吳明霞，鄭昇陽

（寧德師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建寧德352100）

糖尿病已成為繼癌癥和心腦血管疾病之后嚴(yán)重威脅人類健康的第三大疾病[1]，目前治療藥物因效果不佳且長期使用對(duì)人體產(chǎn)生的副作用而其使用受到限制。因此，研發(fā)天然安全的降血糖藥物具有重要意義。α-葡萄糖苷酶抑制劑已成為安全降血糖的一級(jí)藥物得到廣泛推廣[2]。

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是一類發(fā)酵糖類物質(zhì)產(chǎn)生乳酸的無芽孢革蘭氏陽性菌總稱，至少含有 23 個(gè)菌屬，共 200 多種[3]，有多重功能性[4-6]得到證實(shí)。測定乳酸菌發(fā)酵上清液中α-葡萄糖苷酶抑制力可作為篩選潛在降血糖菌株的可靠依據(jù)[7-8]。有研究證明：最適益生菌菌株是來自宿主胃腸道，才能在宿主胃腸道的胃酸、膽汁等一系列不良環(huán)境中存活下來，從而發(fā)揮其最佳益生作用[9]。

胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）是乳酸菌生長代謝過程中分泌于細(xì)胞壁外滲到培養(yǎng)基的一類多糖類化合物，是乳酸菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物[10]，具有多種生物活性[11-13]。胞外多糖在體外具有抑制α-葡萄糖苷酶的活力[14]，具有潛在降血糖能力。

關(guān)于乳酸菌胞外多糖降血糖能力的研究相對(duì)較少[15]。目前未見變溫優(yōu)化胞外多糖和α-葡萄糖苷酶抑制活性工藝的研究。本文考慮到最適生長溫度與最適代謝合成溫度往往不一致[16]，采用分階段控制溫度策略提高胞外多糖產(chǎn)量和α-葡萄糖苷酶抑制力，第一階段選取人源乳酸菌最適生長溫度，變溫時(shí)間選取胞外多糖趨于穩(wěn)定時(shí)間，第二階段采用最適胞外多糖合成溫度能高效提高胞外多糖濃度產(chǎn)量和α-葡萄糖苷酶抑制率，為降血糖藥物的應(yīng)用和大規(guī)模生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

鼠李糖乳桿菌：來源于健康人體糞便，寧德師范學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保藏。

葡萄糖、蔗糖、蛋白胨、酵母膏、乙酸鈉、CaCl2、MgCl2、無水MgSO4、MnSO4·7H2O、MnSO4·H2O、磷酸氫二胺（均為分析純）：福建科翰實(shí)驗(yàn)儀器貿(mào)易有限公司；磷酸氫二銨（分析純）：北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司；牛肉膏：北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司；KH2PO4、吐溫-80（分析純）：北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司；對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷、α-葡萄糖苷酶（生物試劑）：美國 Sigma 公司。

1.1.2 儀器

GR60DR 型高壓滅菌鍋：致微（廈門）儀器有限公司；DNP-9162 型恒溫培養(yǎng)箱、DHG-9123A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司；MC 型電子天平：奧豪斯儀器常州有限公司；T6 型紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用有限責(zé)任公司；ZHJHC1109C 型超凈工作臺(tái)：上海智誠科技有限公司。

1.2 培養(yǎng)基配制

MRS 固體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏5 g，檸檬酸二胺2 g，葡萄糖5 g，蔗糖50 g，吐溫-80 1 mL，乙酸鈉 5 g，磷酸氫二鉀 2 g，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·H2O 0.25 g，磷酸氫二胺 2 g，瓊脂 18 g 115 ℃滅菌20 min 備用。

MRS 液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，葡萄糖20 g，乙酸鈉2 g，磷酸氫二鉀2 g，磷酸氫二胺2 g，乙酸鈉 2 g，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·H2O 0.25 g，吐溫 801 mL，蒸餾水 1 000 mL，115 ℃滅菌 20 min 備用。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 工藝流程

鼠李糖乳桿菌→斜面培養(yǎng)→種子培養(yǎng)→發(fā)酵培養(yǎng)→發(fā)酵液抽濾→濃縮→離心→沉淀→烘干→胞外多糖→測定α-葡萄糖苷酶抑制活力

1.3.2 培養(yǎng)方法

1.3.2.1 斜面培養(yǎng)

取保藏菌種在試管MRS 斜面培養(yǎng)基中劃線培養(yǎng)，37 ℃恒溫培養(yǎng) 12 h，在 3 500 r/min、4 ℃條件下離心10 min，用5 mL 0.85 %的生理鹽水洗滌沉淀菌種2次～3 次后制成發(fā)酵劑備用（發(fā)酵種子液的菌濃度達(dá)105CFU/mL）。

