李偉偉，李麗瑋*，閆婭妮，劉茶，劉聰，殷秀榮，胡悅

(1.秦皇島市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)科，秦皇島 066000；2.秦皇島市婦幼保健院檢驗(yàn)科，秦皇島 066000；3.秦皇島市第一醫(yī)院男性不育科，秦皇島 066000)

不孕癥是一個(gè)全球性問題，不孕夫婦的比例在全世界人口中達(dá)到15%。在所有的不孕因素中，男性因素約占50%[1]。近50%的不育夫婦和大約90%的不育男性中存在四種主要精液異常，包括無精子癥、少精子癥、弱精子癥和畸形精子癥[2]。在這些病例中，弱精子癥是男性不育的主要原因之一，僅次于少精子癥[3]。弱精子癥可以作為一種獨(dú)立的疾病存在，也可能與其他精子異常相關(guān)或作為綜合征的一部分存在。弱精子癥是精子濃度≥15×106/ml而精子前向運(yùn)動(dòng)(PR)<32%。臨床上將病因不明或者發(fā)病機(jī)制不清楚的弱精子癥稱為特發(fā)性弱精子癥。臨床治療特發(fā)性弱精子癥無法采取有效的措施，治療效果不理想。因此很多特發(fā)性弱精子癥的患者只能依靠輔助生殖技術(shù)。因此深入研究特發(fā)性弱精子癥的發(fā)病機(jī)制，會(huì)為臨床治療弱精子癥提供有力的依據(jù)。

精子運(yùn)動(dòng)相關(guān)蛋白包括離子通道、細(xì)胞骨架蛋白、細(xì)胞信號(hào)蛋白及糖酵解蛋白等，研究表明這些蛋白在精子的運(yùn)動(dòng)中必不可少。Tektins蛋白包括Tektin-1、Tektin-2、Tektin-3、Tektin-4、Tektin-5，是一組微管相關(guān)的細(xì)胞骨架蛋白[4]。這些蛋白主要存在于雄性生殖細(xì)胞的中心粒、纖毛鞭毛的微管蛋白。國(guó)內(nèi)已有相關(guān)報(bào)道證明Tektins與弱精子癥相關(guān)[5-6]，國(guó)外學(xué)者Tanaka等[7]也報(bào)道Tektin-2在弱精子癥者中表達(dá)下降。有學(xué)者克隆了人類Tektin-2基因，在睪丸中顯示出特異性表達(dá)，并且精確定位于成熟精子的鞭毛中[8]。這種蛋白質(zhì)的定位及其與精子運(yùn)動(dòng)的關(guān)聯(lián)使其成為研究弱精子癥病因的良好候選基因。但是目前缺乏關(guān)于Tektin-2的多態(tài)性與弱精子癥的相關(guān)性的研究。秦皇島身處京津冀地段，是環(huán)渤海地區(qū)重要港口城市。因此我們?cè)谇鼗蕧u婦幼保健院生殖中心和秦皇島市第一醫(yī)院男性不育科選取192例特發(fā)性弱精子癥患者作為弱精子癥組、208例精子活力正常的不育男性(女方無不孕癥相關(guān)疾病)作為不育癥組和213例精液正常的已生育男性作為正常對(duì)照組，研究Tektin-2的多態(tài)性與秦皇島地區(qū)特發(fā)性弱精子癥的相關(guān)性。

資料和方法

一、研究對(duì)象及分組

2017年5月至2019年8月期間從秦皇島市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)科、秦皇島市第一醫(yī)院男性不育科首次接受不孕癥咨詢并登記的夫婦中招募了192例特發(fā)性弱精子癥的男性伴侶作為弱精子癥組。另募集208例精子活力正常的不育癥男性作為不育癥組，213例年齡相當(dāng)?shù)目捎】的行?至少生育一個(gè)孩子)作為正常對(duì)照組。

納入標(biāo)準(zhǔn)：所有研究對(duì)象均為秦皇島本地人，并且從出生至納入研究時(shí)一直生活在秦皇島；男方患者年齡均在23～44歲之間。弱精子癥組：男方未生育，精子濃度≥15×106/ml，前向運(yùn)動(dòng)精子<32%;不育癥組：男方未生育，精子濃度≥15×106/ml，前向運(yùn)動(dòng)精子≥32%；正常對(duì)照組：男方已生育，精子濃度≥15×106/ml，前向運(yùn)動(dòng)精子≥32%。

