,*

(1.揚州大學(xué),江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點實驗室,江蘇揚州 225127; 2.廣西水牛乳工程技術(shù)研究中心,廣西南寧 530000; 3.丹陽市康力乳制品有限公司,江蘇鎮(zhèn)江 212000)

隨著人們保健意識的增強,乳酸菌作為有益菌被深入研究并廣泛添加于各種食品中,如保健食品、醫(yī)藥等。真空冷凍干燥法是一種能較好保持發(fā)酵劑活力的方法,但貯藏過程中多種因素可能會引起細胞壁、細胞膜結(jié)構(gòu)和DNA等的變化,從而導(dǎo)致乳酸菌的活菌數(shù)下降,發(fā)酵活力降低甚至是失活[1-3]。

研究表明影響凍干發(fā)酵劑貯藏期菌體活力的因素包括發(fā)酵劑的制備方法、保護劑的成分、貯藏溫度、水分含量、貯藏環(huán)境中的相對濕度、氧含量等[4-10]。發(fā)酵劑制備的干燥方法有低溫干燥法、噴霧干燥法、真空冷凍干燥法。其中,低溫干燥法和噴霧干燥法制備的發(fā)酵劑活菌含量低,而真空冷凍干燥法制備的發(fā)酵劑活化后不僅活菌數(shù)量高[11-13],還便于貯藏和運輸。貯藏溫度是影響發(fā)酵劑活力的關(guān)鍵因素之一,Simpson等[14]將噴霧干燥的雙歧桿菌放在15和25 ℃貯藏時,觀察到所有雙歧桿菌的活力顯著下降,而在4 ℃貯藏能長期保持活力;Pedroso等[15]的研究表明,微膠囊化的益生菌在20 ℃貯藏時極不穩(wěn)定;在7 ℃貯藏90 d后,細胞存活率只有20%;在-80 ℃貯藏90 d,細胞存活率保持在81.1%;馬振興[16]將嗜酸乳桿菌菌粉真空袋裝后置于室溫和4 ℃下保藏180 d,發(fā)酵劑活菌數(shù)下降1～5個數(shù)量級不等,而在-18 ℃貯藏180 d,發(fā)酵劑活菌數(shù)數(shù)量級均保持1011cfu/g不變。因此,發(fā)酵劑的貯藏溫度對發(fā)酵劑的活力有著顯著的影響。

發(fā)酵乳桿菌grx07是從江蘇如皋長壽村人群腸道中分離獲得,前期的研究表明其具有顯著降低慢性酒精性肝損傷,對慢性酒精肝損傷有很好的保護作用;此外,還具有顯著體外抗氧化能力和抑制致病菌能力[17]。通過高密度發(fā)酵及真空凍干法已經(jīng)獲得高活菌數(shù)的grx07發(fā)酵劑,為研究貯藏溫度對grx07發(fā)酵劑活力的影響,本試驗主要從活菌數(shù)、水分活度、存活率、發(fā)酵活力、乳酸脫氫酶、β-半乳糖苷酶及ATP酶的活力等方面研究不同貯藏溫度對grx07發(fā)酵劑活力的影響,為發(fā)酵乳桿菌grx07發(fā)酵劑的開發(fā)提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

發(fā)酵乳桿菌grx07 江蘇如皋長壽村人群腸道中分離獲得(樣本來自92歲健康男性);脫脂乳 新西蘭;MRS液體培養(yǎng)基、MRS固體培養(yǎng)基 青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司;ATP試劑盒 南京建成生物科技有限公司;其他試劑 分析純,國藥集團。

