肖懷秋1,2,李玉珍1,*,趙謀明2,林親錄3,劉 軍1,周 全1,姜明姣

(1.湖南化工職業(yè)技術學院制藥與生物工程學院,湖南株洲 412000; 2.華南理工大學食品科學與工程學院,廣東廣州 510640; 3.中南林業(yè)科技大學食品科學與工程學院,湖南長沙 410004; 4.湖南中威制藥有限公司,湖南株洲 412000)

益生菌(probiotics)是指具有維持人體內(nèi)菌群平衡,對人體健康產(chǎn)生有益作用的微生態(tài)制劑[1]。口服足量活性益生菌有助于緩解急慢性胃腸炎、治療腹泄、改善消化,緩解乳糖不耐癥等癥狀[2],在減少病原菌在腸內(nèi)定植和生長、提升免疫力、緩解神經(jīng)發(fā)育障礙等方面具有顯著功能[3]?？莶菅挎邨U菌(Bacillussubtilis)是益生菌的重要來源之一[4],其活菌制劑口服液可用于腸炎、支氣管炎和腹瀉等疾病治療和預防[5]。

噴霧干燥由于受熱時間短、料溫低和生理活性物質(zhì)活性損失小而廣泛應用于益生菌菌體干燥[6],具有干燥時間極短,產(chǎn)品分散性和溶解性好,生產(chǎn)過程簡單,設備成本低等優(yōu)點,特別適用于工業(yè)化連續(xù)生產(chǎn)。提升益生菌噴霧干燥菌體存活率是實現(xiàn)益生菌微生態(tài)制劑長期保存和提高益生菌生理功能的重要基礎,常用策略有增強菌體熱耐受性、使用抗熱保護劑和優(yōu)化噴霧干燥工藝[7]。研究表明,熱誘激能增強菌體熱耐受性,特別是穩(wěn)定期細胞,但要注意熱誘激溫度選擇[8]。范娜等研究發(fā)現(xiàn),糖類與蛋白質(zhì)聯(lián)用作為復合抗熱保護劑能增強菌體熱耐受性[9]。肖懷秋等對噴霧干燥前的BacillussubtilisProb1822益生菌菌體進行了熱誘激預處理,確定了最佳熱誘激條件,并進行了復合抗熱保護劑對菌株抗熱保護的影響,優(yōu)化得到復合抗熱保護劑配方(海藻糖9.0%、蔗糖5.0%和脫脂奶粉6.8%),在復合抗熱保護劑保護下菌體存活率達95.24%±0.84%[7]。除熱誘激處理和使用抗熱保護劑外,對噴霧干燥工藝參數(shù)優(yōu)化也是提升菌體存活率的重要策略。

本試驗選擇熱誘激預處理和使用復合抗熱保護劑,以菌體存活率為評價指標,通過單因素實驗篩選對菌體存活率影響較重要的3個因素,結合中心復合響應面優(yōu)化技術對進料速率(X1)、進風量(X2)和出口溫度(X3)3個關鍵因素的水平進行優(yōu)化,建立了因素與響應值的數(shù)學模型和回歸方程,獲得了菌體噴霧干燥的最優(yōu)參數(shù),為枯草芽孢桿菌噴霧干燥制備益生菌菌粉提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)Prob1822 實驗室保藏;海藻糖 食品級,海北鵬宇生物科技有限公司;蔗糖 食品級,市售;脫脂奶粉 食品級,伊利集團;其它試劑為國產(chǎn)分析純。

