李婷婷，趙樹蘭，多立安

（天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津300387）

堆肥技術(shù)基于有氧條件下有機物的生物降解，可有效回收生活垃圾并將其轉(zhuǎn)化為有機肥料.在土壤中添加堆肥可以改善土壤結(jié)構(gòu)，增加保水性，能夠為植物生長提供養(yǎng)分并減少植物對化學(xué)肥料的依賴[1].然而，如果生活垃圾未實行分類，堆肥中可能會含有大量的重金屬，長期施用會將重金屬引入土壤中并被植物吸收，最終通過食物鏈威脅人類健康[2].

草坪綠化是城市現(xiàn)代化的重要標志.目前，我國草坪基質(zhì)的供應(yīng)不足是限制草坪建設(shè)的因素之一.在草皮生產(chǎn)中，為保證質(zhì)量，生產(chǎn)草皮的土壤條件必須良好，每完成1 次草皮生產(chǎn)過程，至少要鏟去2 cm 以上的熟土，連續(xù)3～4 次操作，肥沃的農(nóng)田將遭到破壞.近年來，將垃圾堆肥用于草坪及其他園林綠地建設(shè)的研究受到關(guān)注.如邵華偉等[3]研究生活垃圾堆肥對早熟禾生長的影響，發(fā)現(xiàn)土壤中配以生活垃圾堆肥可以促進早熟禾的生長；趙樹蘭等[4]研究表明，用垃圾堆肥作為草坪基質(zhì)可以提高黑麥草和高羊茅的光合能力，且顯著增加植物葉片的葉綠素含量.然而基質(zhì)中的重金屬問題如果得不到根本解決，則會存在污染地下水和影響植物生長的風(fēng)險.鈍化可以將重金屬從生物可利用態(tài)轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定態(tài)，降低重金屬的生物利用率，因此被廣泛用于重金屬污染土壤的修復(fù)[5].目前，用于土壤重金屬鈍化的納米材料主要包括納米結(jié)構(gòu)礦物、納米金屬和氧化物、生物質(zhì)納米碳和其他納米碳材料[6].森美思納米陶瓷材料是一種國內(nèi)自主研發(fā)的單層分子多孔陶瓷功能納米材料，在納米陶瓷材料表面引入官能團使其具有較大的比表面積，從而有效去除土壤和水中的重金屬離子，可以作為鈍化劑改善重金屬污染的土壤和水體[7].但是在堆肥基質(zhì)里添加納米陶瓷材料可能會對植物生長產(chǎn)生影響.

本研究以生活垃圾堆肥作為高羊茅（Festuca arundinacea）的培養(yǎng)基質(zhì)，選擇納米陶瓷材料為重金屬鈍化劑，探究草坪堆肥基質(zhì)添加納米陶瓷對高羊茅生長和保護酶活性的影響，為納米材料安全應(yīng)用于堆肥基質(zhì)重金屬的鈍化和風(fēng)險評估提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

垃圾堆肥來自天津小淀垃圾堆肥處理廠，去除其中的雜質(zhì)，風(fēng)干后過2 mm 篩子.堆肥的理化性質(zhì)：pH 值為7.62，有機質(zhì)質(zhì)量分數(shù)為22.1%，全氮為1.35%，有效磷為78 mg/kg，碳氮比為8.37，飽和含水量為 0.76 mL/g，重金屬 Cd、Cr、Cu、Pb 和 Zn 的含量分別為 1.97、67.00、239.00、172.00 和 496.00 mg/kg.

測定高羊茅生理指標的試劑盒購自蘇州科銘生物技術(shù)有限公司.納米陶瓷材料由格豐環(huán)?？萍加邢薰咎峁缺砻娣e為180～900 m2/g，粒徑為28 nm.高羊茅種子購自江蘇瑞通種業(yè)有限公司.

