王春萍，王銀華，霍玉珠，侯濤亮，馬成倉，郭宏宇

（1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387；2.天津師范大學(xué)天津市動植物抗性重點(diǎn)實驗室，天津 300387）

濕地生態(tài)系統(tǒng)在保持區(qū)域生態(tài)平衡和生物多樣性方面具有重要作用[1].近年來，隨著大氣中氮氧化物含量的急劇增加和氮肥的廣泛施用，大量外源氮素進(jìn)入濕地生態(tài)系統(tǒng)中，對其產(chǎn)生了嚴(yán)重影響[2].濕地生態(tài)系統(tǒng)中，土壤微生物對維持生態(tài)系統(tǒng)的平衡和穩(wěn)定具有重要作用[3]，它們不僅可以加速動植物殘體的分解[4]、驅(qū)動營養(yǎng)物質(zhì)的循環(huán)和轉(zhuǎn)化[5]、推動能量流動[6]，同時也參與污染物降解和環(huán)境修復(fù)等過程[7].生態(tài)系統(tǒng)中的氮素水平會在很大程度上影響群落微生物的生理活動、代謝特征以及結(jié)構(gòu)組成等.如葉成龍等[8]研究發(fā)現(xiàn)，土壤微生物的呼吸速率和累積碳釋放量會隨施氮量的增加而顯著降低；何亞婷等[9]的研究顯示，施氮利于群落中細(xì)菌數(shù)量的增加，但對真菌數(shù)量的影響較小或使其數(shù)量下降，還會改變土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)組成和底物利用方式，對土壤微生物多樣性的影響表現(xiàn)出負(fù)效應(yīng).土壤鹽漬化對微生物群落的影響也有一些報道.如Yuan 等[10]發(fā)現(xiàn)，甘肅地區(qū)鹽堿化土壤中微生物的生物量和活性都與土壤含鹽量呈顯著負(fù)相關(guān)；龍啟福等[11]的研究表明，隨著鹽度升高水體微生物的種類豐富度急劇下降.

天津濱海濕地位于渤海灣西岸海河流域下游.由于受海退、成土母質(zhì)、地下水、氣候以及人類活動等的影響，濕地存在較為明顯的鹽漬化現(xiàn)象[12-13]，而氮輸入急劇增加的趨勢在京津地區(qū)表現(xiàn)得也較為突出[14-15].本研究采用多因子交互控制實驗，探究不同氮輸入水平和鹽度對天津濱海濕地的土壤可培養(yǎng)細(xì)菌和真菌群落組成及土壤酶活性的影響，為在環(huán)境條件變化背景下科學(xué)制定濱海濕地管控措施，更好地利用和保護(hù)濱海濕地土壤微生物資源提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

2017 年4 月，在天津濱海濕地中具有代表性的七里海濕地[16]采集原狀土壤.選擇環(huán)境條件基本一致的典型蘆葦濕地，用環(huán)刀采樣器（直徑20 cm，高15 cm）采集土樣（保留土樣中的植被，主要為蘆葦幼苗）.共采集土樣36 份，分別放置于36 個培養(yǎng)盆中（直徑20cm，高15 cm，底部有透水孔），帶回天津師范大學(xué)種植園，進(jìn)行不同氮輸入水平和鹽度交互實驗.實驗中，氮輸入水平設(shè)置為：0（對照）、20（與天津濱海濕地當(dāng)前出現(xiàn)的氮輸入水平基本相當(dāng)）、40 g/（m2·a）（模擬未來較高氮輸入水平）.鹽度設(shè)置為：0.1%（對照，與天津濱海濕地淡水沼澤鹽度基本相當(dāng)）和1.0%（與臨海區(qū)域出現(xiàn)的鹽漬化水平基本相當(dāng)）.兩因子（氮輸入水平和鹽度）交互實驗中共有6 個處理組合：0 g/（m2·a）×0.1%（A），0 g/（m2·a）×1.0%（B），20 g/（m2·a）×0.1%（C），20 g/（m2·a）×1.0%（D），40 g/（m2·a）×0.1%（E）和40 g/（m2·a）× 1.0%（F）.將 36 盆土樣隨機(jī)分配到 6 個組合中，每個組合6 個重復(fù).

