（批號：20171102）。白介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附測（ELISA）定試劑盒購自美國明尼阿波利斯研發(fā)系統(tǒng)有限公司，超氧化物歧化酶（SOD）酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒購自南京建城生物工程研究所。

1.2 動物 雄性7月齡ICR小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供[SCXK（遼）2019-0001]。

1.3 動物飼養(yǎng)及樣本制備 16只ICR小鼠按體質(zhì)量隨機分為2組，即模型組和給藥組。另選8只同批次健康小鼠作為空白組。所有實驗動物適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d（溫度 21～23℃，相對濕度 45%±5%，12 h光/暗循環(huán)，光循環(huán)從早上7∶00開始），實驗期間自由飲食和飲水，給藥組灌胃給予桔梗葉提取液進行干預(yù)[400 mg/（kg·d），連續(xù)1周?？瞻捉M與給藥組第1天至第4天腹腔注射等體積無菌生理鹽水，每日1次，模型組在第4天注射生理鹽水后，腹腔注射脂多糖（0.5 mg/kg）建立抑郁模型[10]。實驗第8天收集12 h尿液，離心（4℃、11 000 r/min、12 min），取上清液置于-80℃環(huán)境下保存，尿液代謝樣本采取原尿液，離心（4℃、11000r/min、12min），過0.22μm 濾膜作為供試品溶液。實驗第8天摘眼球取血，4℃下凝固1 h，在3 500 r/min離心15 min，在4℃下獲得血清。上述實驗結(jié)束后處死動物，取腦組織，分離前額葉皮質(zhì)，制備組織勻漿，低溫離心（4℃，10 000 r/min，5 min）保存待測。

1.4 前額葉皮質(zhì)炎癥因子IL-6、TNF-α的檢測操作步驟按照ELISA試劑盒說明書進行。

1.5 蔗糖偏好實驗 采用蔗糖偏好實驗評估小鼠抑郁模型是否如前所述成功建立。實驗當天，將剝奪12 h飲水的小鼠置于兩瓶預(yù)先稱質(zhì)量的1%蔗糖水中。12 h后，取下兩瓶并稱質(zhì)量，計算蔗糖水的消耗量。蔗糖偏好是蔗糖溶液消耗量相對于總液體消耗量的百分比。公式如下：蔗糖偏好=[蔗糖攝入量/（蔗糖消耗量+水消耗量）]100%。

1.6 代謝組學(xué)分析條件 采用Acquity UPLCBEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7μm）色譜柱進行測定。流動相A（0.1%甲酸水）、流動相B（0.1%甲酸乙腈），流速設(shè)為 0.4 mL/min。洗脫條件為：0～2 min，10%B；2～26 min，10%～90%B；26～28 min，90%B；28～28.1 min，90%～10%B。UPLC柱的溫度設(shè)置為30℃，樣品的溫度為10℃。分別使用1/1和9/1的水/乙腈混合物作為弱洗滌溶劑和強洗滌溶劑。

超高效液相飛行（UPLC-QTOF）質(zhì)譜儀（美國Waters公司）continuum模式采集代謝數(shù)據(jù)。陽離子模式條件為：毛細管電壓3.0kV，錐電壓40 V，離子源溫度150℃，脫溶溫度580℃，錐孔氣流量50L/h，脫溶劑氣流量800 L/h，掃描范圍100～1 200 Da，負離子模式毛細管電壓為2.2 kV。碰撞能量為20～40 V。在單次LC運行期間，通過質(zhì)譜儀快速從低碰撞能量掃描切換到高碰撞能量掃描來進行數(shù)據(jù)采集。Leucine encephalin用作鎖定噴頭的外部參考。

