,*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830000; 2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所,新疆烏魯木齊 830000)

近些年來,心腦血管疾病已成為危害人類健康最嚴(yán)重的疾病之一,發(fā)病率呈逐年上升的趨勢,血脂濃度升高會(huì)增加心腦血管疾病患者的死亡率。通過飲食方式降低血脂濃度,預(yù)防心腦血管疾病的發(fā)生,引起了人們的廣泛關(guān)注[1-3]。因此,更為健康的天然物質(zhì)的活性成分已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)之一。已有研究證實(shí),多糖的降血脂作用溫和,毒副作用小,對高脂血癥人群具有良好功效[4]。

多糖是由10個(gè)以上單糖分子通過糖苷鍵連接形成的天然高分子化合物,具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、抗氧化、抗腫瘤、抗疲勞、抗癌、抗菌、防輻射和降糖脂等生理活性[5-9]。多糖來源和提取方式的不同,其功能功效也有所不同。目前,對多糖的提取方法主要有溶劑提取法[10]、超聲輔助法[11]、微波輔助提取法[12]和酶提取法[13]等。與其它方法相比,超聲輔助法具有強(qiáng)烈的空化效應(yīng),增加溶劑穿透力,加快多糖溶出速度,既能提高提取率,又不破壞其生物活性。

籽瓜(Citrulluslanatussp.Convarvar.MegulaspemusL.),又名打瓜,主要分布于我國新疆、甘肅、東北及內(nèi)蒙古東部等地區(qū)[14]。籽瓜是新疆重要的經(jīng)濟(jì)作物之一,在農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整中占有重要地位,種植面積有21萬公頃,產(chǎn)量已達(dá)30萬噸[15]。籽瓜主要是以取籽加工為主,瓜皮瓜瓤丟棄在田間,造成巨大的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。籽瓜取籽加工后的副產(chǎn)物籽瓜汁、籽瓜瓤和籽瓜瓜皮的再利用,不僅能提高籽瓜的經(jīng)濟(jì)價(jià)值,還能減少環(huán)境污染。如何提高籽瓜加工副產(chǎn)物的綜合利用率,增加附加值降低生產(chǎn)成本,是決定籽瓜加工業(yè)進(jìn)一步提升的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。因此,需要對籽瓜有益成分的提取和加工進(jìn)行深入研究,評價(jià)籽瓜皮渣中有益成分的功能。籽瓜加工副產(chǎn)物中含有多糖、果膠、維生素、氨基酸等多種營養(yǎng)物質(zhì),其中籽瓜多糖的研究主要集中在抗氧化生物活性方面[16],降血脂活性的研究卻鮮有報(bào)道。研究籽瓜中的多糖降血脂活性,驗(yàn)證籽瓜多糖的食藥作用是提高籽瓜加工副產(chǎn)物利用率的研究方向之一。

本文以新疆籽瓜為試材,優(yōu)化籽瓜多糖超聲輔助的提取工藝,分析考察籽瓜多糖的降血脂作用,并與其他提取物的膽酸鹽結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果作比較,探討籽瓜多糖的降血脂效果,為籽瓜副產(chǎn)物精深加工和多糖的降血脂功效的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

籽瓜 2018年8月采摘于新疆昌吉籽瓜種植園;石油醚、無水乙醇、氫氧化鈉、硫酸、鹽酸 天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司;胃蛋白酶(1∶3000)、胰蛋白酶(1∶250)、?；悄懰徕c、甘氨膽酸鈉 上海源葉生物科技有限公司。

KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;LGJ-25C冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司;RE100-Pro旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 美國SCILOGEX公司;SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司;0DD150FL高效熱泵除濕干燥機(jī) 廣州晟啟能源設(shè)備有限公司;Centrifuge 5810R大容量離心機(jī) 艾本德公司;ML204/2電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;UV-2600型紫外-可見分光光度計(jì) 島津企業(yè)管理(中國)有限公司;THZ-98AB恒溫振蕩器 上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 籽瓜干粉的制備 將籽瓜原材料去翠衣皮,切塊,去籽,留瓜瓤,經(jīng)40 ℃低溫干燥48 h后粉碎,經(jīng)100目篩網(wǎng)過濾得到籽瓜干粉。將籽瓜干粉按原料∶石油醚=1∶3 (W/V)的比例加入石油醚原液,室溫條件下浸泡12 h后,采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮體積,回收石油醚。重復(fù)2次,除去脂溶性雜質(zhì),最后放入40 ℃烘箱內(nèi)干燥,得到籽瓜干粉原料。

1.2.2 籽瓜多糖的提取工藝 參照文獻(xiàn)[17-19]的方法,略作修改。取1 g處理后的原料,以蒸餾水為溶劑,采用超聲波輔助提取。在實(shí)驗(yàn)設(shè)定的溫度、時(shí)間、超聲功率等條件下提取籽瓜多糖。提取液于轉(zhuǎn)速為10000 r/min離心10 min,取上層清液于50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓濃縮至一定體積,加入4倍無水乙醇20 mL,醇沉24 h。8000 r/min離心10 min,取下層沉淀(白色絮狀物質(zhì)),用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌2～3次,Sevag法(正丁醇∶氯仿=1∶4)脫去蛋白,-60 ℃冷凍干燥得到籽瓜粗多糖。苯酚-硫酸法測定多糖含量,多糖得率計(jì)算公式如(1)式:

式(1)

1.2.3 籽瓜多糖提取單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 提取溫度對籽瓜多糖得率率的影響 固定超聲功率為500 W,以料液比為1∶30 g/mL,提取溫度分別為20、30、40、50、60 ℃的條件下提取2 h。平行提取3次,考察提取溫度對多糖得率的影響。

1.2.3.2 提取時(shí)間對籽瓜多糖得率的影響 以料液比為1∶30 g/mL,超聲功率為500 W、提取溫度為40 ℃的條件下,分別提取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h。平行提取3次,考察提取時(shí)間對多糖得率的影響。

1.2.3.3 料液比對籽瓜多糖得率的影響 以超聲功率為500 W,提取溫度為40 ℃,料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL的條件下提取2 h。平行提取3次,考察料液比對多糖得率的影響。

1.2.3.4 超聲功率對籽瓜多糖得率的影響 以料液比1∶30 g/mL,提取溫度為40 ℃,超聲功率分別為100、200、300、400、500 W的條件下提取2 h。平行提取3次,考察超聲功率對多糖得率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素優(yōu)化試驗(yàn)的基礎(chǔ)上以最優(yōu)提取溫度(A)、提取時(shí)間(B)、料液比(C)、和超聲功率(D)為自變量,根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理[19],進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。以籽瓜粗多糖得率為響應(yīng)值,優(yōu)化籽瓜多糖的提取工藝參數(shù)。因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken

1.2.5 體外降血脂作用的研究

1.2.5.1 膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參照文獻(xiàn)[20]的方法,略作修改,分別繪制甘氨膽酸鹽和牛磺膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線。配制甘氨膽酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.03、0.06、0.12、0.18、0.24、0.30 mmol/L,和?；悄懰徕c標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mmol/L。取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液2 mL分別置于不同具塞試管中,每只試管加入6 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%的H2SO4溶液。之后于70 ℃水浴加熱20 min,取出放置冰浴5 min,在波長為387 nm處測定吸光度。以膽酸鹽濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)分別繪制甘氨膽酸鈉和?；悄懰徕c標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

