薛俠，趙皖秋，李偉，李明昭，趙小利，王敏

(西北婦女兒童醫(yī)院生殖中心，西安 710003)

近年來，隨著輔助生殖技術(shù)臨床妊娠率的增高，多胎率也居高不下。為了降低多胎率，全球目前形成了提倡單胚胎移植的共識[1]。我中心的多胎率隨著移植胚胎數(shù)的減少，從原來的40.0%下降到目前的15.1%。本中心前期的研究結(jié)果提示，通過優(yōu)化胚胎選擇標(biāo)準(zhǔn)可在不降低臨床妊娠率的同時(shí)降低雙胎率[2]。本研究中引進(jìn)了實(shí)時(shí)觀察培養(yǎng)箱，通過比較實(shí)時(shí)觀察培養(yǎng)和三氣培養(yǎng)選擇性單囊胚移植的臨床結(jié)局，為進(jìn)一步降低多胎率提供參考。

一、資料與方法

1. 研究對象與分組：選擇2015年1月1日至2018年5月31日在本院生殖中心接受常規(guī)輔助生殖治療且獲卵數(shù)≥5個(gè)的1 717個(gè)單囊胚移植周期。納入標(biāo)準(zhǔn)：獲卵數(shù)5～15個(gè)，超長方案或長方案，年齡<35歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除PGT和IVF-D患者。根據(jù)胚胎培養(yǎng)方式不同，分為實(shí)時(shí)觀察培養(yǎng)(time-lapse)組和三氣培養(yǎng)(labotac)組。其中實(shí)時(shí)觀察培養(yǎng)組191個(gè)周期，三氣培養(yǎng)組1 526個(gè)周期，全部采用形態(tài)學(xué)評分選擇單囊胚移植。所有患者均簽署知情同意書。

2. 臨床方案：根據(jù)患者情況選擇合適的促排方案進(jìn)行控制性促排卵(COS)。

3. 精液處理及受精：采卵當(dāng)日男方使用手淫法留取精液，采用密度梯度離心和上游法相結(jié)合的方法進(jìn)行處理，密度梯度離心液采用Pureception 40%及80%(SAGE，美國)，洗滌液為spermrinse(Vitrolife，瑞典)，上游液為G-IVFPLUS(Vitrolife，瑞典)。采用四孔板授精法，每孔加入預(yù)平衡好的G-IVFPLUS 0.6 ml上蓋油，注射HCG后39～40 h按照3 500～4 000∶1的比例加入精子和卵母細(xì)胞，每孔2枚卵母細(xì)胞。精卵共同孵育，5 h后將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移至G-IVFPLUS孔中脫顆粒放入G1.5(Vitrolife，瑞典)中觀察第二極體排出情況。脫完顆粒隨機(jī)分配放入三氣培養(yǎng)箱和實(shí)時(shí)觀察培養(yǎng)箱。

4. 囊胚培養(yǎng)及囊胚移植：受精16～18 h后觀察雙原核(2PN)，實(shí)時(shí)觀察培養(yǎng)箱中沒有觀察到2PN的再回放確定受精情況。第三天根據(jù)胚胎質(zhì)量評分，評分1級～3級的胚胎為可用胚胎，其中評分1級和2級的為優(yōu)質(zhì)胚胎。有4個(gè)以上優(yōu)質(zhì)胚胎者繼續(xù)用G2.5(Vitrolife，瑞典)囊胚培養(yǎng)至D5。根據(jù)Gardner評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分，有優(yōu)質(zhì)囊胚(評分BB及擴(kuò)張程度為3以上)的選擇行單囊胚移植。

5. 妊娠判斷：臨床妊娠為孕5周B超見孕囊及胎心。

二、結(jié)果

1.一般情況比較：三氣培養(yǎng)組和實(shí)時(shí)觀察培養(yǎng)組的男方平均年齡[(31.6±4.6)歲 vs.(31.5±4.3)歲]、女方平均年齡[(29.9±3.7)歲 vs.(29.6±3.6)歲]及平均獲卵數(shù)[(12.7±4.0)vs.(12.8±3.0)]比較均無顯著性差異(P>0.05)；而兩組受精率(82.7% vs. 88.0%)、卵裂率(98.8% vs. 97.0%)、正常受精率(67.5% vs. 75.6%)比較均有顯著性差異(P<0.05)(表1)。

2.臨床結(jié)局比較：實(shí)時(shí)觀察培養(yǎng)組的可用胚胎率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率、移植的優(yōu)質(zhì)囊胚率均顯著高于三氣培養(yǎng)組(P<0.05)；兩組的臨床妊娠率和流產(chǎn)率均無顯著性差異，但實(shí)時(shí)觀察培養(yǎng)組數(shù)值上優(yōu)于三氣培養(yǎng)組(P>0.05)(表2)。

表1 兩組一般情況比較[(-±s)，%]

注：與三氣培養(yǎng)組比較，*P<0.05

表2 兩組的臨床結(jié)局比較(%)