將花盆置于適當(dāng)大小的水盆中（維持水深3 cm），土壤通過透水孔吸收水分以保持穩(wěn)定的含水量（約20%，與天津濱海濕地土壤含水量基本相當(dāng)）.2017 年5 月初開始進(jìn)行處理，每周根據(jù)氮輸入水平在土樣表面施加適量尿素顆粒；根據(jù)鹽度水平在水盆中施加適量NaCl 溶液.2017 年11 月，采集各實驗處理中的原狀濕地土壤樣品，每個土樣中均采用五點(diǎn)取樣法，取樣深度為0～10 cm，土樣充分混勻后裝入無菌樣品袋中，-80 ℃下保存?zhèn)溆?

1.2 測定指標(biāo)及方法

1.2.1 土壤細(xì)菌和真菌的分離和鑒定

采用經(jīng)典稀釋平板法對土壤樣品中的可培養(yǎng)細(xì)菌和真菌進(jìn)行數(shù)量測定.細(xì)菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，真菌采用添加孟加拉紅和鏈霉素的馬丁氏培養(yǎng)基.將涂布后的平板倒置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)菌37 ℃下培養(yǎng)2～3 d，真菌28 ℃下培養(yǎng)3～5 d，每個土樣設(shè)置3 個重復(fù).對平板上的細(xì)菌和真菌分別進(jìn)行數(shù)量統(tǒng)計，并采用劃線法對形態(tài)不同的菌株進(jìn)行純化，根據(jù)純化后菌落的形態(tài)特征進(jìn)行菌種的初步分類，應(yīng)用分子生物學(xué)方法對其進(jìn)行進(jìn)一步的分類鑒定.分別應(yīng)用細(xì)菌和真菌基因組DNA 提取試劑盒（索萊寶科技有限公司，北京）提取細(xì)菌和真菌的基因組DNA.分別對所得DNA的特異片段進(jìn)行PCR 擴(kuò)增[17].以基因組DNA 為模板，利用引物 27F（5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC-AG-3′）和1492R（5′-GGT TAC CTT GTT ACG-ACT T-3′）擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA 基因片段；利用引物 Geo A2（5′-CCA GTA GTC ATA TGC TTG TCT C-3′）和 Geo11（5′-ACC TTG TTA CTT TTA CTT CC-3′）擴(kuò)增真菌 18S rRNA 基因片段.經(jīng)純化后的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）公司進(jìn)行測序.

將DNA 序列數(shù)據(jù)提交至GenBank 數(shù)據(jù)庫中，使用 BLAST 程序（http：//blast.st-va.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行比對分析，鑒定到屬分類學(xué)水平.

1.2.2 土壤酶活性測定

土壤酶活性是反映土壤微生物群落生態(tài)功能的重要指標(biāo)，測定按照文獻(xiàn)[18]中的方法進(jìn)行：蔗糖酶活性的測定采用3，5-二硝基水楊酸比色法；β-葡萄糖苷酶活性的測定采用硝基酚比色法；脲酶活性的測定采用靛酚藍(lán)比色法；蛋白酶活性的測定采用茚三酮比色法.

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用各處理中細(xì)菌和真菌的群落組成數(shù)據(jù)，分別計算細(xì)菌和真菌群落的Shannon-Wiener 多樣性指數(shù)（H）和Simpson 多樣性指數(shù)（D），計算公式如下：

式中：Pi表示群落中第i 個物種的個體數(shù)占群落中個體總數(shù)的比例.

應(yīng)用JMP 7 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行雙因子方差分析，并進(jìn)行Tukey HSD 多重比較分析，用SigmaPlot 10.0 軟件和Origin Pro 2017 軟件作圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理中土壤可培養(yǎng)細(xì)菌和真菌的群落組成

本研究共分離得到可培養(yǎng)細(xì)菌和真菌各10 個屬，如圖1 所示.