1.2.5.2 膽酸鹽結(jié)合實(shí)驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[20]的方法,略作修改。分別移取3 mL質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/mL籽瓜多糖溶液兩份于100 mL三角瓶中,每個(gè)三角瓶分別加入3 mL 10 mg/mL胃蛋白酶溶液和1 mL 0.01 mol/L的HCl溶液,在37 ℃的恒溫振蕩器內(nèi)振蕩1 h(模擬胃消化環(huán)境),0.1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6.3。隨后,加入4 mL 10 mg/mL胰蛋白酶溶液,37 ℃下恒溫振蕩器振蕩1 h(模擬腸道環(huán)境)。一份樣品三角瓶中加入4 mL 0.4 mmol/L甘氨膽酸鈉;另一份樣品三角瓶中加入4 mL 0.5 mmol/L?；悄懰猁}。在37 ℃的恒溫振蕩器內(nèi)振蕩1 h,于4000 r/min離心20 min,取上清液,用比色法于387 nm處測定吸光度值,每個(gè)樣品平行測定3次,按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算剩余甘氨膽酸鹽和?；悄懰猁}含量,所加入甘氨膽酸鹽或?；悄懰猁}總量減去剩余量所得差值與總量的比值即為結(jié)合率,以百分比表示。計(jì)算公式如(2)(3)式:

式(2)

式中:c0為甘氨膽酸鈉加入量,μmol;c1為甘氨膽酸鈉剩余量,μmol。

式(3)

式中:c2為?；悄懰徕c加入量,μmol;c3為?；悄懰徕c剩余量,μmol。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010作圖表。使用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析(Analysis of Variance,ANOVA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取溫度對籽瓜多糖得率的影響 由圖1a可知,溫度對于籽瓜多糖的得率有著顯著(P<0.05)的影響。隨著溫度的上升,籽瓜多糖得率呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢,當(dāng)溫度為30～40 ℃時(shí),籽瓜多糖得率隨溫度的上升，增加的趨勢最迅速,多糖得率在40 ℃時(shí)達(dá)到最大值,在一定范圍內(nèi),提取溫度的升高,有利于分子的運(yùn)動(dòng)和多糖的溶出;溫度過高則會(huì)影響到多糖的結(jié)構(gòu),會(huì)使多糖得率降低。因此選擇的最佳提取溫度為40 ℃。

2.1.2 提取時(shí)間對籽瓜多糖得率的影響 由圖1b可知,隨著提取時(shí)間的增加,籽瓜多糖的得率先升高后下降,在2.0 h時(shí)達(dá)到最大值。由于超聲波的空化效應(yīng)增大,溶劑進(jìn)入溶質(zhì)內(nèi)部的能力增強(qiáng),較短時(shí)間內(nèi),超聲開始對細(xì)胞進(jìn)行破碎,使得多糖更容易從細(xì)胞中釋放出來,使得整個(gè)提取時(shí)間縮短,得率增大。隨超聲時(shí)間的增長,多糖分子中的五碳環(huán)或六碳環(huán)可能裂解成為可溶于乙醇的寡糖、低聚糖或單糖,造成多糖在醇沉過程中溶解損失增加;此外,超聲波空化效應(yīng)作用力減小,會(huì)影響多糖溶出。這些因素都會(huì)導(dǎo)致多糖得率的下降[21-22]。比較分析消耗能量、浸提時(shí)間和原料浪費(fèi)等各種因素,選擇的提取時(shí)間為2.0 h。

2.1.3 料液比對籽瓜多糖得率的影響 由圖1c可知,多糖得率隨料液比的增大呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在料液比為1∶30 g/mL時(shí)，多糖得率最大。這可能是溶劑體積的增加使得溶液中多糖濃度下降,多糖分子擴(kuò)散的壓力差增大,有利于多糖分子的擴(kuò)散和溶出。當(dāng)多糖的擴(kuò)散量達(dá)到一定的值時(shí),繼續(xù)加大溶劑比例,也不會(huì)使更多多糖擴(kuò)散[23]。并且料液比增大,可能會(huì)致使后續(xù)的提取濃縮過程中隨時(shí)間增加,多糖損失升高,導(dǎo)致多糖得率下降。因此,選擇料液比為1∶30 g/mL。