排除標(biāo)準(zhǔn)：男方患有已知疾病如隱睪癥、睪丸炎、附睪炎、精索靜脈曲張、輸精管阻塞、及內(nèi)分泌性腺功能減退，核型異常和Y染色體微缺失也均被排除在研究之外。另外，吸煙、藥物濫用及酗酒的患者也不納入研究。

本研究經(jīng)秦皇島市婦幼保健院倫理委員會(huì)討論通過，所有受試者均簽署知情同意書。

二、研究方法

1. 精液分析：所有受試者均需要禁欲2～7 d，手淫法留取精液于無菌的取精杯內(nèi)。由專業(yè)技術(shù)人員按照第五版WHO標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行操作，每份精液標(biāo)本必須重復(fù)計(jì)數(shù)兩次，取平均值。

2. 提取基因組DNA：采用精子基因組DNA提取試劑盒(北京百奧森泰)提取人精子的總DNA。步驟如下：吸取液化后的精液(1～3)×106至1.5 ml EP管，加入500 μl Solution A，混勻，12 000 rpm，離心1 min。棄掉上清，重復(fù)步驟1一次。棄掉上清，EP管底部留取約50 μl Solution A，用移液器吹打均勻。加入600 μl Solution B和10 μl Solution C，用移液器吹打均勻，50℃～65℃孵育20～30 min。加入等體積的異丙醇，上下顛倒混勻至出現(xiàn)白色絮狀物(即精子基因組DNA)。用移液器將白色絮狀物吸入到提前準(zhǔn)備好的含有800 μl 75%酒精的EP管中，顛倒數(shù)次；12 000 rpm離心1 min，用移液器吸掉上清，室溫干燥10～15 min；加入200～800 μl的Elution Buffer，50℃～65℃孵育10 min，用移液器吹打均勻，-20℃保存基因組DNA。

3. 基因組DNA的擴(kuò)增和位點(diǎn)rs12043423測(cè)序：基因組DNA提取后寄送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行SNP的測(cè)序。Tektin-2引物序列為：F：5′-CAGAGCAAAATGGACAGGAA-3′；R：5′-TAGCGCTTGTCCCCACTTTA-3′。 應(yīng)用 DNA作為模板，建立 50 μl 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)體系：模板DNA 1 μl、dNTPs 2 μl、10× PCR Buffer 5 μl、正反向引物各2 μl、Taq 酶 0.5 μl，加去離子水至終體積 50 μl。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s、59℃退火30 s、72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸8 min，降至4℃保溫。PCR產(chǎn)物均用1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。應(yīng)用美國(guó) ABI310測(cè)序儀對(duì)純化后的DNA片段進(jìn)行測(cè)序分型，并用Sequence analysis 軟件進(jìn)行分析。結(jié)果比對(duì)用SeqMan軟件(測(cè)序結(jié)果見圖1)。

4. 蛋白突變的預(yù)測(cè)：使用PolyPhen-2生物信息程序(http：∥genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)進(jìn)行了錯(cuò)義突變對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的破壞作用的預(yù)測(cè)。

三、觀察/分析指標(biāo)

患者一般資料(年齡、BMI、精液參數(shù))；不同患者組Tektin-2基因rs12043423多態(tài)性位點(diǎn)基因型和等位基因頻率，分析相關(guān)于特發(fā)性弱精子癥的風(fēng)險(xiǎn)；rs12043423多態(tài)性位點(diǎn)與Tektin-2蛋白表達(dá)的關(guān)系分析。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、一般資料比較

三組患者間年齡、BMI、精子濃度、正常形態(tài)率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。 弱精子癥組精子前向運(yùn)動(dòng)率顯著低于其他兩組(P<0.05)(表1)。

二、Tektin-2基因rs12043423多態(tài)性位點(diǎn)基因型和等位基因頻率的檢測(cè)

rs12043423多態(tài)性位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果見圖1。我們發(fā)現(xiàn)Tektin-2基因rs12043423多態(tài)性位點(diǎn)在所有研究對(duì)象中的分布符合哈迪-溫伯格平衡定律(表2)；各組的Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果分別為：正常對(duì)照組(χ2=0.121，P=0.728)，弱精子癥組(χ2=0.006，P=0.940)，不育癥組(χ2=0.241，P=0.624)。rs12043423位點(diǎn)的分布在三組中均具有人群代表性。

表1 一般資料比較(-±s)