圖1 不同處理下土壤可培養(yǎng)細(xì)菌和真菌的群落組成Fig.1 Community composition of soil culturable bacteria and fungi under different treatments

由圖1（a）可知，在不同氮輸入水平和鹽度處理組合中均分布有農(nóng)桿菌屬（Agrobacterium）、微桿菌屬（Microbacterium）、溶桿菌屬（Lysobacter）和芽孢桿菌屬（Bacillus）.特別是農(nóng)桿菌屬和芽孢桿菌屬，在各處理中均占有較高比例.而紅球菌屬（Rhodococcus）只出現(xiàn)在氮輸入0 g/（m2·a）和鹽度0.1%（占1.54%）以及氮輸入0 g/（m2·a）和鹽度1.0%（占0.86%）處理組合中；類芽孢菌屬（Paenibacillus）只出現(xiàn)在氮輸入0 g/（m2·a）和鹽度 0.1%處理組合中（占 3.08%）.由圖1（b）可知，在不同氮輸入水平和鹽度處理組合中均分布有曲霉屬（Aspergillus）、擬青霉屬（Paecilomyces）、鐮刀菌屬（Fusarium）、青霉屬（Penicillium）和多環(huán)孢霉屬（Plectosphaerella）.相比鹽度為0.1%的處理組合，青霉屬在1.0%鹽度條件下占有較高的比例；而曲霉屬在0.1%鹽度條件下占有較高的比例.

2.2 不同處理中土壤可培養(yǎng)細(xì)菌和真菌的數(shù)量

圖2 不同處理下土壤可培養(yǎng)細(xì)菌和真菌的數(shù)量Fig.2 Quantities of soil culturable bacteria and fungi under different treatments

表1 氮輸入水平、鹽度及其交互作用對土壤細(xì)菌和真菌數(shù)量、群落多樣性及土壤酶活性作用的方差分析結(jié)果Tab.1 ANOVA results of the effects of nitrogen input level，salinity and their interaction on quantities，community diversity and soil enzyme activities

不同處理條件下，天津濱海濕地土壤可培養(yǎng)細(xì)菌和真菌的數(shù)量如圖2 所示，氮輸入水平、鹽度及其交互作用對細(xì)菌和真菌數(shù)量、群落多樣性及土壤酶活性影響的方差分析結(jié)果如表1 所示.由圖2（a）可以看出，土壤可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量隨氮輸入水平的增加呈上升趨勢，方差分析結(jié)果表明氮輸入水平的提高對細(xì)菌數(shù)量有顯著促進(jìn)作用（P <0.05）.在相同氮輸入水平下，較高鹽度對細(xì)菌數(shù)量有一定程度的抑制作用，但未達(dá)到顯著水平（P>0.05）.

由圖2（b）可以看出，土壤可培養(yǎng)真菌數(shù)量隨氮輸入水平和鹽度的增加而降低.由表1 可以看出，氮輸入水平和鹽度對土壤真菌數(shù)量均有極顯著影響（P<0.01），

但二者交互作用的影響則不顯著（P>0.05）.較高鹽度對土壤真菌數(shù)量的抑制作用隨氮輸入水平的提高有增強(qiáng)趨勢.比較鹽度對天津濱海濕地土壤可培養(yǎng)細(xì)菌和真菌數(shù)量的影響，發(fā)現(xiàn)較高鹽度對真菌的抑制作用強(qiáng)于細(xì)菌.

2.3 不同處理中土壤可培養(yǎng)細(xì)菌和真菌的群落多樣性

不同處理中，天津濱海濕地土壤可培養(yǎng)細(xì)菌和真菌群落的Shannon-Wiener 和Simpson 多樣性指數(shù)如圖3 所示.由圖3 可以看出，隨著氮輸入水平的增加，土壤可培養(yǎng)細(xì)菌和真菌群落的Shannon-Wiener 多樣性指數(shù)和Simpson 多樣性指數(shù)均降低；在相同氮輸入水平條件下，較高鹽度使細(xì)菌和真菌群落的2 個多樣性指數(shù)均下降.表1 中的方差分析結(jié)果顯示，氮輸入水平和鹽度對細(xì)菌和真菌群落的Shannon-Wiener 多樣性指數(shù)均有顯著影響（P<0.05）；鹽度對細(xì)菌和真菌群落的Simpson 指數(shù)均有顯著影響，氮輸入水平僅對細(xì)菌群落的Simpson 指數(shù)有顯著影響（P<0.05）.氮輸入水平和鹽度交互作用對細(xì)菌和真菌群落多樣性的影響均不顯著（P>0.05）.

總的來看，天津濱海濕地土壤真菌群落的多樣性高于細(xì)菌群落的多樣性，且前者受氮輸入水平增加和鹽度升高負(fù)面影響的程度小于后者.

