氣相色譜法快速測定疏血通注射液中乙酸、丙酸、丁酸的含量*

李靈云 ，倪開嶺，李 敏 ，韓立峰 ，楊 靜，柴 欣 ，王躍飛

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室，天津 301617；2.牡丹江友搏藥業(yè)有限責(zé)任公司，牡丹江 157011）

心腦血管疾病已經(jīng)成為威脅人類健康的主要疾病，具有高發(fā)病率、高致殘率、高病死率的特點[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計，2008年全球死于心腦血管疾病的人數(shù)高達(dá)1 730萬人，占全球死亡人數(shù)的30%。到2030年全球預(yù)計將有2 360萬人死于心腦血管疾病[2]。中國心腦血管疾病形勢也日益嚴(yán)峻，自1990年以來中國心腦血管疾病患者逐年遞增，2013年心腦血管病死率占全國總病死率的40.7%，2010至2030年僅考慮人口增長因素，中國的心腦血管疾病發(fā)生率將持續(xù)增加[3]。面對日益增加的心腦血管疾病患者，尋找安全有效的防治藥物和治療方法已成為心腦血管疾病防治的迫切要求。

中醫(yī)藥在防治心腦血管疾病方面具有獨特優(yōu)勢，川芎、紅花、水蛭等活血化瘀類中藥及其復(fù)方制劑在治療心腦血管疾病方面具有良好的臨床療效[4]。疏血通注射液是由水蛭和地龍制成的一種主要應(yīng)用于急性腦卒中的中藥注射劑，水蛭作為傳統(tǒng)中藥，具有破血通經(jīng)，逐瘀消癥的功效，臨床主治心腦血管疾病，包括急性心肌梗死、冠心病心絞痛、高血壓、腦出血、腦梗死等，化學(xué)成分包括多肽、氨基酸、糖脂、碟啶、甾體及羧酸酯等化合物[5-6]。地龍性寒、味咸，具有痛經(jīng)活絡(luò)、平肝息風(fēng)、清熱止驚的功效，研究報道地龍具有抗炎鎮(zhèn)痛、降脂、抑制血小板聚集等作用，化學(xué)成分主要包括蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、有機酸類、核苷等化合物[7-8]。

短鏈脂肪酸（SCFAs）主要由腸道微生物代謝碳水化合物及蛋白質(zhì)形成，分為直鏈型[甲酸（FA）、乙酸（AA）、丙酸（PA）、丁酸（BA）、戊酸（VA）、己酸（HA）]與支鏈型[異丁酸（i-BA）、異戊酸（i-VA）][9]。研究發(fā)現(xiàn)短鏈脂肪酸與高血壓、高血脂、高血糖以及動脈粥樣硬化等心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展聯(lián)系密切[9-12]。乙酸、丙酸、丁酸占人體中短鏈脂肪酸的95%以上[13]，其具有明顯的活性，發(fā)揮重要的生理作用。乙酸可通過短鏈脂肪酸受體FFAR2影響胰島素的分泌，丙酸具有抗炎、降脂、降低血糖的生理作用，丁酸可預(yù)防和抑制結(jié)腸癌，具有降血糖，降低膽固醇的作用[14-16]。研究發(fā)現(xiàn)疏血通注射液中含有大量的乙酸、丙酸、丁酸，因此有必要對疏血通注射液中的乙酸、丙酸、丁酸進(jìn)行檢測分析，為更好的控制疏血通注射液的質(zhì)量提供依據(jù)。

短鏈脂肪酸的分析方法較多，如氣質(zhì)聯(lián)用法（GC-MS）、液質(zhì)聯(lián)用法（LC-MS）、毛細(xì)管電泳法（CE）等[17-19]。由于短鏈脂肪酸無紫外吸收且極易揮發(fā)，采用液相色譜法、毛細(xì)管電泳法串聯(lián)紫外檢測器測定時，樣品需進(jìn)行衍生化處理，操作過程繁瑣、耗時較長，與氣質(zhì)聯(lián)用法相比，使用氣相色譜法測定疏血通注射液中短鏈脂肪酸更加方便快捷[19-21]。采用氣相色譜法直接測定疏血通注射液中乙酸、丙酸、丁酸，無需衍生化，方法簡單、快速、準(zhǔn)確、專屬性強、靈敏度高、重現(xiàn)性好，可以準(zhǔn)確有效的分析疏血通注射液中乙酸、丙酸、丁酸含量。