1.7 數(shù)據(jù)處理 本部分高通量代謝數(shù)據(jù)采用Progenesis QI 1.0軟件（美國Waters公司）進行處理，首先對多維數(shù)據(jù)進行降維處理，獲取的代謝數(shù)據(jù)中與抑郁癥最相關(guān)的生物信息數(shù)據(jù)學(xué)數(shù)據(jù)。然后生成臨時文件用于化學(xué)計量學(xué)分析，采用主成分分析或偏最小二乘判別分析的理論算法篩選組間差異離子，通過第三方數(shù)據(jù)庫進行比對最終確定潛在生物標記物。本部分組間差異離子篩選標準為S-plot圖中遠離中心原點，且TTEST值小于0.05的離子作為差異離子。統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS23.0軟件。實驗結(jié)果用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較采用LSD檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生化指標結(jié)果 炎癥一直被認為是抑郁癥的潛在病理生理因素之一[11]。在小鼠接受脂多糖刺激后，與空白組相比，IL-6和TNF-α濃度顯著升高，與模型組相比，給藥組血清IL-6和TNF-α水平顯著降低（P＜0.05）。此外，與空白組相比，模型組海馬組織SOD活性顯著降低，給藥組海馬組織SOD活性顯著升高（P＜0.05）。見圖 1。

2.2 蔗糖偏好實驗結(jié)果 與空白組相比，模型組在蔗糖偏好實驗中消耗更少的蔗糖，見圖2。這表明該模型建立良好，小鼠表現(xiàn)出抑郁相關(guān)的無核細胞減少和食欲不振癥狀，而與模型組相比，桔梗葉提取物干預(yù)明顯增加了蔗糖偏好。

2.3 尿液代謝組學(xué)研究 空白組、脂多糖誘導(dǎo)的模型組和給藥組在ESI+和ESI-的模式下均能通過主成分分析得分圖清楚地觀察到給藥組位于模型組和空白組之間，傾向于空白組，這表明模型中的特定生物標志物發(fā)生了變化，而桔梗葉治療對脂多糖誘導(dǎo)的代謝紊亂有顯著的調(diào)節(jié)作用。如圖3所示，正交偏最小二乘判別分析評分圖中的每個點代表一個樣本。生成S圖以識別潛在代謝物。S-plot可用于可視化代謝物和模型類之間的協(xié)方差和相關(guān)性，在正交偏最小二乘判別分析模型下，生成S圖，從統(tǒng)計學(xué)和生物化學(xué)角度識別潛在代謝物，這有助于篩選組間差異變量。在S圖中，每個點代表一個化合物。S圖中的點離原點越遠，它們對空白組和模型組的聚類作用越顯著，筆者采用此方法共選擇29種內(nèi)源性代謝物作為潛在的生物標志物。見表1。

采用Simca處理數(shù)據(jù)后，列出檢測到的所有峰強度對應(yīng)的m/z-Rt值。用高精度準分子離子計算生物標志物的可能分子式，其質(zhì)量耐受性在ppm以內(nèi)。將從10～40 eV獲得的匹配組分的MS/MS片段與梅特林的片段進行比較。將參考物質(zhì)與保留時間、m/z和MS碎片模式進行比較，最終確定了潛在的生物標志物。相同的Rt、m/z值和相似的碎片被認為屬于同一組分。然后，利用生物化學(xué)數(shù)據(jù)庫，包括HMDB （http：//www.hmdb.ca/）、Metlin（http：//metlin.scrips.edu/）、KEGG（http：//www.kegg.com/）和Metaboanalyst 4.0（http：//www.metaboanalyst.ca/）進一步鑒定潛在的生物標志物。根據(jù)代謝分析數(shù)據(jù)，選擇影響值閾值在0.10以上的代謝途徑作為最有潛力的代謝途徑[12]。見圖4-5。

圖1 抑郁癥小鼠生化指標結(jié)果（x±s）Fig.1 Resultsof biochemical indexesin depressed mice（x±s）

圖2 抑郁癥小鼠糖水偏好實驗結(jié)果（x±s）Fig.2 Experimental results of sugar water preference in depressed mice（x±s）

3 討論

圖3 空白組、模型組及給藥組的PCA得分圖及S-plotFig.3 PCA score plot and s-plot of blank group，model group and drug administration group