注：與三氣培養(yǎng)組比較，*P<0.05

三、討論

目前，全球ART的目標(biāo)和趨勢是在不降低妊娠率的同時(shí)降低多胎率，選擇性移植一枚最有種植潛力的胚胎或囊胚是每個(gè)輔助生殖中心追求的目標(biāo)。Mancuso等[3]研究提出：移植一枚優(yōu)質(zhì)囊胚是最好的選擇。據(jù)報(bào)道，單囊胚移植不僅和雙囊胚移植有同樣高的臨床妊娠率，而且在降低多胎率方面有很大優(yōu)勢[4-5]。但如何選擇胚胎，選用何種培養(yǎng)方式等方面的研究報(bào)道較少。雖然已經(jīng)有研究報(bào)道，使用time-lapse模型軟件評分法選擇D3單胚胎移植，比D5利用傳統(tǒng)的評分方法選擇單囊胚移植的繼續(xù)妊娠率高[6]。但還未見關(guān)于不同培養(yǎng)箱的選擇使用對單囊胚移植臨床妊娠結(jié)局影響的報(bào)道。因此，本研究對普通三氣培養(yǎng)和實(shí)時(shí)觀察培養(yǎng)的臨床妊娠結(jié)局進(jìn)行研究，探討何種培養(yǎng)箱在選擇性單囊胚移植臨床妊娠結(jié)局方面更有優(yōu)勢。

傳統(tǒng)的胚胎觀察都是在受精后16～18 h把胚胎放在顯微鏡下觀察，但這種觀察方法有很多弊端，如錯(cuò)過了2PN的觀察時(shí)間、沒有辦法回放觀察、胚胎分裂過程中的情況無從得知等。近年來越來越多的研究提出實(shí)時(shí)觀察培養(yǎng)箱的優(yōu)勢，如不需要把胚胎移至培養(yǎng)箱外觀察，簡化實(shí)驗(yàn)室工作流程、便于培訓(xùn)帶教，動態(tài)觀察胚胎的分裂過程等，從而更加準(zhǔn)確的篩選移植胚胎。

Pribenszky等[7]研究結(jié)果顯示：實(shí)時(shí)觀察培養(yǎng)箱優(yōu)于普通的三氣培養(yǎng)箱。本研究結(jié)果與其基本一致：實(shí)時(shí)觀察培養(yǎng)組中的受精率和正常受精率等均顯著高于三氣培養(yǎng)組(P<0.05)。提示進(jìn)行選擇性單囊胚移植時(shí)可以更多選擇在實(shí)時(shí)觀察培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，能更好地選擇胚胎，從而得到更好的臨床妊娠結(jié)局。

李施施等[8]研究報(bào)道，實(shí)時(shí)觀察培養(yǎng)箱性能比三氣培養(yǎng)箱更穩(wěn)定，優(yōu)胚率更高，有利于獲得更好的妊娠結(jié)局。Sciorio等[9]對比EmbryoScope time-lapse incubator(ES，TL培養(yǎng)箱)和臺式培養(yǎng)箱發(fā)現(xiàn)，雖然在囊胚形成率方面沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但TL培養(yǎng)箱有更高的優(yōu)胚形成率。Mascarenhas等[10]對出生后代研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)時(shí)觀察培養(yǎng)箱和普通三氣培養(yǎng)箱相比，出生結(jié)局更好。本研究結(jié)果和以上研究結(jié)果基本一致，實(shí)時(shí)觀察培養(yǎng)組比三氣培養(yǎng)組有更好的可用胚胎率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率和移植的優(yōu)質(zhì)囊胚率；臨床妊娠率和流產(chǎn)率雖無顯著性差異，但實(shí)時(shí)觀察培養(yǎng)箱有優(yōu)于普通培養(yǎng)箱的趨勢。

然而，有研究發(fā)現(xiàn)了相反的結(jié)果：三氣培養(yǎng)箱比實(shí)時(shí)觀察培養(yǎng)箱有更好的胚胎質(zhì)量，更高的囊胚形成率，更高的臨床妊娠率和繼續(xù)妊娠率[11]。徐士儒等[12]的研究發(fā)現(xiàn)胚胎培養(yǎng)微滴內(nèi)的溫度變化以三氣培養(yǎng)箱恢復(fù)最快。Swain等[13-14]研究表明，培養(yǎng)的濕度可以幫助減小環(huán)境對胚胎的壓力，而三氣培養(yǎng)箱可以降低培養(yǎng)液的揮發(fā)，降低滲透壓變化對胚胎發(fā)育的影響。但Barberet等[15]的研究表明，新鮮周期使用不同培養(yǎng)箱的種植率沒有明顯差異。

綜上所述，實(shí)時(shí)觀察培養(yǎng)箱在選擇性單囊胚移植中有一定優(yōu)勢，但還需要隨機(jī)、多中心、大樣本數(shù)據(jù)進(jìn)一步去研究。