UV-2500紫外可見分光光度計 日本島津公司;BBS-SSC超凈工作臺 濟南騰覽儀器有限公司;DH-360電熱恒溫培養(yǎng)箱 北京科偉永興儀器有限公司;LDZX-50FAS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;KRH-PJ-10L發(fā)酵罐 江蘇鎮(zhèn)江科海生物工程設備有限公司;SP-1500噴霧干燥機 上海順儀實驗設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制方法 菌種活化采用牛肉膏蛋白胨固體斜面培養(yǎng)基,種子培養(yǎng)采用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基組成為牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L,pH7.4,固體培養(yǎng)基加入15～20 g瓊脂;發(fā)酵培養(yǎng)基[10]組成為冷榨花生粕蛋白胨12 g/L、酵母膏5 g/L、NaCl 5 g/L,pH7.4。所有培養(yǎng)基配制完成后均于131 ℃滅菌20 min,經(jīng)檢驗無菌后備用。

1.2.2 菌種活化、菌懸液制備及噴霧干燥 取冷凍保存(-18 ℃)的枯草芽孢桿菌菌種1環(huán)轉(zhuǎn)接于牛肉膏蛋白胨固體斜面培養(yǎng)基,于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h進行菌種活化培養(yǎng);活化完成后,用接種環(huán)從斜面刮取兩環(huán)菌種接種至牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中進行種子培養(yǎng)(100 mL/250 mL),37 ℃、120 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)24 h;按5%(v/v)接種量將種子液接種于發(fā)酵罐中,37 ℃、120 r/min恒溫培養(yǎng)至穩(wěn)定期(26 h);4000 r/min離心15 min,棄上清液,沉淀用無菌水洗滌并重新懸浮,上述操作重復3次;菌懸液于55 ℃熱誘激10 min,并按預定百分比例(w/v,以菌懸液體積為基準)加入復合抗熱保護劑(海藻糖∶蔗糖∶脫脂奶粉=0.43∶0.34∶0.33,w/w),充分混勻后再進行噴霧干燥制備益生菌菌粉。

1.2.3 活菌計數(shù)與益生菌存活率計算 準確稱取1.0000 g噴霧干燥后收集的菌粉用稀釋平板法進行活菌計數(shù);選取3個相鄰稀釋度的菌液0.1 mL傾入牛肉膏蛋白胨瓊脂平板上,涂布均勻后于37 ℃倒置培養(yǎng)48 h,記錄培養(yǎng)皿上菌落數(shù)量(CFU),菌落數(shù)以CFU/g計。菌體存活率計算公式:

菌體存活率(%)=噴霧干燥后總活菌數(shù)(cfu·g-1)/噴霧干燥前總活菌數(shù)(cfu·g-1)×100

1.2.4 水分含量的測定 水分含量根據(jù)GB 5009.3-2016直接干燥法測定。準確稱取噴霧干燥后收集的菌粉10.0000 g置于101～105 ℃干燥箱中,瓶蓋斜支于瓶邊,干燥2～4 h后,蓋好取出,放入干燥器內(nèi)冷卻至室溫稱量,記錄質(zhì)量,然后再放入101～105 ℃干燥箱中繼續(xù)干燥1 h,取出冷卻后稱重,重復此過程直至前后兩次質(zhì)量差不超過2 mg,即為恒重。

式中:m1為稱量瓶和試樣的質(zhì)量,g;m2為稱量瓶和干燥后試樣的質(zhì)量,g;m3為稱量瓶的質(zhì)量,g。

1.2.5 單因素實驗

1.2.5.1 復合抗熱保護劑用量 在入口溫度80 ℃,進風量50 m3/h,出口溫度55 ℃,進料速率400 mL/h條件下,考察復合抗熱保護劑用量(0、5%、10%、15%和20%,w/v)對噴霧干燥的影響,測定菌體存活率和含水量,以菌體存活率為主要評價指標。

1.2.5.2 入口溫度 在復合抗熱保護劑添加量15%,進風量50 m3/h,出口溫度55 ℃,進料速率400 mL/h條件下,考察入口溫度(60、80、100、120和140 ℃)對噴霧干燥的影響,測定菌體存活率和含水量,以菌體存活率為主要評價指標。