2.1.4 超聲功率對籽瓜多糖得率的影響 由圖1d可知,多糖得率的變化隨著超聲波功率的增大呈現(xiàn)先增加后緩慢降低至平穩(wěn)的趨勢。當(dāng)提取功率為200 W時(shí)多糖得率最大,隨著超聲功率的繼續(xù)增加,多糖得率基本保持不變。這是因?yàn)殡S超聲功率增大，超聲的空化作用隨之加強(qiáng),細(xì)胞破裂多糖加速溶出;當(dāng)超聲波功率增大到一定值時(shí),多糖得率不會(huì)再增加基本保持不變[24]。因此,選擇適宜超聲波功率為200 W。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果及方差分析 通過單因素實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):在提取過程中提取溫度為40 ℃,提取時(shí)間為2.0 h,料液比為1∶30 g/mL,超聲功率為200 W時(shí),籽瓜粗多糖得率最大。如表2所示,將提取溫度、提取時(shí)間、料液比和超聲功率作為研究的對象,籽瓜粗多糖得率為響應(yīng)值,共得到29個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn),利用Design-Expert 10.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,確定籽瓜粗多糖得率對以上因素的二次多項(xiàng)回歸模型為:

Y=5.98+0.17A+0.26B+0.45C+0.45D-0.017AB-0.12AC-0.12AD-0.010BC-5.000E-003BD-0.03CD-0.51A2-0.21B2-1.79C2-0.089D2

圖1 提取溫度(a)、提取時(shí)間(b)、料液比(c)和超聲功率(d)對多糖得率的影響Fig.1 Effects of extraction temperature(a),extract times(b),ratios of material to water(c)and ultrasonic power(d)on the yield of polysaccharide

表2 籽瓜粗多糖提取響應(yīng)分析方案及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

采用超聲輔助提取籽瓜多糖的回歸數(shù)學(xué)模型進(jìn)行方差分析,檢驗(yàn)方程的有效性和各因子的偏回歸系數(shù),回歸模型的方差分析如表3所示。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析可知,該試驗(yàn)選用的模型極顯著(P<0.0001),方差的失擬項(xiàng)不顯著(P=0.0559>0.05),所選模型的R2為0.9950,說明模型的選擇是合適的,可用于超聲輔助提取籽瓜多糖的分析與預(yù)測。同時(shí),表3結(jié)果還顯示,在本試驗(yàn)設(shè)計(jì)中:A、C項(xiàng)為高度顯著(P<0.0001),AC、AD項(xiàng)為顯著項(xiàng)(P<0.05),A2、B2、C2項(xiàng)均為高度顯著項(xiàng)(P<0.0001),D2項(xiàng)為顯著項(xiàng)(P<0.05)。

表3 次多項(xiàng)式回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance the regression model

注:*表示P<0.05,差異顯著;**表示P<0.01,差異極顯著;***表示P<0.001,差異高度顯著。

2.2.2 響應(yīng)面分析 如圖2所示,由曲面的分析可預(yù)測、檢驗(yàn)確定變量和響應(yīng)值之間的相互關(guān)系,響應(yīng)面越陡峭,表現(xiàn)出各個(gè)因素之間的兩兩交互作用越顯著[25-26]。提取溫度和料液比交互作用顯著。

圖2 各因素交互作用的響應(yīng)面Fig.2 Response surface of interaction of various factors

2.2.3 最佳提取工藝驗(yàn)證 根據(jù)響應(yīng)面結(jié)果,得到的最佳提取工藝條件是:提取溫度為41.318 ℃、提取時(shí)間為2.039 h、料液比為1∶30.078 g/mL、超聲功率為216.750 W。考慮到實(shí)際情況對上述條件加以修正,最終的優(yōu)化條件為提取溫度為42 ℃、提取時(shí)間為2 h、料液比為1∶30 g/mL、超聲功率為220 W,在該參數(shù)下,進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn),所得多糖得率平均值為6.03%,與理論預(yù)測值的6.024%相近,說明該回歸方程能較準(zhǔn)確反應(yīng)各因素對籽瓜多糖提取率的影響,證明采用響應(yīng)面法優(yōu)化籽瓜多糖提取率回歸模型可行。