1.3.2.2 種子培養(yǎng)

將5 mL 菌懸液接種于裝有40 mL 液體培養(yǎng)基的100 mL 三角瓶中，37 ℃擴(kuò)大培養(yǎng)12 h 進(jìn)行活化種子培養(yǎng)。

1.3.2.3 恒溫發(fā)酵培養(yǎng)

將種子培養(yǎng)液接種于120 mL 液體培養(yǎng)基1 000 mL三角瓶中，分別在 31、33、35、37、39、41 ℃恒溫培養(yǎng)60 h，每隔6 h 測定發(fā)酵液OD600nm、胞外多糖濃度和α-葡萄糖苷酶抑制率。

1.3.2.4 分階段控制溫度發(fā)酵培養(yǎng)

將種子培養(yǎng)液接種于液體培養(yǎng)基培養(yǎng)60 h，第一階段溫度分別為36、37、38 ℃，變溫時(shí)間分別為46、48、50 h，第二階段溫度分別為 38、39、40 ℃，每隔 6 h測定α-葡萄糖苷酶抑制率。

1.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 第一階段溫度對(duì)菌體生長的影響

將種子培養(yǎng)液接種于120 mL 液體培養(yǎng)基的1 000 mL 三角瓶中，分別在 31、33、35、37、39、41 ℃恒溫培養(yǎng)60 h，每隔6 h 測定發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵液菌體生長的影響，確定乳酸菌最適生長溫度，即分階段控制溫度策略第一階段溫度。

1.4.2 變溫時(shí)間對(duì)乳酸菌胞外多糖產(chǎn)量的影響

將種子培養(yǎng)液接種于120 mL 液體培養(yǎng)基的1 000 mL 三角瓶中，分別測定 31、33、35、37、39、41 ℃在0、6、12、18、24、30、36、42、48、54、60 h 對(duì)發(fā)酵液胞外多糖產(chǎn)量的影響，確定分階段控制溫度策略變溫時(shí)間。

1.4.3 第二階段溫度對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的影響

將種子培養(yǎng)液接種于入120 mL 液體培養(yǎng)基的1 000 mL 三角瓶中，分別在 31、33、35、37、39、41 ℃恒溫培養(yǎng)60 h，每隔6 h 測定發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵液α-葡萄糖苷酶抑制率的影響，確定抑制α-葡萄糖苷酶活力的最佳溫度，即分階段控制溫度策略第二階段溫度。

1.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取第一階段溫度、變溫時(shí)間、第二階段溫度3 個(gè)因素，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，按照Box-Behnken 中心組合原理，使用Design-Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以α-葡萄糖苷酶抑制率為響應(yīng)值進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。因素水平編碼表見表1。

表1 因素水平編碼表Table 1 Table of factors and levels

1.6 發(fā)酵溫度對(duì)分階段控制溫度α-葡萄糖苷酶抑制率的影響

將種子培養(yǎng)液接種于入120 mL 液體培養(yǎng)基的1 000 mL 三角瓶中，在第一階段溫度37 ℃，變溫時(shí)間50 h，第二階段溫度40 ℃時(shí)培養(yǎng)72 h，每隔6 h 測定α-葡萄糖苷酶抑制率，確定分階段控制溫度最佳發(fā)酵時(shí)間。

1.7 測定指標(biāo)與方法

1.7.1 生長曲線的測定

將經(jīng)過3 次傳代培養(yǎng)8 h 至對(duì)數(shù)期的新鮮培養(yǎng)物按0.1%（體積分?jǐn)?shù)）接種量接入MRS 培養(yǎng)基中，每隔6 h 取樣測定 OD600nm值[17]。

1.7.2 胞外多糖濃度的測定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：準(zhǔn)確稱取葡萄糖20 mg 于500 mL容量瓶中，加水至刻度，分別吸取 0.4、0.6、0.8、1.0、1.12、1.4、1.6、1.8，并以蒸餾水補(bǔ)至 2.0 mL，然后加入 6%苯酚1.0 mL 及濃硫酸5.0 mL，搖勻冷卻，室溫25 ℃放置20 min 后于490 nm 測定吸光度。橫坐標(biāo)為葡萄糖濃度，縱坐標(biāo)為吸光度值，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

苯酚-硫酸法：取2 mL 發(fā)酵液加入1 mL5%的苯酚溶液，5 mL95%的濃硫酸，靜置20 min，高速振蕩搖勻，靜置 20 min 至冷卻，測定 OD490nm值[18]。