2.4 不同處理中的土壤酶活性

不同氮輸入水平和鹽度處理下，天津濱海濕地的土壤酶活性如圖4 所示.由圖4 可以看出，隨著氮輸入水平的增加，土壤蔗糖酶、β-葡萄糖苷酶和脲酶的活性均呈增加趨勢，蛋白酶活性則先升高再降低，氮輸入水平對4 種土壤酶活性均有顯著影響（P<0.05）.鹽度以及氮輸入水平和鹽度交互作用對4 種土壤酶活性的影響則不顯著（P>0.05）.

圖3 不同處理下土壤可培養(yǎng)細(xì)菌和真菌群落的多樣性指數(shù)Fig.3 Community diversity index of soil culturable bacterial and fungal community under different treatments

圖4 不同處理下土壤的蔗糖酶、β-葡糖糖苷酶、脲酶和蛋白酶活性Fig.4 Activities of soil sucrase，β-glucosidase，urease and protease under different treatments

3 討論與結(jié)論

土壤細(xì)菌和真菌是土壤微生物中的主要類群，在生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)過程中起著重要作用.本研究從天津濱海濕地土壤中分離到可培養(yǎng)細(xì)菌和真菌各10 個屬：在不同的氮輸入水平和鹽度處理組合中均分布有農(nóng)桿菌屬、微桿菌屬、溶桿菌屬和芽孢桿菌屬，農(nóng)桿菌屬和芽孢桿菌屬在各處理中的比例均較高；在不同氮輸入水平和鹽度處理組合中均分布有曲霉屬、擬青霉屬、鐮刀菌屬、青霉屬和多環(huán)孢霉屬.考察氮輸入水平和鹽漬化對天津濱海濕地土壤細(xì)菌和真菌群落的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氮輸入水平的增加使細(xì)菌數(shù)量增加而真菌數(shù)量減少，較高的鹽度會使細(xì)菌和真菌數(shù)量同時減少.對于其他生態(tài)系統(tǒng)的研究表明，施加氮肥會影響土壤理化性質(zhì)，增加細(xì)菌數(shù)量，降低真菌數(shù)量，使土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[19-21].如Norris 等[22]研究發(fā)現(xiàn)，土壤中氮輸入的增加超過一定水平時土壤真菌豐度降低，從而土壤微生物群落由真菌占優(yōu)勢轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)菌占優(yōu)勢.蘇丹等[23]研究了施氮水平對桉樹林土壤微生物群落的影響，結(jié)果表明，施氮顯著降低了土壤真菌/細(xì)菌數(shù)量的比值.本研究中天津濱海濕地土壤細(xì)菌和真菌數(shù)量隨氮輸入水平增加的變化趨勢與上述研究結(jié)果相同，可能是由于氮輸入的增加降低了土壤碳氮比，細(xì)菌能夠利用較低碳氮比的有機(jī)物質(zhì)，較真菌更適應(yīng)具有較低碳氮比的環(huán)境[24].較高鹽度對天津濱海濕地土壤細(xì)菌和真菌數(shù)量均有負(fù)面影響，可能是由于它對多數(shù)土壤微生物形成了生理脅迫，從而使其數(shù)量降低.景宇鵬等[25]研究了土默川平原土壤微生物對不同程度鹽漬化土壤的響應(yīng)特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)土壤細(xì)菌、真菌數(shù)量及微生物總數(shù)均呈顯著下降趨勢.李鳳霞等[26]研究了寧夏引黃灌區(qū)不同程度鹽漬化土壤中微生物區(qū)系及其動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌和真菌數(shù)量均隨著鹽漬化程度的加重而逐漸降低.本研究的結(jié)果與這些已有研究一致，進(jìn)一步表明在天津濱海濕地生態(tài)系統(tǒng)中鹽度是影響土壤微生物數(shù)量的重要生態(tài)因子，但二者交互作用則對微生物數(shù)量沒有顯著影響.