2.3 籽瓜多糖體外降血脂能力分析

2.3.1 甘氨膽酸鹽和?；悄懰猁}標(biāo)準(zhǔn)曲線 由圖3a和圖3b可知:甘氨膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為:y=2.8655x+0.0212,R2=0.9991,線性關(guān)系良好;?；悄懰猁}標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為:y=2.4664x+0.0126,R2=0.9990,線性關(guān)系良好。

圖3 膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線(a)與牛磺膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線(b)Fig.3 Tandard curve of glycine sodium cholate(a) and taurine sodium cholate(b)

2.3.2 籽瓜多糖對膽酸鹽的結(jié)合能力 從圖4可以看出,籽瓜多糖與?；悄懰徕c的結(jié)合量比與甘氨膽酸鈉的結(jié)合量多,即籽瓜多糖與牛磺膽酸鹽的結(jié)合能力更強(qiáng),并且與二者的結(jié)合量均隨多糖濃度的增加而升高。當(dāng)籽瓜多糖的濃度達(dá)到2.5 mg/mL時(shí),籽瓜多糖和甘氨膽酸鹽、?；悄懰猁}的結(jié)合率分別達(dá)到62.67%和69.27%。證實(shí)籽瓜多糖具有較好的體外降血脂活性。隨著繼續(xù)增加籽瓜多糖的量,結(jié)合率的上升變得緩慢;當(dāng)籽瓜多糖濃度達(dá)到3.5 mg/mL時(shí),籽瓜多糖與甘氨膽酸鈉、?；悄懰徕c的結(jié)合率分別達(dá)到66.17%和70.27%。但僅是籽瓜濃度為2.5 mg/mL時(shí)結(jié)合率的1.06倍和1.01倍。

圖4 籽瓜多糖對膽酸鹽結(jié)合能力Fig.4 Capacity of polysaccharide from seed melon to bind sodium cholate

粗多糖中較高的膽酸結(jié)合能力是由于糖蛋白與多糖形成復(fù)雜的結(jié)構(gòu),有利于結(jié)合膽酸[27]。籽瓜多糖的濃度為2.5 mg/mL時(shí),與兩種膽酸鈉鹽的結(jié)合率明顯高于4 mg/mL的黑木耳多糖[28],也略高于3.5 mg/mL桑葉茯磚茶多糖[29]和4 mg/mL裙帶菜孢子多糖[30]與兩種膽酸鈉鹽的結(jié)合率。說明低濃度的籽瓜多糖有很好的體外降血脂活性,可作為具有潛在價(jià)值的降血脂保健食品原料。然而它與茶樹花渣乙醇萃取物[31]相比較,兩種膽酸鈉鹽的結(jié)合率卻略低。籽瓜多糖是以籽瓜廢棄的瓜瓤作為原材料,采用水作為溶劑,提取成本較低。因而選取籽瓜為原材料制備的籽瓜多糖,會(huì)大大降低成本,提高籽瓜加工附加值。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)中篩選出最佳提取工藝條件為提取溫度為42 ℃、提取時(shí)間為2 h、料液比為1∶30 g/mL、超聲功率為220 W。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,3次平行實(shí)驗(yàn)求得平均得率為6.03%,與理論預(yù)測值較接近。

體外降血脂結(jié)果可以得出:當(dāng)籽瓜多糖濃度達(dá)到2.5 mg/mL時(shí),籽瓜多糖與甘氨膽酸鈉、?；悄懰徕c的結(jié)合率分別達(dá)到62.67%和69.27%。與其他提取物和兩種膽酸鈉鹽的結(jié)合率做對比,低濃度籽瓜多糖有很好的降血脂效果,可以作為一種植物源降血脂保健藥物,這一發(fā)現(xiàn)為籽瓜資源的利用提供了新的研究思路,也為籽瓜在醫(yī)藥食品行業(yè)開發(fā)奠定一定的理論基礎(chǔ)。