1.7.3 α-葡萄糖苷酶抑制率的測定

取 25 μL 發(fā)酵上清液添加 50 μL pH 6.8，濃度0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液，再加入50 μL 20 mmol/L的對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷溶液，將混合物于37 ℃恒溫箱放置10 min，加入 30 μLα-葡萄糖苷酶溶液20 U/mL 繼續(xù)反應(yīng)20 min，加入50 μL 濃度為1 mol/L碳酸鹽溶液作為反應(yīng)終止液，將反應(yīng)液于405 nm 處測定吸光度值，吸光度值與對(duì)硝基苯酚的游離量成正比，采用0.1 mol/L 磷酸鹽溶液作為空白對(duì)照[19]，以阿卡波糖作陽性對(duì)照[20]。對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率按式（1）計(jì)算如下：

式中：Y 為 α-葡萄糖苷酶抑制率，%；m1為樣品組溶液濃度，mmol/L；m2為樣品空白組溶液濃度，mmol/L；m3為對(duì)照組溶液濃度，mmol/L；m4為空白組溶液濃度，mmol/L。

1.8 數(shù)據(jù)分析

本文采用Design Expert 8.0.6 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以葡萄糖濃度為標(biāo)準(zhǔn)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)胞外多糖濃度進(jìn)行標(biāo)定，見圖1。

圖1 葡萄糖濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose concentration

2.2 分階段控制溫度第一階段溫度的影響

溫度是影響微生物生長繁殖最重要的因素之一。溫度對(duì)菌體生長的影響見圖2。

圖2 不同溫度的菌體生長曲線Fig.2 Growth gurves at different temperature

由圖2 可知，發(fā)酵溫度37 ℃培養(yǎng)54 h 時(shí)OD600nm最大。有研究表明，菌體生長與胞外多糖的合成為部分偶聯(lián)型[21]，因此在提高胞外多糖產(chǎn)量時(shí)，必須同時(shí)考慮菌種生長特性[22]。即分階段控制溫度策略第一階段最佳溫度為37 ℃。

2.3 變溫時(shí)間的確定

胞外多糖產(chǎn)量與產(chǎn)糖菌株生長環(huán)境溫度、pH 值及蛋白含量組分有關(guān)[23]，不同溫度對(duì)胞外多糖的影響見圖3。

圖3 不同溫度對(duì)胞外多糖的影響Fig.3 Effects of different temperatures on extracellular polysaccharides

當(dāng)溫度較低時(shí)，胞外多糖濃度較低，這可能是因?yàn)榈蜏囟仁购铣砂舛嗵堑念惍愇於┲|(zhì)載體發(fā)生鈍化作用，使代謝產(chǎn)物胞外多糖含量降低[24]；當(dāng)溫度39 ℃培養(yǎng)42 h 時(shí)胞外多糖量最大；當(dāng)溫度繼續(xù)增加時(shí)，微生物因生長代謝過快分泌能夠降解多糖的酶而使其產(chǎn)量開始下降[25]。因此，胞外多糖的最佳發(fā)酵溫度 39 ℃。

由圖3 可知，當(dāng)發(fā)酵溫度39 ℃時(shí)48 h 胞外多糖產(chǎn)量趨于穩(wěn)定。這可能是因?yàn)榘l(fā)酵中期是細(xì)胞中單糖聚合成多糖的過程，當(dāng)發(fā)酵后期菌體分泌胞外多糖量趨于穩(wěn)定[18]。因此，分階段控制溫度策略的最佳變溫時(shí)間為48 h。

2.4 第二階段溫度的確定

吳學(xué)強(qiáng)[25]研究發(fā)現(xiàn)α-葡萄糖苷酶的抑制劑的抑制機(jī)理與胞外多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶產(chǎn)生競爭性抑制的作用有關(guān)。發(fā)酵溫度對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的影響見圖4。

圖4 不同溫度對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的影響Fig.4 Effect of different temperatures on inhibition rate of alphaglucosidase

由圖4 可知，當(dāng)溫度較低時(shí)，α-葡萄糖苷酶抑制率較低，這可能是與胞外多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶具有抑制作用的活性物質(zhì)分泌出細(xì)胞外較少有關(guān)[15]。在溫度39 ℃發(fā)酵54 hα-葡萄糖苷酶抑制率最大，這可能是因?yàn)榭臻g構(gòu)象有利于酶解活性產(chǎn)物的生成而產(chǎn)生反饋抑制[26]，則α-葡萄糖苷酶抑制率增加；當(dāng)發(fā)酵溫度繼續(xù)增加，α-葡萄糖苷酶抑制率下降。因此，分階段控制溫度策略的第二階段最佳溫度為39 ℃。

2.5 響應(yīng)面法確定分階段控制溫度

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，選取第一階段溫度、變溫時(shí)間、第二階段溫度為自變量，采用中心組合設(shè)計(jì)進(jìn)行三因素三水平試驗(yàn)，以α-葡萄糖苷酶抑制率為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面分析，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of response surface methodology