1.2.5.3 進料速率 在復合抗熱保護劑添加量15%,入口溫度100 ℃,進風量50 m3/h,出口溫度55 ℃條件下,考察進料速率(200、400、600、800和1000 mL/h)對噴霧干燥的影響,測定菌體存活率和含水量,以菌體存活率為評價指標。

1.2.5.4 進風量 在復合抗熱保護劑添加量15%,入口溫度100 ℃,進料速率600 mL/h,出口溫度55 ℃條件下,考察進風量(30、50、70、90和110 m3/h)對噴霧干燥的影響,測定菌體存活率和含水量,以菌體存活率為主要評價指標。

1.2.5.5 出口溫度 在復合抗熱保護劑添加量15%,入口溫度100 ℃,進料速率600 mL/h,進風量90 m3/h條件下,考察出口溫度(50、55、60、65和70 ℃)對噴霧干燥的影響,測定菌體存活率和含水量,以菌體存活率為主要評價指標。

1.2.6 中心復合響應面優(yōu)化噴霧干燥工藝參數(shù) 對進料速率(X1,mL/h)、進風量(X2,m3/h)和出口溫度(X3, ℃)進行中心復合響應面優(yōu)化,各因素設計5個水平,即±r(上下星號臂),±1(上下水平點)和0(中心點,N=3)。本試驗星號臂r=1.682[11]。試驗因素水平與編碼如表1所示。

表1 中心復合響應面優(yōu)化設計因素水平與編碼Table 1 Experimental levels and codes for CCD-RSM

注:r=1.682,z為編碼值,x為試驗值。零水平Z0j=(Z1j+Z2j)/2,Δj=(Z2j-Z0j)/r,編碼線性變換xj=|Zj-Z0j|/Δj。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗結果均采用(n=3)標示;均數(shù)多重比較采用SPSS Statistics 25最小顯著性差異法(LSD)進行,顯著性水平選用α=0.05和α=0.01,P<0.01為差異極顯著,用“**”表示;0.010.05為差異不顯著,用“ns”表示。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 復合抗熱保護劑用量 復合抗熱保護劑用量對菌體存活率和含水量的影響如圖1所示。

圖1 復合保護劑用量對菌體存活率與含水量的影響Fig.1 Effects of anti-thermal compound protectant’s usage on CSR and WC注:標注相同字母表示差異不顯著(P>0.05), 不同字母表示差異顯著(0.01

由圖1可看出,復合抗熱保護劑在一定范圍內(nèi)(0～15%),隨著使用量的增加,噴霧干燥后菌體存活率呈上升趨勢;復合抗熱保護劑添加量15%與不添加保護劑相比,菌體存活率存在極顯著差異(P<0.01),菌體存活率達到最高(89.77%±0.99%),比未添加保護劑的對照存活率提高了91.78%,樣品含水量為5.82%±0.05%;復合抗熱保護劑進一步增加時,菌體存活率反而下降,且樣品含水量進一步增加,達到了5.98%±0.03%,主要是由于抗熱保護劑添加過量時,噴霧干燥基質(zhì)中含糖量較高,不利于菌體霧化,且料液黏度較大,干燥過程中水分失去速率較慢,使菌體熱接觸時間延長,菌體存活率呈下降趨勢[12]。因此,后續(xù)研究中復合抗熱保護劑添加量均為15%。

2.1.2 入口溫度 入口溫度是噴霧干燥的重要參數(shù),對干燥速率、產(chǎn)品形貌及產(chǎn)品穩(wěn)定性等有重要影響[13]。入口溫度對菌體存活率和含水量影響如圖2所示。

