補腎化痰方影響去勢骨質疏松大鼠Leptin及β2-AR表達的實驗研究*

李章青 ，向 楠 ，周廣文，張 麟 ，張 妍 ，譚張奎，黃詩怡

（1.湖北中醫(yī)藥大學，武漢 430065；2.武漢市中西醫(yī)結合醫(yī)院，武漢市第一醫(yī)院，武漢 430022）

絕經(jīng)后骨質疏松癥是一種由于女性絕經(jīng)后雌激素水平急劇下降，導致骨重建動態(tài)平衡被打破，破骨細胞的骨吸收速度大于成骨細胞的骨形成速度，使得骨丟失加快的全身性代謝性疾病[1]。此外，研究顯示雌激素減少與脂代謝異常存在密切關系[2]。學者們發(fā)現(xiàn)，瘦素（Leptin）具有廣泛的生物學效應，參與脂代謝與骨代謝的過程，并起到至關重要的作用[3]。雌激素的水平也被證實對Leptin有影響[4]。因此，本實驗以Leptin為切入點，在建立去勢骨質疏松大鼠模型基礎上，通過Leptin對交感神經(jīng)系統(tǒng)β2腎上腺素能受體（β2-AR）的影響，進一步明確補腎化痰方防治絕經(jīng)后骨質疏松癥的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 藥物制備 補腎化痰方（菟絲子30 g，淫羊藿10g，補骨脂 15g，全瓜蔞 15 g，紅曲 12g，山楂 20 g），并在本院制劑室煎煮濃縮，生藥含量為0.94 g/mL[5]，存于4℃冰箱備用。陽性對照藥：替勃龍片（利維愛，H20051085），阿托伐他汀片（阿樂，H19990258）。

1.1.2 實驗動物 6月齡SPF級未孕雌性SD大鼠75只，體質量270～300 g，由湖北省赤壁市實驗中心提供，動物許可證號（鄂）42000600017470。在湖北中醫(yī)藥大學動物實驗中心飼養(yǎng)，所有動物飼養(yǎng)在恒溫（22～24℃）、恒濕（50%～60%）、12/12 h循環(huán)光照條件下，自由飲水、進食。定期更換墊料，保持鼠籠清潔干凈，排除環(huán)境等外界因素對實驗結果的影響。

1.1.3 實驗試劑 酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒購于武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，大鼠Leptin試劑盒（E-EL-R0582c）、雌二醇（E2）試劑盒（E-EL-0065c）；總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）測定均采用試劑盒，購于長春匯力生物技術有限公司；大鼠Leptin、β2-AR引物合成購于廣州擎科生物科技有限公司。

1.1.4 實驗儀器 微計算機斷層掃描技術（Micro-CT，skyscan 1176）、微型高速離心機（Labnet）、全自動生化分析儀（Rayto）、全自動酶標儀（Thermoscientific）、實時熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）儀（ABI7900/illuminaeco）、PCR儀（東勝創(chuàng)新生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 建立模型與分組 大鼠適應性喂養(yǎng)1周，隨機分為假手術組、模型組、補腎化痰組、利維愛組、阿托伐他汀組，每組15只，假手術組保留卵巢，僅切除卵巢周圍同等質量的脂肪組織，分層縫合傷口；其他各組行雙側卵巢切除術。經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛（30 mg/kg）麻醉，大鼠俯臥位備皮消毒，從背側正中切口，找到卵巢，結扎摘除雙側卵巢組織后縫合。術后肌注青霉素4萬U/（只·d）[6]，連續(xù)3 d，觀察大鼠傷口感染情況及精神狀況，第5周開始灌胃給藥。根據(jù)人類與動物同類藥物等效劑量的換算，補腎化痰組 0.94 g/kg，利維愛組 0.23 mg/kg[7]，阿托伐他汀組0.92 mg/kg灌胃給藥，模型組和假手術組灌以2 mL生理鹽水，每日1次，連續(xù)給藥8周。定期喂食及更換墊料，保持環(huán)境清潔干凈。

1.2.2 標本采集及生化檢測 最后1次灌胃后，禁食24 h，用水合氯醛腹腔麻醉處死，采集右心室新鮮血液。將收集的血液置于抗凝管中，于4℃凍存待用。分離大鼠股骨、脛骨周圍軟組織，將骨組織置于EP管中，存入-80℃冰箱中備用。全自動生化儀測定血清脂代謝指標，ELISA測定血清Leptin、E2濃度，在450nm波長下用酶標儀測量各孔光密度（A值），繪制標準曲線，計算實際濃度。