2.6 響應(yīng)面分析和優(yōu)化

采用Design-Expert 8.0.6 軟件對(duì)表2 試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，建立提取模型，分析結(jié)果見表3。

表3 回歸模型方差分析及顯著性檢驗(yàn)Table 3 Analysis of variance for the regression model

續(xù)表3 回歸模型方差分析及顯著性檢驗(yàn)Continue table 3 Analysis of variance for the regression model

由表3 可知，回歸模型當(dāng)p＞F 值小于0.05 時(shí)，即表示該指標(biāo)顯著；當(dāng)p＞F 值小于0.01 時(shí)，即表示該指標(biāo)極顯著。因此，A 不顯著，B、C 極顯著；二次項(xiàng) A2、C2不顯著，B2顯著；在交互項(xiàng)中，AB、AC 不顯著，BC 對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率影響達(dá)到顯著水平；失擬項(xiàng)不顯著，R2=0.931 1，R2Ad=0.842 5，這表明模型可以較好地解釋試驗(yàn)分階段控制溫度對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率影響的變化。通過比較回歸方程中的一次項(xiàng)系數(shù)絕對(duì)值的大小，可判斷因素影響的大小關(guān)系。因此各個(gè)因素對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的影響程度依次為：第二階段溫度＞變溫時(shí)間＞第一階段溫度。各因素經(jīng)二次多項(xiàng)式回歸擬合后，得到第一階段溫度、變溫時(shí)間、第二階段溫度3 個(gè)因素對(duì)α-葡萄糖苷酶影響的二次多項(xiàng)回歸方程為：

由以上分析可知，各因素對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制性影響復(fù)雜，并非簡單的線性關(guān)系，且當(dāng)?shù)谝浑A段37 ℃，變溫時(shí)間50 h，第二階段溫度40 ℃時(shí)，α-葡萄糖苷酶抑制率最大為53.60%。因此，采取分階段控制溫度策略提高α-葡萄糖苷酶抑制率是可行的。

2.7 響應(yīng)面圖和等高線圖分析

從響應(yīng)面曲線和等高線分析圖可得到最佳參數(shù)及各參數(shù)之間的相互作用，各因素及其對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制的響應(yīng)面及等高線圖見圖5。

由式2 可知，A、B、C 二次項(xiàng)系數(shù)均為負(fù)值。表示方程的拋物面開口向下有極大值點(diǎn)；由圖5 可知，從響應(yīng)面曲線和等高線分析圖可得到最佳參數(shù)及各參數(shù)之間的相互作用：A、B、C 特征值響應(yīng)面圖為山丘形曲面，即有極大值，二者結(jié)果相同。

2.8 驗(yàn)證試驗(yàn)

為驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。當(dāng)?shù)谝浑A段溫度37 ℃，變溫時(shí)間50 h，第二階段溫度40 ℃發(fā)酵66 h時(shí)α-葡萄糖苷酶抑制率為55.78%，與理論預(yù)測值誤差為4.06%。表明該結(jié)果可靠的。

圖5 各因素及其交互作用對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率影響的等高線及響應(yīng)面曲線圖Fig.5 Contour plot and response surface plot of the effects of various factors and interactions on the inhibition rate of alpha-glucosidase

2.9 分階段控制溫度工藝發(fā)酵時(shí)間的優(yōu)化

為優(yōu)化分階段控制溫度工藝發(fā)酵時(shí)間，當(dāng)?shù)谝浑A段溫度37 ℃，變溫時(shí)間50 h，第二階段溫度40 ℃時(shí)研究發(fā)酵時(shí)間對(duì)α-葡萄糖抑制率的影響，見圖6。

圖6 分階段控制溫度工藝發(fā)酵時(shí)間的優(yōu)化Fig.6 Optimization of fermentation time in stage-controlled temperature process

由圖6 可知，分階段控制溫度能顯著延長乳酸菌穩(wěn)定期，穩(wěn)定期為54 h～66 h。當(dāng)?shù)谝浑A段溫度37 ℃，變溫時(shí)間50 h，第二階段溫度40 ℃發(fā)酵66 h 時(shí)，α-葡萄糖苷酶抑制率為58.21%，即分階段控制溫度最適宜發(fā)酵時(shí)間為66 h。

3 結(jié)論

采取分階段控制溫度即當(dāng)?shù)谝浑A段溫度37 ℃，變溫時(shí)間50 h，第二階段溫度40 ℃發(fā)酵66 h 時(shí)，α-葡萄糖苷酶抑制率為58.21%，結(jié)果表明，分階段控制溫度發(fā)酵乳酸菌能顯著提高α-葡萄糖苷酶抑制率，這將對(duì)降血糖藥物的開發(fā)提供參考意義。