1.2 方法

取生活垃圾堆肥70 g， 將納米陶瓷材料按質(zhì)量分數(shù) 0（對照）、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和 3.0%分別加入到直徑為90 mm 的培養(yǎng)皿中，混合均勻，作為高羊茅培養(yǎng)基質(zhì)，每個處理4 次重復(fù).每個培養(yǎng)皿播種100 粒大小均一、籽粒飽滿的高羊茅種子，為了易于出苗和促進出苗時間的統(tǒng)一度，在播種之前，將種子在水中浸泡一晚，取出晾干，隨即播種[8].在培養(yǎng)期間定期澆水，使含水量保持在最大田間持水量的65%.培育溫度為15～27 ℃，相對濕度為22%～36%，自然光照.播種后第45 d 收獲植物地上部分.

1.3 指標測定

種子萌發(fā)：種子從第4 天開始萌發(fā)，每天記錄萌發(fā)的種子數(shù)；萌發(fā)12d 時測定發(fā)芽率（germinationrate，Gr）、發(fā)芽勢（germination potential，Gp）和發(fā)芽指數(shù)（germination index，GI）.發(fā)芽率 Gr（%）=（發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)）×100；發(fā)芽勢 Gp（%）＝（萌發(fā)起 4 d 內(nèi)發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)）×100；發(fā)芽指數(shù) GI= ∑（Gt/Dt），式中Gt 為在t 日的發(fā)芽種子數(shù)，Dt 為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù).

生物量：將收獲的高羊茅地上部分在108 ℃下殺青20 min，再在80 ℃下烘干至恒重，稱重.

葉綠素含量：稱取0.1 g 新鮮葉片，切成1～2 mm薄片，浸泡在 10 mL 丙酮和乙醇混合液中（V丙酮∶V乙醇=1 ∶1），避光浸泡24 h 直至葉子完全脫色，浸泡液為測試液.以丙酮為對照，用紫外分光光度計測定663 nm和645 nm 處的OD 值，計算葉綠素a、b 和總?cè)~綠素含量.

抗氧化酶活性和丙二醛（MDA）含量：稱取0.1 g新鮮葉片，加入1 mL 提取液，并將混合物在冰浴中均化.在4 ℃、8 000 r/min 下離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至10 mL 離心管中進行測定.SOD、POD、CAT 活性及MDA 含量的測定嚴格按照試劑盒說明書進行.

核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶（RuBisco）活性：稱取0.1 g 高羊茅葉片，加入1 mL 提取液，冰浴勻漿，超聲破碎.在4 ℃、8 000 r/min 條件下離心10 min，取上清液，嚴格按照試劑盒說明書進行酶活性測定.

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0 軟件對所得數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，采用Duncan 法，在P=0.05 水平進行數(shù)據(jù)差異統(tǒng)計學(xué)意義檢驗，采用Origin 8.0 作圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 納米陶瓷對高羊茅種子萌發(fā)的影響

播種4 d 后，高羊茅種子開始萌發(fā)，在第12 天時趨于穩(wěn)定.不同的納米陶瓷添加量下，高羊茅種子的發(fā)芽情況如表1 所示.

表1 納米陶瓷對高羊茅種子萌發(fā)的影響Tab.1 Effect of nano-ceramics on seed germination of F.arundinacea

由表1 可以看出，與對照相比，納米陶瓷添加量為0.5%時，高羊茅種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)略有增加，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）.隨著納米陶瓷添加量的增加，發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)均呈顯著下降趨勢：發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)在3.0%處理組中數(shù)值最低，與對照相比分別降低了46.77%和63.28%；發(fā)芽勢在2.5%處理組中最低，與對照相比降低了66.67%.

2.2 納米陶瓷對高羊茅生物量和葉綠素含量的影響

基質(zhì)中添加納米陶瓷后高羊茅地上生物量和葉綠素含量的變化如表2 所示.

表2 納米陶瓷對高羊茅地上生物量及葉綠素含量的影響Tab.2 Effect of nano-ceramics on biomass and chlorophyll content of F.arundinacea

由表2 可以看出，納米陶瓷添加量為0.5%時，高羊茅地上生物量有所增加，但與對照之間的差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）.隨著納米陶瓷添加量的增加，高羊茅地上生物量呈下降趨勢，在3.0%處理組中達到最低，與對照相比降低了64.38%.葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量均隨著納米陶瓷添加量的增加呈上升趨勢，在3.0%處理組中達到最大值，與對照相比分別增加了27.78%、12.71%和22.64%.