1.2.3 Micro-CT檢測骨密度 取出凍存的新鮮標本右側股骨，使用比利時產(chǎn)skyscan 1176型顯微骨密度檢測儀掃描右側股骨遠端測定骨量。

1.2.4 實時熒光定量PCR檢測觀察Leptin mRNA、β2-AR mRNA 將新鮮冰凍骨組織加入1mL Trizol試劑，用勻漿器研磨成漿，經(jīng)裂解、洗滌、沉淀后提取RNA，然后進行逆轉錄cDNA，逆轉錄反應體系為20μL，反應條件為：25℃5min，50℃15min，85℃5 min，4℃10 min，循環(huán)1次，對cDNA模板進行擴增（擴增引物見表1）。擴增后進行實時熒光定量PCR檢測，反應體系（共20μL）為：cDNA 4μL，F(xiàn)orward Primer 0.4 μL，Reverse Primer 0.4 μL，SYBR Green Mix 10μL，H2O 5.2μL。PCR 反應條件：95℃預變性 10 min；95℃變性30 s，60℃ 退火 30 s，循環(huán)40次。繪制溶解曲線，以β-actin的mRNA為參照，用 2-ΔΔCT計算 Leptin mRNA、β2-AR mRNA 的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學處理 運用SPSS23.0進行分析，實驗結果以均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間兩兩比較采用S-N-K檢驗，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠基本情況觀察 大鼠造模完成3 h后蘇醒，可正常飲水進食。24 h后觀察傷口無滲出紅腫，能自由活動，72 h后傷口好轉，無感染跡象。1周后大鼠傷口痊愈，縫線掉落。實驗灌胃過程中，模型組有1只死亡，補腎化痰組有2只死亡，3只大鼠均因藥液插入氣管窒息死亡。

表1 PCR測量Leptin、β2-AR的引物序列Tab.1 PCR measurement of primer sequencesfor Leptin andβ2-AR

2.2 各組大鼠的骨密度（BMD）及血清指標 與假手術組比較，模型組的BMD降低（P＜0.05），說明去勢骨質疏松癥模型建立成功。治療8周后，與假手術組比較，利維愛組、阿托伐他汀組及補腎化痰組的BMD升高（P＜0.05），說明補腎化痰方、利維愛、阿托伐他汀均具有提高去勢骨質疏松大鼠的BMD、減少骨流失的作用。與假手術組比較，模型組、利維愛組、阿托伐他汀組、補腎化痰組中血清Leptin、E2含量降低（P＜0.05）；與模型組比較，利維愛組、阿托伐他汀組、補腎化痰組中血清Leptin、E2含量升高（P＜0.05），補腎化痰組升高E2濃度優(yōu)于利維愛組，但補腎化痰組、利維愛組、阿托伐他汀組3組間比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。見表 2。

表2 各組大鼠的骨密度及血清指標結果（x±s）Tab.2 Resultsof bone mineral density and serum indexes of rats in each group（x±s）

2.3 各組大鼠脂代謝指標 全自動生化儀檢測結果顯示，與假手術組比較，模型組、利維愛組、阿托伐他汀組、補腎化痰組TC、TG、LDL-C水平升高，HDL-C水平下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，利維愛組、阿托伐他汀組、補腎化痰組TC、TG、LDL-C水平下降，HDL-C水平升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與阿托伐他汀組比較，補腎化痰方調(diào)節(jié)脂代謝水平低于阿托伐他汀組，但差異無統(tǒng)學意義（P＞0.05）。見表3。

2.4 各組大鼠骨組織中Leptin mRNA與β2-AR mRNA的表達 各組大鼠股骨中Leptin mRNA和β2-AR mRNA的表達見表4。與假手術組比較，模型組、利維愛組、阿托伐他汀組、補腎化痰組大鼠Leptin mRNA相對表達量降低，β2-ARmRNA相對表達量增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，利維愛組、阿托伐他汀組、補腎化痰組大鼠Leptin mRNA相對表達量顯著增加，β2-AR mRNA相對表達量顯著降低，且差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；補腎化痰組Leptin mRNA相對表達量高于阿托伐他汀組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠脂代謝指標結果（x±s）Tab.3 Resultsof the lipid metabolism index of ratsin each group（x±s）mmol/L

表4 各組大鼠骨組織中Leptin mRNA與β2-AR mRNA的表達（x±s）Tab.4 Expression of Leptin mRNA andβ2-AR mRNA in bonetissue of rats in each group（x±s）

3 討論

絕經(jīng)后骨質疏松癥多與雌激素水平下降有關，中醫(yī)將其歸屬于“骨痿”“骨痹”等范疇，其病機多責之于腎，故一直以來補腎作為中醫(yī)防治絕經(jīng)后骨質疏松癥的主要研究方向[8-9]。脂代謝紊亂是中醫(yī)“痰濁”的物質基礎，研究者發(fā)現(xiàn)脂代謝紊亂與絕經(jīng)后骨質疏松也存在密切的關系[10]。因此，筆者的導師向楠教授根據(jù)自己的臨床觀察，結合現(xiàn)代研究以及中醫(yī)基礎理論知識，提出了“痰濁也是導致絕經(jīng)后骨質疏松癥的重要致病因素”，制定了補腎化痰新治則，并融合《本草綱目》補骨脂丸與《丹溪心法》黃瓜蔞丸加減而成補腎化痰方，在補腎的基礎上，從“痰”論治絕經(jīng)后骨質疏松癥[11]。