桔梗葉的抗抑郁作用與脂質(zhì)代謝、氨基酸代謝、能量代謝、花生四烯酸代謝、谷胱甘肽代謝、肌醇磷酸酯代謝等代謝途徑的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。在目前的研究中，代謝組學(xué)與多元統(tǒng)計分析相結(jié)合，有助于了解與脂多糖誘導(dǎo)的抑郁癥有關(guān)的潛在生物標志物，以及在桔梗葉治療后對生物標志物代謝偏差的調(diào)節(jié)。29種代謝產(chǎn)物，與模型組相比有顯著變化，被認為是潛在的生物標志物，可通過桔梗葉治療進行調(diào)節(jié)，提示桔梗葉對抑郁癥有治療作用，而所發(fā)現(xiàn)的代謝物可作為后續(xù)研究的潛在目標。

表1 抑郁癥小鼠尿液生物標志物表Tab.1 Urinebiomarkersof depressed mice

圖4 基于Metaboanalyst的代謝通路富集分析Fig.4 Metabolic pathway enrichment analysisbased on Metaboanalyst

圖5 抑郁癥小鼠模型尿液代謝通路圖Fig.5 Urine metabolic pathway map in mice model of depression

脂多糖誘導(dǎo)抑郁模型被廣泛應(yīng)用于抗抑郁藥物的活性評價。動物的行為[10，13]、炎癥[12-16]和氧化應(yīng)激[17]反應(yīng)都是評價抗抑郁藥作用的重要因素。體質(zhì)量、蔗糖偏好、強迫游泳實驗和尾懸實驗中的活動時間以及IL-6、TNF-α和SOD水平是常用的指標[10]。本研究證實了桔梗葉對脂多糖誘導(dǎo)抑郁癥模型的抗抑郁作用，結(jié)果表明，桔梗葉干預(yù)能顯著提高蔗糖偏好，降低促炎細胞因子TNF-α和IL-6水平，提高SOD水平。筆者推測桔梗葉的抗抑郁作用與抗炎和抗氧化活性有關(guān)。基于UPLC-Q/TOF-MS的代謝組學(xué)研究結(jié)合多元統(tǒng)計分析進一步說明了桔梗葉的抗抑郁作用。筆者發(fā)現(xiàn)了29個潛在的生物標志物，它們與抑郁癥的關(guān)系分析如下。

3.1 脂質(zhì)代謝 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，磷脂代謝（SPHM）、甘油磷脂代謝（GLYM）和亞油酸代謝（LINM）均參與了桔梗葉的治療作用，模型組血清肌醇鞘蛋白、鞘氨醇、磷酸鞘氨醇、乳糖神經(jīng)酰胺和SM均降低，提示抑郁癥可引起代謝擾動，這與先前的研究一致[18-20]。SM（d18∶0/16∶1）可誘發(fā)與神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)的突觸異常[20-21]，此類鞘脂在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含量豐富，對多種腦功能至關(guān)重要。它們的上調(diào)表明了桔梗葉的抗抑郁作用。其次，模型組膽堿類成分和溶血酶水平降低，甘油磷酸膽堿水平升高，說明代謝異常在脂多糖誘導(dǎo)的抑郁癥中起著重要作用。據(jù)報道，包括膽堿和溶血酶在內(nèi)的甘油磷酸脂與包括抑郁癥在內(nèi)的多種神經(jīng)退行性疾病有關(guān)[22-23]。膽堿是細胞膜中含量最豐富的磷脂，通過改變線粒體脂質(zhì)分布影響抑郁癥的發(fā)展[22，24]。它們的改變也表明了桔梗葉的抗抑郁作用。膽堿是亞油酸代謝的重要代謝產(chǎn)物，在抑郁癥中起著重要作用[25-26]。以往的研究表明，亞油酸及其衍生物12，13-環(huán)氧乙烷可能影響抑郁癥的發(fā)生和發(fā)展，這與筆者的研究結(jié)果一致，結(jié)果提示脂質(zhì)代謝的改變與桔梗葉的抗抑郁作用之間存在著重要的聯(lián)系。