本研究發(fā)現(xiàn)，氮輸入水平增加和鹽度升高均對天津濱海濕地土壤微生物的群落組成有顯著影響，降低了土壤微生物群落的多樣性，但二者交互作用不顯著.Zeng 等[27]研究了草地生態(tài)系統(tǒng)微生物群落對不同氮素水平的響應(yīng)，結(jié)果表明較高的施氮量改變了土壤微生物群落組成，并且降低了細(xì)菌的豐富度.Carey 等[28]研究了半干旱草原土壤微生物群落對環(huán)境條件變化的響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)較高的氮素添加量改變了土壤微生物群落結(jié)構(gòu).何昌飛等[29]研究了北戴河退化濱海濕地土壤細(xì)菌多樣性與環(huán)境因子間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)土壤細(xì)菌的豐富度與土壤含鹽量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系.閔偉[30]在新疆石河子地區(qū)研究了咸水滴灌條件下土壤微生物群落組成、結(jié)構(gòu)與功能多樣性的變化特征，結(jié)果表明，咸水灌溉顯著抑制了土壤微生物活性，改變了土壤微生物群落結(jié)構(gòu).李新[31]研究了內(nèi)蒙古河套灌區(qū)不同土壤鹽度對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響，結(jié)果表明土壤鹽度是土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的顯著影響因素.這些結(jié)果與本研究結(jié)果一致，表明氮輸入和土壤鹽漬化都會對土壤微生物的群落構(gòu)成產(chǎn)生顯著影響.這可能是由于氮營養(yǎng)的增加使能有效利用氮源的菌群更加占優(yōu)勢，從而降低了群落多樣性，而較高鹽度對土壤微生物類群產(chǎn)生較強(qiáng)的環(huán)境選擇作用，使其多樣性降低.

天津濱海濕地土壤細(xì)菌的群落多樣性對氮輸入水平和鹽度增加的負(fù)響應(yīng)較真菌群落更加敏感.Wang等[32]研究增氮對土壤微生物多樣性的影響，發(fā)現(xiàn)隨著氮添加量的增加，土壤細(xì)菌群落多樣性下降的幅度較大，而土壤真菌群落多樣性對增氮響應(yīng)較為緩和，這與本研究結(jié)果相近.由此認(rèn)為，土壤細(xì)菌的群落多樣性可能更易受到環(huán)境因子的影響，而真菌群落多樣性則表現(xiàn)出一定程度的穩(wěn)定性.因此，在氮輸入和鹽漬化加劇的條件下，天津濱海濕地土壤細(xì)菌群落多樣性的保護(hù)更應(yīng)受到關(guān)注.

土壤蔗糖酶對土壤中易溶性營養(yǎng)物質(zhì)的增加起著重要作用，一般情況下土壤蔗糖酶活性較強(qiáng)時土壤肥力較高.土壤β-葡萄糖苷酶是將纖維素分解為葡萄糖的限制酶，其活性與土壤有機(jī)質(zhì)含量呈正相關(guān).土壤脲酶可促進(jìn)有機(jī)物水解生成氨和二氧化碳，其活性與土壤有機(jī)質(zhì)及全氮含量等呈正相關(guān).土壤蛋白酶參與土壤中氨基酸、蛋白質(zhì)及其他含蛋白質(zhì)氮的有機(jī)化合物的轉(zhuǎn)化.本研究發(fā)現(xiàn)，氮輸入總體上提高了天津濱海濕地土壤蔗糖酶、β-葡萄糖苷酶、脲酶和蛋白酶的活性，這可能是由于氮輸入緩和了濕地土壤中微生物可利用氮素含量的限制，促進(jìn)了微生物總量的增加，從而使上述幾種重要的土壤酶活性增強(qiáng).王淑英等[33]研究施肥對黃土旱塬黑壚土土壤酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)施加氮肥在一定程度上提高了土壤蔗糖酶和脲酶的活性.Frey 等[34]的研究表明，氮沉降增加顯著促進(jìn)了森林生態(tài)系統(tǒng)中土壤β-葡萄糖苷酶的活性.于德良等[35]探究了沙地樟子松人工林中土壤酶活性受土壤理化因子的影響，發(fā)現(xiàn)土壤蛋白酶活性隨有效氮含量的增加而增強(qiáng).本研究和這些已有研究的結(jié)果都證實了氮輸入水平的增加會提高與土壤微生物相關(guān)的土壤酶的活性.這表明在天津濱海濕地生態(tài)系統(tǒng)中氮輸入的持續(xù)增加將進(jìn)一步促進(jìn)與土壤微生物相關(guān)的土壤酶活性，從而可能加速濕地土壤中碳氮營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化和釋放[36-37]，加劇天津濱海濕地和水體的富營養(yǎng)化趨勢.