JF-SX-500型全自動滅菌鍋 日本TOMY公司;DNP-9272型培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司;FreeZone 18L凍干機 美國LABCONCO公司;DZ400-ZD型真空包裝機 上海余特包裝機械制造有限公司;LabSwift-aw水分活度測試儀 瑞士novasina;5804R型高速冷凍離心機 德國Eppeendorf公司;Multiskan go酶標儀 美國Thermo Electron公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 凍干發(fā)酵劑的制備 保護劑的配比為脫脂乳12.71%,蔗糖11.88%,谷氨酸鈉4.22%,甘油2.95%滅菌。無菌環(huán)境下保護劑和發(fā)酵劑按照體積比以1∶1的比例混勻,制成細胞懸液,放入-80 ℃冰箱預(yù)凍后在真空凍干機中凍干,凍干好的發(fā)酵劑粉碎后用錫箔袋真空包裝,分別置于20 ℃貯藏5個月,置于4、-20 ℃貯藏12個月,1～3月每半月取樣,4～12月則每月取樣分別測定發(fā)酵劑的活菌數(shù)、存活率、水分活度、發(fā)酵活力和關(guān)鍵酶活。

1.2.2 發(fā)酵劑活菌數(shù)及存活率的測定 活菌數(shù)的測定:參照國標GB 4789.35-2016[18]的方法測定發(fā)酵劑的活菌數(shù)。菌體凍干前后存活率按下式計算:

式中:μ表示菌體存活率,%;A表示未預(yù)凍或未凍干前活菌數(shù),cfu/mL;B表示預(yù)凍后或凍干后的活菌數(shù),cfu/mL。

1.2.3 水分活度的測定 用全自動水分活度儀測定乳酸菌凍干后的水分活度。

1.2.4 發(fā)酵劑發(fā)酵活力的測定 通過測定發(fā)酵劑發(fā)酵脫脂乳產(chǎn)酸pH來反應(yīng)發(fā)酵劑的發(fā)酵活力,將三種溫度下貯藏的凍干發(fā)酵劑以12%(m/m)比例接至脫脂乳中,37 ℃培養(yǎng)6 h后,利用pH計測定發(fā)酵乳的pH。

1.2.5 關(guān)鍵酶活的測定

1.2.5.1 粗酶液的制備 移取凍干后的菌粉溶于10 mL無菌生理鹽水,用生理鹽水清洗兩次后,用10 mL的含2 mmol/L EDTA的磷酸鹽緩沖溶液重懸菌體。取5 mL于試管中進行冰浴超聲破碎,超聲時溫度不超過4 ℃,超聲功率為25 W持續(xù)5 s,間隙5 s,循環(huán)90次,破碎15 min。破碎后在4 ℃,9000 r/min的條件下離心12 min,取上清液,即為粗酶液,用于相關(guān)酶活的測定。

1.2.5.2β-半乳糖苷酶活力的測定 繪制標準曲線:配制1 μmol/mL的ONP(鄰硝基酚)溶液,取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL,用pH7.0的磷酸鹽緩沖溶液補足體積至1.0 mL,37 ℃水浴10 min后立刻加入的0.5 mol/L的Na2CO3溶液4 mL,第一個為空白,測定溶液的OD420 nm。以O(shè)NP含量為橫坐標,OD420 nm為縱坐標,繪制標準曲線。

β-半乳糖苷酶活性測定:以O(shè)NPG為底物,在β-半乳糖苷酶的作用下生成黃色產(chǎn)物ONP,于420 nm處測得吸光值,通過標曲找到對應(yīng)濃度,按照稀釋倍數(shù)換算成最終酶活。酶活具體測定方法:取1.00 mL酶液,37 ℃水浴10 min,加入1.00 mL pH為7.0的PBS(含20 mmol/L ONPG)緩沖液,37 ℃水浴10 min后立即加入3.00 mL的0.50 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)并立即測定吸光度。

式中:W表示β-半乳糖苷酶活力,U;A表示從標曲上查到的ONP濃度,μmol/mL;B表示反應(yīng)時間,min;C表示取樣體積,mL;D表示樣品蛋白濃度,mg/mL。

1.2.5.3 乳酸脫氫酶活力的測定 參照文獻[19]測定乳酸脫氫酶活力,反應(yīng)體系為0.2 mol/L的Tris-HCl緩沖液(pH7.30),30 mmol/L的丙酮酸鈉,及6.6 mmol/L的NADH共3 mL,預(yù)熱至25 ℃后加入0.1 mL粗酶液反應(yīng),立即在340 nm處測定吸光值,每30 s讀取一次,連續(xù)5 min,計算每分鐘降低的吸光值,按照下面公式計算酶活力:

式中,V總:反應(yīng)總體積,mL;V樣:樣品體積,mL;ΔOD340 nm:每分鐘光密度的降低值;6.22:毫摩爾消光系數(shù)。

1.2.5.4 ATP酶活力的測定 按照試劑盒說明的方法測定Ca2+-ATP、Mg2+-ATP、Na+K+-ATP酶活力。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗中每個處理重復(fù)三次,采用SPSS 25和Origin 2018進行數(shù)據(jù)分析及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 貯藏溫度對發(fā)酵劑活菌數(shù)及存活率的影響

將真空冷凍干燥制得的發(fā)酵劑grx07置于20 ℃保藏5個月,置于4和-20 ℃保藏12個月,貯藏期間的活菌數(shù)及存活率的變化情況如圖1所示,可以看出grx07在20 ℃貯藏時活菌數(shù)快速下降,2個月時低于1×1011cfu/g,3個月后存活率低于1%;在4 ℃貯藏時,活菌數(shù)緩慢下降,6個月時,存活率為20%,活菌數(shù)為1.50×1011cfu/g,12個月時,活菌數(shù)僅為存活率僅為4.45%左右;在-20 ℃貯藏時,活菌數(shù)變化不明顯,12個月時,存活率保持在51.05%,活菌數(shù)為3.78×1011cfu/g,說明-20 ℃貯藏能較好的保持發(fā)酵劑grx07的活菌數(shù)數(shù)量。

圖1 不同溫度下發(fā)酵劑貯藏期間 活菌數(shù)(a)及存活率(b)的變化Fig.1 Changes of viable counts(a)and survival rate(b) during storage of starter at different temperatures

2.2 貯藏溫度對發(fā)酵劑水分活度變化的影響

本次實驗制得的凍干發(fā)酵劑grx07測得初始水分含量為1.58%±0.07%,水分活度為0.12,處于較好的狀態(tài)。將發(fā)酵劑置于20 ℃保藏5個月,4和-20 ℃保藏12個月,貯藏期間測得其水分活度的變化結(jié)果如圖2。在三種貯藏溫度下,隨著時間的延長,grx07的水分活度呈上升趨勢,其中在20 ℃貯藏的grx07的水分活度上升最快,3個月時水分活度大于0.23;在4 ℃貯藏時12個月菌粉水分活度為0.28;在-20 ℃貯藏12個月的菌粉水分活度為0.21。

圖2 不同溫度下發(fā)酵劑貯藏期間水分活度的變化Fig.2 Changes of water activity during storage of starter at different temperatures

2.3 貯藏溫度對乳酸菌發(fā)酵活力的影響

發(fā)酵活力是發(fā)酵劑的重要指標,可通過測定發(fā)酵劑的代謝產(chǎn)物來判斷發(fā)酵劑的活力,發(fā)酵乳桿菌grx07的代謝產(chǎn)物主要為乳酸,因此通過測定發(fā)酵乳的pH來判斷發(fā)酵劑的活力,在相同的發(fā)酵時間內(nèi),發(fā)酵乳的測定pH越低,說明發(fā)酵劑代謝產(chǎn)酸能力越強,發(fā)酵活力越高,反之則越低。將不同貯藏溫度不同貯藏時間下的發(fā)酵劑進行發(fā)酵試驗,測定對應(yīng)的發(fā)酵乳的pH,結(jié)果如圖3所示,可以看出隨著貯藏時間的延長,三種貯藏溫度下發(fā)酵劑的發(fā)酵乳pH都在升高,說明發(fā)酵劑的活力在降低;在20 ℃貯藏3個月時發(fā)酵劑發(fā)酵乳的pH升高至6.00,發(fā)酵劑的活力降低最快;在4 ℃貯藏時前4個月發(fā)酵pH保持在4.00以下,12個月后發(fā)酵pH升高至4.83,發(fā)酵活力較低;-20 ℃貯藏12個月發(fā)酵pH保持在4.30,說明低溫能較好的保證發(fā)酵劑grx07長期貯藏的發(fā)酵活力。