圖2 入口溫度對菌體存活率和含水量的影響Fig.2 Influence of inlet temperature on CSR and WC

由圖2可以看出,入口溫度60、80和100 ℃時,菌體存活率分別為89.40%±0.40%、89.15%±0.28%和89.07%±0.61%,差異不顯著(P>0.05);入口溫度120和140 ℃時,菌體存活率分別為78.85%±0.71%和74.26%±0.94%,相比入口溫度100 ℃時分別下降了11.47%和16.63%,菌體存活率差異極顯著(P<0.01)。隨著入口溫度的提高,噴霧干燥菌體粉末的含水量也越低,存在極顯著差異(P<0.01);綜合考慮到入口溫度對菌體存活率、產(chǎn)品含水率的影響以及噴霧干燥過程溫差,后續(xù)試驗噴霧干燥入口溫度均為100 ℃。

2.1.3 進料速率 進料速率過快常造成干燥不完全或菌體結塊,產(chǎn)品含水量高,若進料速率過低時,益生菌菌體熱接觸時間較長,影響菌體存活率[14]。進料速率對菌體存活率和含水量的影響如圖3所示。

圖3 進料速率對菌體存活率和含水量的影響Fig.3 Effects of feeding speed on CSR and WC

由圖3可看出,在200～600 mL/h的進料速率范圍內(nèi),隨著進料速率的增加菌體存活率呈上升趨勢,進料速率為600 mL/h時,菌體存活率最高92.31%±0.93%,與其它進料速率存在極顯著差異(P<0.01);進料速率提升至800和1000 mL/h時,菌體存活率分別下降至82.77%±0.97%和73.69%±1.40%;研究發(fā)現(xiàn),隨著進料速率提升,噴霧干燥產(chǎn)品的含水量呈線性上升趨勢,表明進料速率較大時,產(chǎn)品干燥不完全。因此,進料速率宜選擇600 mL/h為好。鑒于進料速度對產(chǎn)品存活率有顯著影響,選定為重要的響應面因素進行進一步優(yōu)化。

2.1.4 進風量 進風量對菌體存活率和含水量的影響如圖4所示。

圖4 進風量對菌體存活率和含水量的影響Fig.4 Influence of air intake on CSR and WC

由圖4可以看出,進風量在30～90 m3/h范圍內(nèi),隨著進風量增加,菌體存活率呈上升趨勢,這是由于進風量增加,水分移除速率加快,有利于菌體干燥[7]。進風量在30～90 m3/h范圍內(nèi),菌體存活率呈現(xiàn)極顯著差異(P<0.01);進風量90和110 m3/h差異不顯著(P>0.05);進風量為90 m3/h時,菌體存活率最高92.33%±0.57%。因此,進風量選擇90 m3/h較好。鑒于進風量對菌體存活率有顯著影響,選定作為響應面重要因素進行進一步優(yōu)化。

2.1.5 出口溫度 出口溫度對菌體存活率和含水量的影響如圖5所示。

圖5 出口溫度對菌體存活率和含水量的影響Fig.5 Effects of outlet temperature on CSR and WC

由圖5可看出,隨著出口溫度的提高,菌體存活率呈顯著下降趨勢;出口溫度為50和55 ℃時菌體存活率差異不顯著(P>0.05),分別為93.36%±0.58%和93.2%±0.56%;隨著溫度的進一步提高,菌體存活率呈顯著下降趨勢;與出口溫度55 ℃相比,存在極顯著性差異(P<0.01),特別是出口溫度70 ℃(75.09%±0.81%),相比55 ℃時菌體存活率下降了19.43%。Teixeira等[8]研究認為,噴霧干燥溫度64 ℃以下可引起細胞膜亞細胞結構損傷,超過65 ℃可引起細胞壁和蛋白質(zhì)等細胞結構和生物大分子損傷,甚至引發(fā)核糖體不可逆損傷[7]。因此,出口溫度不宜過高。隨著出口溫度的提高,噴霧干燥后菌粉含水量呈顯著下降趨勢,除65和70 ℃之間噴霧干燥后菌粉含水量差異不顯著(P>0.05)外,其它溫度間差異均極顯著(P<0.01);綜合考慮菌體存活率和含水量,選擇出口溫度為55 ℃較好。鑒于出口溫度對菌體存活率有顯著影響,選定作為響應面重要因素進行進一步優(yōu)化。