1 儀器與材料

GC-7890B氣相色譜儀（美國Agilent公司）；DB-FFAP毛細(xì)管柱（30.00 m×0.25 mm×0.25μm；美國Agilent公司）；XS205十萬分之一電子天平、AL204萬分之一電子天平（瑞士METTLERTOLEDO公司）；SB25-12DTN超聲波清洗器（寧波新芝科技有限公司）；XH-C振動攪拌器（金壇市醫(yī)療儀器廠）。

無水乙醇、濃鹽酸（天津大茂化學(xué)試劑廠），超純水（美國Millipore超純水制備系統(tǒng)），對照品乙酸（批號：BCBL0846V）、丙酸（批號：BCBK5018V）、丁酸（批號：BCBH0489V）、2-乙基丁酸對照品（批號：STBD2230V）均購自美國Sigma-Aldrich公司。36批疏血通注射液（2 mL/支）與水蛭、地龍藥材均來自牡丹江友博藥業(yè)股份有限公司。

2 方法

2.1 對照品溶液的制備 取乙酸、丙酸、丁酸對照品適量，精密稱定，分別置于10mL容量瓶中，加75%乙醇溶液定容，得到對照品儲備液，濃度分別為乙酸10.63 mg/mL、丙酸 3.192 mg/mL、丁酸 1.739 mg/mL；取2-乙基丁酸（2-eBA）對照品適量，精密稱定，置于100 mL容量瓶中，以75%乙醇進(jìn)行定容，得濃度為628.7μg/mL的內(nèi)標(biāo)儲備液，置于4℃冰箱中備用。

分別取各對照品及內(nèi)標(biāo)儲備液適量，于10 mL容量瓶中，加濃鹽酸100μL，以75%乙醇溶液定容，得到混合對照品溶液，濃度分別為乙酸1 063.3μg/mL、丙酸 240.0μg/mL、丁酸 150.0μg/mL、2-乙基丁酸22.0μg/mL，并采用75%乙醇溶液（含1%鹽酸，2-乙基丁酸22.0μg/mL）1∶1逐級稀釋成一系列不同濃度的混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液的配制 疏血通注射液樣品0.5 mL置于離心管中，加1.5 mL 1.5%鹽酸乙醇溶液（含內(nèi)標(biāo)2-乙基丁酸29.5μg/mL），混勻，作為供試品溶液。

水蛭、地龍粉末各0.5 g置于10 mL容量瓶中，加1%鹽酸乙醇溶液振搖，混勻，作為水蛭、地龍供試品溶液。

2.3 色譜條件 色譜柱：DB-FFAP彈性石英毛細(xì)管柱；升溫程序：初始溫度50℃保持1 min，以15℃/min升至120℃后保持6 min，以7℃/min升至135℃保持1 min，以100℃/min升至230℃后保持3 min，進(jìn)樣口溫度：240℃，檢測器（FID）溫度：240℃，進(jìn)樣體積：3 μL，分流比：10∶1，載氣：高純氮氣（N2），純度＞99.999%，流速1.0 mL/min，尾吹氣：高純氮氣（N2），純度＞99.999%，流速25 mL/min，氫氣流速30 mL/min，空氣流速400 mL/min。

3 結(jié)果與討論

3.1 方法學(xué)驗證 取“2.1”項下配制的一系列不同濃度的混合對照品溶液，按照“2.3”項下色譜條件進(jìn)樣分析。記錄色譜峰峰面積，以對照品濃度X（μg/mL）為橫坐標(biāo)，以各化合物峰面積（AST）與內(nèi)標(biāo)物峰面積（AIS）比值為縱坐標(biāo)，繪制各對照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程和相關(guān)系數(shù)，以信噪比S/N=3、S/N=10分別測定各化合物的檢測線和定量限。研究結(jié)果表明：乙酸、丙酸、丁酸在其線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999 9，結(jié)果見表1。

按照“2.2”項下方法制備疏血通注射液供試品溶液，進(jìn)行日內(nèi)精密度、日間精密度（每日分別制備供試品溶液）、重復(fù)性和穩(wěn)定性實驗。日內(nèi)精密度RSD均小于2.4%，日間精密度RSD均小于0.66%，重復(fù)性實驗表明：疏血通注射液中乙酸含量211.70μg/mL，丙酸含量70.20μg/mL，丁酸含量25.60μg/mL，RSD均小于1.3%；各化合物在室溫條件下8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，RSD均小于2.3%，結(jié)果見表1。