圖3 不同溫度下發(fā)酵劑貯藏期間發(fā)酵活力的變化Fig.3 Changes of fermentation vigor during fermentation of fermenting agent at different temperatures

2.4 貯藏溫度對grx07發(fā)酵活力相關(guān)酶活性的影響

2.4.1 貯藏溫度對β-半乳糖苷酶活力的影響 不同貯藏溫度條件下測定grx07中β-半乳糖苷酶的酶活,結(jié)果如圖4所示,三種溫度下貯藏的grx07的β-半乳糖苷酶活力隨貯藏時間的延長都有不同程度的下降;其中在20 ℃貯藏的β-半乳糖苷酶在貯藏2個月后迅速下降,5個月時活力下降到0.68 U,僅保持了初始酶活的8.1%;在4和-20 ℃貯藏12個月時,酶的活力變化不大,分別為5.58和7.28 U,保持在較高水平。

圖4 不同溫度下發(fā)酵劑貯藏期間 β-半乳糖苷酶活力的變化Fig.4 Changes of β-galactosidase activity during storage of starter at different temperatures

2.4.2 貯藏溫度對乳酸脫氫酶活力的影響 將發(fā)酵劑置于20 ℃保藏5個月，在4和-20 ℃保藏12個月,測定發(fā)酵劑grx07乳酸脫氫酶活力在貯藏器期間的變化,結(jié)果如圖5所示,隨著貯藏時間的延長,三種溫度下grx07中的乳酸脫氫酶的活力下降;但在20 ℃貯藏時乳酸脫氫酶活力下降較快,3個月時僅剩50%;而在4和-20 ℃貯藏12個月時乳酸脫氫酶活力保持較好,分別為2.2和2.6 U,說明低溫條件下能較好保留酶活。

圖5 不同溫度下發(fā)酵劑貯藏期間乳酸脫氫酶活力的變化Fig.5 Changes of lactate dehydrogenase activity during storage of starter at different temperatures

2.5 貯藏溫度對乳酸菌ATP酶活力的影響

發(fā)酵劑grx07 ATP酶活力在貯藏器期間的變化如圖6所示,ATP酶(Na+-K+-ATP、Mg2+-ATP、Ca2+-ATP酶)在三種貯藏溫度下都有不同程度的降低,其中在20 ℃貯藏時酶活力下降最快,貯藏5個月時Na+-K+-ATP、Mg2+-ATP、Ca2+-ATP三種酶活力僅保持了初始的29.87%、49.02%、21.31%;在4 ℃貯藏時活力下降較慢,貯藏12個月時,Na+-K+-ATP、Mg2+-ATP、Ca2+-ATP三種酶的活力分別保存50%以上的初始酶活;而在-20 ℃貯藏12個月時酶活力則保持70%以上的初始酶活。

圖6 不同溫度下發(fā)酵劑貯藏其間Na+-K+-ATP酶(a)、 Mg2+-ATP酶(b)、Ca2+-ATP酶(c)酶活力的變化Fig.6 Changes of Na+-K+-ATPase(a),Mg2+-ATPase(b) and Ca2+-ATPase(c)activity in fermentation agents stored at different temperatures

3 討論與結(jié)論

真空冷凍發(fā)酵劑需具有活菌數(shù)高、貯存時間長,菌種穩(wěn)定等特點。然而,在貯藏期間,貯藏溫度[14-16]、水分含量[20-21]、貯藏環(huán)境中的相對濕度[22]、氧含量[23-24]等均可以影響發(fā)酵劑的活力。而本實驗以發(fā)酵劑grx07的存活率、活菌數(shù)、水分活度、發(fā)酵活力及影響乳酸菌代謝活力的關(guān)鍵酶活為指標,測定20、4、-20 ℃三種不同貯藏溫度發(fā)酵劑grx07活力的影響。