2.2 響應面優(yōu)化噴霧干燥工藝參數(shù)

根據(jù)各因素對菌體存活率影響的顯著性分析結果,確定進料速率(X1,mL/h)、進風量(X2,m3/h)和出口溫度(X3, ℃)為重要因素,進一步應用中心復合響應面優(yōu)化技術研究對菌體存活率的影響,試驗安排與試驗結果(含模型預測值)如表2所示。

表3 數(shù)學模型構建的序貫分析Table 3 Sequential analysis for mathematical model building

注:**表示差異極顯著(P<0.01);*表示差異顯著(0.010.05)。表4同。

表4 模型方差分析與回歸分析表Table 4 ANOVA analysis and regression analysis of model

表2 中心復合響應面優(yōu)化試驗設計結果(含模型預測值)Table 2 Experimental design and results of CCD-RSM(with predicted values)

2.2.1 序貫分析優(yōu)選數(shù)學模型 通過對各階數(shù)學模型進行序貫分析(sequential analysis,SA)來優(yōu)選構建數(shù)學模型(表3)。

2.2.2 模型方差分析與回歸分析 模型方差分析與回歸分析結果如表4。

2.2.3 模型診斷與因素重要性解析 殘差分析是基于模型無法解釋全部變異的理論基礎上進行的。模型選擇合適,殘差呈隨機均勻分布且呈正態(tài)概率分布[15]。由圖6可看出,模型內(nèi)部t化殘差呈隨機獨立均勻分布且符合正態(tài)概率分布,說明模型殘差是符合要求的。

圖6 模型內(nèi)部t化殘差圖和t化殘差正態(tài)分布概率圖Fig.6 Internally studentized residuals plot and normal probability plot of model

微擾曲線(perturbation plot)可在響應面優(yōu)化曲面特定區(qū)域比較各試驗因素對響應值的影響。如曲線陡直,則表明該因素對響應值敏感,若曲線平緩,則表明對響應值影響不敏感[15]。由圖7可以看出,因素X3(出口溫度)對菌體存活率最敏感,為最重要因素,其次為X1(進料速率),因素X2(進風量)曲線較為平緩,為最不重要因素,與因素的顯著性分析結果完全一致。

圖7 模型微擾曲線Fig.7 Perturbation plot of model

2.2.4 模型交互作用項影響分析 其它因素保持在中心水平時,觀察兩個因素交互作用對響應值的影響可得到其等高線圖(圖8)。等高線圖呈圓形表示因素間交互作用不明顯,橢圓形則表示交互作用顯著。由圖8可以看出,X1X3等高線圖為橢圓形,影響極顯著(P<0.01),交互作用項X1X2和X2X3影響不顯著(P>0.05)。

圖8 模型因素交互作用項等高線圖Fig.8 Contour plot of the model factors interaction items

2.2.5 模型求解與驗證試驗 應用Design Expert優(yōu)化模塊求得方程最優(yōu)解,即X1=-0.12,X2=-1,X3=-0.54,經(jīng)轉(zhuǎn)換可得到因素實際水平為進料速率為598.81 mL/h,進風量為78.11 m3/h和出口溫度為51.79 ℃。為操作方便,將參數(shù)修約為進料速率600 mL/h,進風量80 m3/h和出口溫度52 ℃,優(yōu)化條件下驗證試驗結果為96.64%±1.43%,與模型預測理論值97.82%比較接近。