注：與其他兩組比較，*P<0.05

表2 Tektin-2基因rs12043423位點(diǎn)基因型的Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果[n(%)]

a：CC基因型；b：CT基因型；c：TT基因型；箭頭示rs12043423位點(diǎn)第136個(gè)堿基的測(cè)序結(jié)果

經(jīng)卡方檢驗(yàn)，CC和TT在三組間的分布存在顯著差異(分別為χ2=6.060，P=0.048；χ2=6.146，P=0.046)，而CT在三組間的分布頻率無顯著性差異(χ2=0.952，P=0.621)。弱精子癥組的CC基因型頻率顯著低于正常對(duì)照組及不育癥組(P<0.05)，而TT基因型頻率則顯著增加(P<0.05)(表3)。

表3 Tektin-2基因rs12043423(136C>T)的基因型的分布頻率[n(%)]

注：與其他兩組比較，*P<0.05

弱精子癥組C等位基因的分布頻率顯著低于正常對(duì)照組和不育癥組，而T等位基因的頻率顯著高于正常對(duì)照組和不育癥組(P<0.05)。不育癥組和正常對(duì)照組比較，不同基因型的分布頻率及等位基因的頻率在兩組間均無顯著性差異(P>0.05)(表4)。

表4 Tektin-2基因rs12043423(136C>T)的等位基因頻率的比較[n(%)]

注：與其他兩組比較，*P<0.05

三、Tektin-2基因rs12043423多態(tài)性位點(diǎn)與特發(fā)性弱精子癥的危險(xiǎn)因素分析

對(duì)Tektin-2基因SNP位點(diǎn)單個(gè)基因型進(jìn)行初步分析，以野生型C/C為參照，對(duì)雜合型C/T和突變型T/T在正常對(duì)照組、不育癥組和弱精子癥組三組間兩兩進(jìn)行χ2檢驗(yàn)和發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)分析。為便于分析，將基因型多態(tài)性合并為二分類變量，產(chǎn)生遺傳學(xué)顯性模型、隱性模型和等位基因三種二分類結(jié)果，將其與弱精子癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行單因素分析。結(jié)果表明顯性模型的OR值小于1，進(jìn)一步表明在Tektin-2基因多態(tài)性的分布中基因型C/C是特發(fā)性弱精子癥發(fā)病的保護(hù)因素，而突變型T/T是特發(fā)性弱精癥發(fā)病的危險(xiǎn)因素(表5)。

表5 Tektin-2基因rs12043423多態(tài)性位點(diǎn)與特發(fā)性弱精子癥的危險(xiǎn)因素分析[n(%)]

四、rs12043423多態(tài)性位點(diǎn)與Tektin-2蛋白表達(dá)的關(guān)系

Tektin-2基因rs12043423位點(diǎn)突變?yōu)殄e(cuò)義突變，其蛋白質(zhì)的改變?yōu)镽46C，我們使用PolyPhen-2分析該變體，結(jié)果表明可能具有破壞性(圖2)。另外，精氨酸在Tektin-2蛋白的第46位的疏水性與野生型顯著不同，并且如果精氨酸被取代可導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)被修飾。

圖2 PolyPhen2分析預(yù)測(cè)Tektin-2蛋白R(shí)46C的致病性

討 論

弱精子癥已被確定為男性不育的重要因素之一[9]。染色體異常、微生物感染、內(nèi)分泌紊亂、精索靜脈曲張及自身免疫等因素是弱精子癥較明確的發(fā)病病因，而精子運(yùn)動(dòng)缺陷的潛在分子機(jī)制仍在很大程度上不為所知。弱精子癥是一種常見于原發(fā)性纖毛運(yùn)動(dòng)障礙(PCD)的表型，是一種罕見的常染色體隱性遺傳疾病，可能導(dǎo)致精子鞭毛的作用受損[10-11]。Tektins是一種高度保守的鞭毛和睫狀蛋白家族，在哺乳動(dòng)物中，Tektins存在于睪丸、腦、視網(wǎng)膜和其他含有纖毛細(xì)胞的組織中[12-13]。Tektins是一種不溶性的α-螺旋蛋白，與中間絲(IF)蛋白和核纖層蛋白相關(guān)，因此認(rèn)為Tektins可能在纖毛運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮重要作用[14]。Tektin-2蛋白定位于成熟精子的尾部。其高度保守的序列表明，Tektin-2在鞭毛的形成中具有重要作用[15]。已有研究表明Tektins與弱精子癥具有相關(guān)性，許祥等[5]研究中證實(shí)在弱精子癥患者的精子中Tektin-2的表達(dá)顯著下降。國(guó)外學(xué)者Bhilawadikar等[16]的研究也表明Tektin-2的水平在活力差的精子中表達(dá)顯著下降。另外Zuccarello等[17]報(bào)道了Tektin-2的A229V位點(diǎn)的多態(tài)性可能與弱精子癥具有相關(guān)性。Zhang等[18]研究了中國(guó)四川男性Tektin-2的多態(tài)性與弱精子癥的相關(guān)性，但是國(guó)內(nèi)關(guān)于Tektin-2的其他的多態(tài)性位點(diǎn)的報(bào)道尚少。