西醫(yī)治療絕經(jīng)后骨質疏松癥會予以補充雌激素，但長期使用會增加患腫瘤風險[12]，限制了臨床的推廣應用，故探索中醫(yī)藥防治絕經(jīng)后骨質疏松癥成為新的熱點。本課題組研究的補腎化痰方為向楠教授臨床使用的基礎處方，該方由6味中藥組成，菟絲子為君藥，滋補肝腎、固精壯骨，淫羊藿、補骨脂兩藥相合共助菟絲子補腎填精、強腰壯骨之功，全瓜蔞清熱化痰，山楂善于消食化積，紅曲長于健脾消食。全方共奏補腎化痰，強精壯骨之功。藥理學研究發(fā)現(xiàn)，菟絲子、淫羊藿、補骨脂具有類雌激素樣作用及抗骨質疏松作用[13-14]。全瓜蔞、山楂、紅曲具有促進脂代謝、降糖降脂、調(diào)節(jié)免疫等藥理作用[15-17]。前期研究中發(fā)現(xiàn)補腎化痰方可促進骨髓間充質干細胞成骨分化，抑制其成脂分化，影響鈣磷代謝，促進骨礦化，防治骨質疏松癥[18-20]。本次實驗在前期研究基礎上進一步探索補腎化痰方通過影響Leptin介導的交感神經(jīng)系統(tǒng)β2-AR的表達水平來防治絕經(jīng)后骨質疏松癥的機制。

前期實驗分組發(fā)現(xiàn)補腎化痰方低、高劑量組對BMD及相關檢測指標差異無統(tǒng)計學意義[7]，故本次研究中未按照濃度依賴性進行分組。利維愛可降低TC及TG，防止脂質沉積，同時補充雌激素，在防治絕經(jīng)后骨質疏松癥療效顯著[21-22]。臨床研究發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀在調(diào)節(jié)脂代謝的同時可以有效改善患者骨密度水平[23]，且有實驗表明他汀類藥物對骨骼具有積極的生物學效應，能改善骨微結構，增加骨量，促進骨形成[24]。故本次實驗以利維愛和阿托伐他汀為陽性對照組，探討補腎化痰方在調(diào)節(jié)脂骨代謝方面的療效。

Leptin是一種由白色脂肪組織分泌的蛋白質類激素，骨髓腔中的脂肪組織也可分泌產(chǎn)生[25]，可誘導脂類水解。Leptin在調(diào)節(jié)骨代謝方面也發(fā)揮著日益重要的作用，它主要通過中樞下丘腦-交感神經(jīng)-β受體途徑和外周骨髓基質細胞兩種途徑進行調(diào)節(jié)[26]。研究發(fā)現(xiàn)，Leptin可增加骨密度并對骨組織具有保護作用，其作用機制與雌激素類似[27]。本次實驗結果顯示，補腎化痰方能夠增加去勢骨質疏松大鼠的骨密度，提高血清中Leptin、E2含量，調(diào)節(jié)脂代謝水平，增加骨組織中Leptin mRNA水平，可減少骨丟失，防治絕經(jīng)后骨質疏松癥。但本次實驗中發(fā)現(xiàn)補腎化痰組與利維愛組、阿托伐他汀組差異無統(tǒng)計學意義，認為補腎化痰方可同時發(fā)揮補充雌激素，調(diào)節(jié)脂代謝水平的作用，有效治療絕經(jīng)后骨質疏松癥。

交感神經(jīng)系統(tǒng)廣泛存在于人體的組織器官中，骨和骨膜分布較為豐富，發(fā)揮著生物學效應，對骨的調(diào)節(jié)主要是通過交感神經(jīng)系統(tǒng)β2腎上腺素能受體來抑制骨形成[26]。Fateme等[28]通過對100多篇文章的回顧性分析總結出交感神經(jīng)系統(tǒng)的腎上腺素能活性是骨量的負性調(diào)節(jié)因子。與此同時，交感神經(jīng)系統(tǒng)也是Leptin中樞調(diào)控骨形成的下游媒介，Leptin通過作用于成骨細胞的β2-AR，抑制成骨細胞的增生，降低骨量，最終引起絕經(jīng)后骨質疏松癥的發(fā)生[29]。本次結果顯示，補腎化痰方能夠通過Leptin mRNA的表達水平，來抑制β2-ARmRNA的水平表達，抑制交感神經(jīng)系統(tǒng)的活性，促進成骨細胞的增殖分化，增加骨量。

因此，通過本次實驗研究可以推測出補腎化痰方通過激活Leptin及β2-AR途徑，進而補充雌激素，調(diào)節(jié)脂代謝，促進成骨分化，抑制成脂分化，來防治絕經(jīng)后骨質疏松癥，這是可能的作用機制之一，但是目前只是從實驗中得出的推斷結論，對于補腎化痰方防治絕經(jīng)后骨質疏松癥的具體機制及臨床研究還有待進一步深入探索。