2.3 納米陶瓷對高羊茅抗氧化酶活性和MDA 含量的影響

基質(zhì)中添加納米陶瓷對高羊茅抗氧化酶活性和MDA 含量的影響如圖1 所示.

圖1 納米陶瓷對高羊茅SOD、POD、CAT 活性和MDA 含量的影響Fig.1 Effect of nano-ceramics on SOD，POD，CAT activity and MDA content of F.arundinacea

由圖1（a）～圖1（c）可以看出，納米陶瓷添加量為0.5%時，高羊茅的抗氧化酶活性與對照相比顯著下降.隨著納米陶瓷添加量的增加，SOD、POD 和CAT 均顯著增加，在納米陶瓷添加量為1.5%時抗氧化酶活性達到最大值，分別比對照高出12.20%、19.43%和18.07%.隨著納米陶瓷添加量的進一步增加，抗氧化酶的活性又呈下降趨勢.

由圖1（d）可以看出，堆肥中納米陶瓷的添加量為0.5%時，MDA 含量降至最低，與對照相比降低了12.67%，而后MDA 含量隨著納米陶瓷添加量的增加而增加，在3.0%處理組中達到最大，與對照相比增加了116.87%.

2.4 納米陶瓷對高羊茅RuBisco活性的影響

基質(zhì)中添加納米陶瓷對高羊茅RuBisco 活性的影響如圖2 所示.

圖2 納米陶瓷對高羊茅RuBisco 活性的影響Fig.2 Effect of nano-ceramics on RuBisco activity of F.arundinacea

由圖2 可以看出，納米陶瓷添加量為0.5%時，與對照相比高羊茅的RuBisco 活性幾乎沒有變化.隨著添加量的進一步增加，RuBisco 活性顯著下降，在3.0%處理組中達到最小值，與對照相比降低了38.8%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）.

3 討論

種子萌發(fā)是植物生命周期的第一階段，直接決定著植物后期的生長.本研究考察堆肥基質(zhì)添加納米陶瓷對高羊茅種子萌發(fā)和生長的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0.5%的納米陶瓷處理對種子萌發(fā)和地上生物量有輕微的促進作用，超過0.5%的處理則顯著抑制了種子萌發(fā)和地上生物量的積累.Khan 等[9]的研究表明，基質(zhì)中的納米顆粒會誘導(dǎo)氧化脅迫，對植物產(chǎn)生細胞和遺傳毒性，從而影響植物的生長發(fā)育，主要表現(xiàn)為抑制種子萌發(fā)和幼苗生長.Lin 等[10]的研究也表明，高濃度的納米Zn 和ZnO 抑制了黑麥草和玉米的種子萌發(fā)，納米顆粒對植物生長發(fā)育的影響存在著濃度相關(guān)性，高濃度下會存在明顯的抑制效應(yīng).

葉綠素作為植物光合作用的主要色素，其含量高低可直接反映植物光合作用的強弱.本研究結(jié)果表明，隨著堆肥基質(zhì)中納米陶瓷添加量的增加，高羊茅的葉綠素含量逐漸增加.王國棟等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，納米碳能有效提高草莓葉片的葉綠素含量，這是由于納米碳有效促進了葉綠體內(nèi)淀粉粒的合成和運輸，提高了植物的光合利用效率，且納米碳的表面效應(yīng)和小尺寸效應(yīng)能促進植物對氮素的吸收.彭鳴等[12]的研究表明，植物體內(nèi)的葉綠體結(jié)構(gòu)能被重金屬離子破壞.本研究中的堆肥重金屬也構(gòu)成了逆境脅迫，而納米陶瓷材料會在一定程度上吸附堆肥中的重金屬，降低高羊茅的吸收，從而減少重金屬對葉綠體的破壞，使葉綠素含量增加.