3.2 氨基酸代謝 氨基酸在生物體的生命活動中起著至關(guān)重要的作用，色氨酸可以通過血液輸送到大腦[26]，色氨酸作為 5-羥色胺（5-HT）的前體，在抑郁癥的發(fā)展中起著重要作用[27-28]。本研究中模型組血清中色氨酸和吲哚乙醛含量顯著降低，提示色氨酸代謝失衡，色氨酸轉(zhuǎn)化率降低，從而影響小鼠體內(nèi)5-HT含量。然而，觀察到桔梗葉能阻止這兩種代謝產(chǎn)物的還原傾向，提示了桔梗葉的治療作用。

3.3 能量代謝 能量缺乏在抑郁癥的發(fā)展中發(fā)揮重要作用[29]。三羥酸循環(huán)（TCA）通過將乙酰輔酶A氧化為化學(xué)能和所有有氧生物的二氧化碳來釋放儲存的能量[30]。長期以來，乙酰輔酶A一直被認為是許多生物生化反應(yīng)不可或缺的輔助因子[31]，泛酸是輔酶A的前體，通過增加乙酰輔酶A水平、抑制炎癥和氧化應(yīng)激，可能有助于抑制抑郁過程[32]。此外，2-氧代戊二酸[33]、檸檬酸和酮戊二酸[34]也與抑郁癥有關(guān)。在本研究中，觀察到單用脂多糖刺激后，酮戊二酸、檸檬酸和泛乙胺磷酸酯的降低和泛酸的增加，這些都可以通過桔梗葉的干預(yù)產(chǎn)生改變。

3.4 其他代謝 據(jù)報道，炎癥與腫瘤和抑郁癥等多種疾病的發(fā)病有關(guān)[35-36]?；ㄉ南┧岽x在炎癥反應(yīng)的進展中起著至關(guān)重要的作用[37]，并與抑郁癥關(guān)系密切，當人體受到刺激時，花生四烯酸被水解釋放，產(chǎn)生多種活性物質(zhì)。其中，花生四烯酸經(jīng)環(huán)氧化酶產(chǎn)生白三烯A4，白三烯A4水解酶進一步轉(zhuǎn)化為白三烯B4。本研究在模型組中觀察到白三烯A4、19（S）-HETE、花生四烯酸、20-羥基丁三烯B4水平升高，說明花生酸代謝不平衡可能是抑郁癥的癥狀。同時，給藥組上述代謝物水平降低，說明桔梗葉干預(yù)了抑郁反應(yīng)，抑制了代謝紊亂。

谷胱甘肽（GSH）可以防止某些含硫醇的蛋白質(zhì)或酶受到過氧化物等氧化劑的損害[38]，研究表明，谷胱甘肽可能是疾病早期嚴重抑郁癥的潛在標志物[39]。筆者觀察到模型組GSH降低，給藥組GSH升高，這與SOD的變化趨勢一致，表明氧化應(yīng)激是抑郁癥發(fā)病的重要因素，而桔梗葉具有調(diào)節(jié)機體抗氧化的作用。肌醇被認為是一種神經(jīng)膠質(zhì)特異性標記物，前期研究報道，抑郁癥患者腦內(nèi)前額皮質(zhì)和海馬的肌醇共振降低[40]，并且在飲食中加入肌醇可以減輕抑郁[41]。本研究發(fā)現(xiàn)，抑郁小鼠血清中肌醇含量低，給予桔梗葉提取物后上調(diào)，說明桔梗葉提取物的抗抑郁作用與上述代謝調(diào)節(jié)密切相關(guān)。

綜述所述，桔梗葉提取物對抑郁小鼠具有一定的治療作用，其作用機制可能與其調(diào)節(jié)亞油酸、花生三烯醇等的代謝密切相關(guān)。