3 結論與討論

單因素結果表明,復合抗熱保護劑用量為15%、入口溫度為100 ℃、進料速率為600 mL/h、進風量為90 m3/h和出口溫度為55 ℃條件下,菌體存活率相對較高;優(yōu)選進料速率、進風量和出口溫度為重要因素,并采用中心復合響應面優(yōu)化技術研究了進料速率(X1)、進風量(X2)和出口溫度(X3)對菌體存活率的影響,構建了三元二階非線性回歸方程;模型方差與回歸分析表明,出口溫度(X3)對菌體存活率影響極顯著(P<0.01),進料速率(X1)與進風量(X2)影響不顯著(P>0.05);模型信躁比SNR>4,所構建模型噪音小,可靠性較高;模型C.V=0.84%,表明模型精密度和準確度均較高。微擾曲線分析發(fā)現(xiàn),出口溫度(X3)對菌體存活率最敏感,為最重要因素。模型最優(yōu)解求解并轉(zhuǎn)化和修約得到噴霧干燥最優(yōu)參數(shù)為進料速率600 mL/h,進風量80 m3/h及出口溫度52 ℃,該優(yōu)化條件下驗證試驗結果為96.64%±1.43%,模型預測理論值為97.8248%,表明在抗熱保護劑的保護作用下菌體可以保持較高的存活率。

噴霧干燥過程中的熱損傷和脫水干燥對益生菌亞細胞結構、胞內(nèi)生物大分子及細胞器可能產(chǎn)生熱損傷,常采取添加抗熱保護劑進行菌體抗熱保護[16],常用抗熱保護劑有糖類和蛋白質(zhì)[17]。周競等[18]在未添加抗熱保護劑條件下對B.subtilisBSD-2進行噴霧干燥并對噴霧干燥條件進行優(yōu)化分析,優(yōu)化條件下菌體存活率為75%;鐘蔚[19]在未使用抗熱保護劑條件下對B.subtilisBS1進行噴霧干燥,菌體存活率為89.2%;劉宇等[20]在未使用抗熱保護劑條件下對豬源枯草芽孢桿菌進行噴霧干燥并進行工藝條件優(yōu)化,優(yōu)化條件下菌體平均存活率為75.7%;王雪蓮等[21]應用響應面優(yōu)化技術對生防菌B.subtilisB073抗熱保護劑配方進行優(yōu)化,優(yōu)化配方為溶性淀粉(0.46%)、糊精(1.25%)、蔗糖(1.22%)、谷氨酸鈉(0.37%),優(yōu)化條件下菌體存活率為70%;楊正楠等[22]以脫脂乳作為噴霧干燥保護劑,噴霧干燥存活率達到93.6%,脫脂奶粉對菌體的保護效果要顯著優(yōu)于其他保護劑;本試驗以海藻糖+蔗糖+脫脂奶粉為復合抗熱保護劑進行噴霧干燥并對干燥工藝進行了優(yōu)化分析,優(yōu)化條件下菌體存活率高達96.64%±1.43%,研究結論與Ananta[23]、Leslie[24]和Hoobin[25]等結論相同;由此可說明,抗熱保護劑的添加能較好的實現(xiàn)菌體的抗熱保護,且不同抗熱保護劑對菌體的抗熱保護效果存在顯著差異,以多糖和蛋白質(zhì)作為復合抗熱保護劑保護效果較好[26-27]。其可能原因是由于低聚糖等小分子保護劑為多羥基化合物,具有很好的親水性,可與細胞膜磷脂或蛋白質(zhì)極性基團形成氫鍵或水化層,保護細胞膜、細胞器膜及胞內(nèi)生物大分子結構的完整性,而蛋白質(zhì)等大分子保護劑則主要通過“包埋”形成天然“隔熱屏障”;兩種保護劑的保護機制不同,聯(lián)合使用抗熱保護效果更好[7]。

除熱誘激增強菌體熱耐受性和使用抗熱保護劑提高菌體存活率外,對噴霧干燥工藝參數(shù)進行優(yōu)化也可以提高菌體的熱耐受性,優(yōu)化噴霧干燥參數(shù)是益生菌噴霧干燥的重要研究內(nèi)容,也是正確設定噴霧干燥工藝參數(shù)的關鍵所在,本實驗也可為枯草芽孢桿菌微生態(tài)固態(tài)制劑提供理論與技術支持。