正常情況下，植物體內(nèi)的活性氧處于平衡狀態(tài).當(dāng)受到逆境脅迫時，植物體內(nèi)的活性氧會大量積累，導(dǎo)致膜脂過氧化，MDA 含量可以表示膜脂過氧化的程度.在本研究中，當(dāng)納米陶瓷添加量為0.5%時，高羊茅組織中的SOD、POD、CAT 活性及MDA 含量均低于對照組的數(shù)值，可能是由于納米陶瓷材料的鈍化作用使重金屬對高羊茅的毒性受到抑制.這與金睿等[13]的研究結(jié)果相似，他們用生物炭復(fù)配調(diào)理劑處理被重金屬污染的土壤后，小白菜植株的SOD、POD、CAT 活性及MDA 含量下降.當(dāng)納米陶瓷含量大于0.5%時，抗氧化酶的活性隨著納米陶瓷添加量的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，MDA 含量一直呈增加趨勢.這是因為植物中的抗氧化酶系統(tǒng)起著活性氧清除劑的作用，當(dāng)活性氧在植物組織中被誘導(dǎo)時，抗氧化酶的活性逐漸增加[14]，當(dāng)脅迫繼續(xù)增加時，抗氧化酶系統(tǒng)對活性氧的清除能力受到抑制，過量的活性氧物質(zhì)會直接攻擊蛋白質(zhì)、脂類和DNA 等生物大分子，引起脂質(zhì)過氧化，從而導(dǎo)致機體損傷[15].這些結(jié)果說明納米陶瓷的添加量超過0.5%時，隨著添加量的增加，納米陶瓷對高羊茅組織的損傷逐漸增大.Li 等[16]用納米顆粒處理水稻和擬南芥時，也發(fā)現(xiàn)水稻和擬南芥的活性氧增加并引發(fā)細胞死亡.Nel[17]認為，納米顆粒產(chǎn)生毒性的首要原因就是活性氧的過度積累.

RuBisCO 是一種可溶性大分子，是植物光合作用過程中固定CO2的關(guān)鍵酶，同時也參與植物的光呼吸代謝途徑，消耗植物光合作用合成的有機物[18].本研究發(fā)現(xiàn)，隨著納米陶瓷添加量的增加，高羊茅的MDA 含量增加，RuBisCO 酶活性降低，這可能是因為過量的納米陶瓷會誘導(dǎo)活性氧積累，從而導(dǎo)致RuBisCO 蛋白的加速降解.高等植物的RuBisCO 活性與植物的生物量密切相關(guān)，本研究發(fā)現(xiàn)，高羊茅葉片中RuBisco 的活性隨著納米陶瓷添加量的增加而下降，這與生物量的變化趨勢一致.

4 結(jié)論

（1）堆肥基質(zhì)中添加0.5%的納米陶瓷對高羊茅種子萌發(fā)和生物量有輕微促進作用，隨著納米陶瓷添加量繼續(xù)增加，種子萌發(fā)受到明顯抑制，生物量也顯著下降，3.0%處理組中數(shù)值達到最小.高羊茅幼苗的葉綠素含量則隨著納米陶瓷添加量的增加而增大.

（2）納米陶瓷添加量為0.5%時，幼苗的抗氧化酶活性顯著低于對照，隨著添加量的增加，抗氧化酶活性先升后降，添加量為1.5%時酶活性達到最大，添加量為3.0%時酶活性受到顯著抑制.

（3）納米陶瓷添加量為0.5%時，幼苗的MDA 含量略有下降，RuBisCO 的活性保持不變.隨著添加量的增加，MDA 含量持續(xù)增加，RuBisco 活性持續(xù)下降.添加量達到1.5%時，納米陶瓷引起膜脂過氧化，MDA含量顯著增加，RuBisco 活性顯著下降.因此，以堆肥為基質(zhì)培養(yǎng)高羊茅時，納米陶瓷的添加量應(yīng)小于0.5%.