在此基礎(chǔ)上，開展疏血通注射液中乙酸、丙酸、丁酸含量測定的加樣回收率實驗。取疏血通注射液250μL，加入與樣品中乙酸、丙酸、丁酸量相當(dāng)?shù)膶φ掌啡芤?00μL（含乙酸106.4μg/mL、丙酸28.73μg/mL、丁酸24.35μg/mL），加入75%乙醇（含2%鹽酸，內(nèi)標(biāo)2-乙基丁酸35.20μg/mL）1.25 mL，混勻，按照“2.3”項下色譜條件分析，乙酸、丙酸、丁酸平均加樣回收率為96.45%～103.70%，RSD均小于4.2%，結(jié)果見表2。

3.2 疏血通注射液中乙酸、丙酸、丁酸的含量分析 采用建立的氣相色譜-氫焰離子化檢測器方法分析了疏血通注射液中乙酸、丙酸、丁酸，氣相色譜圖見圖1，結(jié)果顯示各酸分離良好，空白溶劑對其測定無干擾，原料藥水蛭、地龍樣品中均含有乙酸、丙酸、丁酸。對36批疏血通注射液進(jìn)行含量測定，結(jié)果如表3所示，疏血通注射液中乙酸含量為382.2～544.6μg/支，丙酸含量為90.92～217.5μg/支；丁酸含量為39.74～64.27μg/支；乙酸、丙酸、丁酸的總含量為545.8～815.8μg/支。3種短鏈脂肪酸中乙酸相對含量最高，丙酸次之，丁酸最低，各酸含量差異較大，3種酸總含量相對穩(wěn)定。

表1 乙酸、丁酸、丙酸的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢測限、定量限、線性范圍、精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性結(jié)果Tab.1 Linear equation，correlation coefficient，detection limit，quantification limit，linear range，precision，repeatability and stability of acetic acid，propionic acid and butyric acid

表2 疏血通注射液乙酸、丙酸、丁酸測定的加樣回收率實驗結(jié)果Tab.2 Recovery test resultsof acetic acid，propionic acid and butyric acid in Shuxuetong Injection

圖1 空白溶劑（A）、疏血通樣品（B）、混合對照品溶液（C）、地龍樣品（D）、水蛭樣品（E）的氣相色譜圖Fig.1 Gas chromatograms of blank solution(A)，sample solution of Shuxuetong Injection(B)，mixed standards solution(C)，earthworm samples(D)，leech samples(E)

2015年版中國藥典一部附錄水蛭藥材為螞蟥、水蛭和柳葉螞蟥的干燥全體，地龍藥材為參環(huán)毛蚓、通俗環(huán)毛蚓、威廉環(huán)毛蚓和櫛盲環(huán)毛蚓除去內(nèi)臟的干燥體[22]。疏血通注射液由水蛭與地龍?zhí)崛?、精制而成，將水蛭、地龍藥材分別置于0.9%氯化鈉溶液中浸漬24 h絞碎研磨制成勻漿，勻漿液反復(fù)凍融、離心，分取上清液，超濾柱粗濾，濾液熱壓處理得水蛭、地龍?zhí)崛∫?，提取液混勻超濾，除菌，分裝即可。

表3 不同批次疏血通注射液中乙酸、丙酸、丁酸含量測定結(jié)果Tab.3 Determination resultsof acetic acid，propionic acid and butyric acid in different batchesof Shuxuetong Injection μg/2 mL

疏血通注射液在制備過程中未引入含乙酸、丙酸、丁酸的試劑，而水蛭與地龍藥材的氣相分析結(jié)果顯示兩種藥材中均含有乙酸、丙酸、丁酸，因此推斷疏血通注射液中的乙酸、丙酸、丁酸源自水蛭和地龍。

綜上所述，本研究建立的疏血通注射液中乙酸，丙酸，丁酸的含量測定方法簡便、快速、靈敏，為更好的控制該注射液的質(zhì)量提供了依據(jù)，也為中藥注射液的質(zhì)量控制研究提供了參考。