研究表明,儲藏期間的發(fā)酵劑存活率與儲存溫度成負相關(guān),發(fā)酵劑grx07在-20 ℃貯藏12個月的存活率最高,活菌數(shù)保持在3.78×1011cfu/g,在此溫度下,發(fā)酵劑水分活度在貯藏期內(nèi)上升較慢。水分活度是影響發(fā)酵劑穩(wěn)定性的重要原因,Mille等[25]的實驗數(shù)據(jù)顯示細胞含水量與細胞存活率成正相關(guān)。而Kurtmann等[26]發(fā)現(xiàn)凍干發(fā)酵劑的水分活度在0.11～0.22之間時菌體存活率較高,當水分活度大于0.22時,易發(fā)生氧化或褐變,對細胞造成一定的損害,導(dǎo)致貯藏性降低。發(fā)酵劑grx07在凍干過程中,會脫去自由水和部分結(jié)合水,細胞進入休眠期,但在貯藏過程中,逐漸吸收環(huán)境中的水分,使水分活度上升,但在-20 ℃貯藏12個月后水分活度仍低于0.21。

發(fā)酵劑的發(fā)酵活力是發(fā)酵劑活菌數(shù)之外的另一個用于衡量凍干發(fā)酵劑能否直接用于生產(chǎn)的重要指標。利用不同溫度貯藏下的發(fā)酵劑制備發(fā)酵乳,-20 ℃貯藏12個月后發(fā)酵活力最好且顯著高于20 ℃貯藏的發(fā)酵活力,與菌種發(fā)酵活力相關(guān)的酶主要有乳酸脫氫酶、β-半乳糖苷酶及ATP酶,其中乳酸脫氫酶是乳酸菌利用碳源將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸的關(guān)鍵酶,其活力大小是影響乳酸菌產(chǎn)酸能力的因素之一,β-半乳糖苷酶是乳酸菌乳糖代謝過程的關(guān)鍵酶,能將乳糖分解為半乳糖和葡萄糖,其活力高低是反應(yīng)發(fā)酵劑活力高低的因素之一,而ATP酶對維持細胞生理功能有著非常重要的作用,分為三種,Na+-K+-ATP是細胞質(zhì)膜雙分子層中的一種蛋白質(zhì),具有載體和酶的作用,催化ATP水解供能,維持細胞膜兩側(cè)的膜電位、調(diào)節(jié)細胞滲透壓,為營養(yǎng)物質(zhì)的吸收提供動力等方面起著重要作用;Ca2+-ATP酶和Mg2+-ATP酶是另兩種重要的膜酶,主要功能是調(diào)節(jié)細胞內(nèi)Ca2+和Mg2+的濃度[27],因此乳酸菌ATP酶活力大小對乳酸菌活力有著重要的影響。發(fā)酵劑grx07乳酸脫氫酶和β-半乳糖苷酶在貯藏期內(nèi)都呈下降的趨勢,但在-20 ℃貯藏酶12個月活力仍保持在80%以上。三種ATP酶在三種貯藏溫度下都有不同程度的降低,其中在20 ℃貯藏時酶活力下降最快,而在-20 ℃貯藏12個月時酶活力則保持70%以上的初始酶活。因此,發(fā)酵劑在-20 ℃貯藏保持較高活力可能是因為低溫酶變性緩慢,使發(fā)酵活力相關(guān)的酶在貯藏期間仍具有較高的活力。

本研究表明貯藏溫度越低,在較長的貯藏時間內(nèi),發(fā)酵劑活力保持相對越高。貯藏期內(nèi)保持高活性是真空冷凍發(fā)酵劑用于生產(chǎn)的一個必須環(huán)節(jié),但發(fā)酵劑貯藏期活力的變化是多因素相互作用的結(jié)果,因此,在本研究的基礎(chǔ)上,還需要對貯藏期影響發(fā)酵劑活力的其他因素如水分含量、貯藏環(huán)境中的相對濕度、氧含量等進行進一步的系統(tǒng)研究。