單核苷酸多態(tài)性(SNP)普遍存在于人類的基因組中，平均每500～1 000個(gè)堿基對(duì)中就有1個(gè)。單核苷酸多態(tài)性發(fā)生在編碼區(qū)的概率很小，幾乎為周圍序列的1/5左右。這種發(fā)生在編碼區(qū)的SNP稱為cSNP，主要分兩種：一種是同義cSNP(synonymous cSNP)，即SNP所致的編碼序列的改變并不影響其所翻譯的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，突變堿基與未突變堿基的含義相同；另一種是非同義cSNP(non-synonymous cSNP)，指堿基序列的改變使得的蛋白質(zhì)序列也發(fā)生改變，從而影響了蛋白質(zhì)的功能。這種改變常是導(dǎo)致生物性狀改變的直接原因。cSNP中約有一半為非同義cSNP。本研究中發(fā)現(xiàn)的Tektin-2基因的rs12043423(c.136C>T)即為非同義突變也稱錯(cuò)義突變。蛋白質(zhì)的改變?yōu)镽46C，精氨酸在Tektin-2蛋白的第46位的疏水性與野生型顯著不同，這可能是影響Tektin-2蛋白結(jié)構(gòu)和功能的原因，進(jìn)而影響精子的活力。

本研究將人群分為弱精子癥、不育癥和正常對(duì)照三組進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)弱精子癥組Tektin-2基因的突變位點(diǎn)rs12043423(c.136C>T)的分布頻率與其他兩組存在顯著差異；而不育癥組和正常對(duì)照組之間比較，Tektin-2基因的rs12043423(c.136C>T)的分布頻率不存在顯著差異。弱精子癥組rs12043423(c.136C>T)的TT基因型分布頻率較正常對(duì)照組和不育癥組均顯著增高(χ2=4.465，P=0.035；χ2=4.109，P=0.043)。結(jié)果表明Tektin-2基因的rs12043423位點(diǎn)突變與精子活力相關(guān)。正常對(duì)照組為精液正常已生育的男性，不育癥組為精液正常未生育的男性，兩組間Tektin-2基因的rs12043423位點(diǎn)的基因分布頻率無顯著差異，表明此突變與男性不育不直接相關(guān)。

弱精子癥組和正常對(duì)照組比較，Tektin-2基因突變(雜合子[CT]和純合子[TT])的發(fā)生率分別為61.5%和50.2%；TT基因型與弱精子癥的風(fēng)險(xiǎn)因素分析結(jié)果為[OR=1.968，95%CI(1.041，3.723)，P=0.035]，表明這種突變可能是弱精子癥發(fā)生的可能風(fēng)險(xiǎn)。弱精子癥與不育癥組比較，Tektin-2基因突變(雜合子[CT]和純合子[TT])的發(fā)生率分別為61.5%和51.5%；TT基因型與弱精子癥的風(fēng)險(xiǎn)因素分析結(jié)果為[OR=1.918，95%CI(1.014，3.630)，P=0.043]，同樣表明這種突變可能是弱精子癥發(fā)生的可能風(fēng)險(xiǎn)。

秦皇島地區(qū)地處環(huán)渤海，屬于暖溫帶氣候，受海洋影響較大。目前，這是秦皇島地區(qū)第一個(gè)關(guān)于Tektin-2基因的SNP與特發(fā)性弱精子癥之間關(guān)聯(lián)的研究。本研究結(jié)果表明，Tektin-2變體(R46C)可能與特發(fā)性弱精子癥有關(guān)，是弱精子癥發(fā)病的危險(xiǎn)因素。但是由于樣本量有限，我們應(yīng)該進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量分析Tektin-2蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，以證明這些變異影響成熟精子的Tektin-2蛋白活性、蛋白質(zhì)合成和鞭毛損傷。此外，未來的研究包括不同種族和地理來源的受試者，還應(yīng)進(jìn)行Tektin-2基因與其他與弱精子癥相關(guān)的基因的結(jié)合分析。