大山楂顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

杜成興 劉明旭 潘年瓊 馮發(fā)進(jìn) 霍昕 楊迺嘉

（1.貴州省生物技術(shù)研究開(kāi)發(fā)基地，貴州貴陽(yáng) 550002；2.貴州省科暉制藥廠，貴州清鎮(zhèn) 551400）

大山楂顆粒由山楂、六神曲、炒麥芽三味中藥組成，是根據(jù)2020年版《中國(guó)藥典》中的大山楂丸[1]處方改劑而成。大山楂顆粒的制劑方法與大山楂丸不同，大山楂丸是直接將藥材粉碎成細(xì)粉加入輔料制得的，大山楂顆粒是將藥材通過(guò)水煮后濃縮成浸膏再加入輔料制得的。丸劑釋藥緩慢，可延長(zhǎng)藥效、降低毒性和刺激性，減少不良反應(yīng)，適用于慢性病治療或病后調(diào)和氣血，但對(duì)于老人小孩及吞咽困難的人群來(lái)說(shuō)不易服用；顆粒劑具有易溶解、易吸收、口感好的優(yōu)點(diǎn)，更適合老人小孩及吞咽困難的人群服用[2-3]。處方中，山楂有降血壓、調(diào)血脂的作用，同時(shí)可保護(hù)肝臟，具有強(qiáng)心、抗氧化、提高免疫力的作用[4-5]。六神曲能夠消食化積、健脾和胃[6-8]。炒麥芽能行氣消食回乳，具有助消化、降血糖、抗真菌、抑制催乳素釋入等作用[9-10]。

在2020年版《中國(guó)藥典》中，大山楂丸是采用薄層色譜法檢測(cè)熊果酸的含量來(lái)測(cè)定的，但薄層色譜法存在一些缺陷，如受鋪板質(zhì)量、點(diǎn)樣技術(shù)、展開(kāi)條件、顯色效果等因素的影響，使測(cè)定結(jié)果誤差較大。高效液相色譜法比薄層色譜法更靈敏、簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確，且精密度好，能更好地控制藥物的質(zhì)量。熊果酸是脂溶性成分，大山楂顆粒是山楂、六神曲、炒麥芽的水煎煮液濃縮成浸膏制備而成，經(jīng)HPLC含量測(cè)定發(fā)現(xiàn)浸膏中熊果酸含量較低，而原兒茶酸的含量較高，且金絲桃苷、蘆丁、牡荊素等均不能鑒別出來(lái)，故選擇原兒茶酸作為指標(biāo)成分進(jìn)行檢測(cè)[11-14]。本研究采用高效液相色譜法對(duì)原兒茶酸進(jìn)行含量測(cè)定，以期建立大山楂顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[15]，為大山楂顆粒的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1.儀器和材料

1.1 儀器

JJ20000B型電子天平（常熟市雙杰測(cè)試儀器廠），AUW120D型電子天平（島津儀器蘇州有限公司），AL204型電子天平（梅特勒—托利多儀器有限公司），ZF-90型多功能暗箱式紫外投射儀（上海山顧村電光儀器廠），Ultimate 3000高效液相色譜儀（美國(guó)賽默飛公司），SPD-16C 高效液相色譜儀（島津儀器蘇州有限公司），GZX-9140MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。其他儀器均由貴州省生物技術(shù)研究開(kāi)發(fā)基地提供。

1.2 材料

熊果酸對(duì)照品（批號(hào)：110742-200314）、原兒茶酸對(duì)照品（批號(hào)：110809-201205）、金絲桃苷對(duì)照品（批號(hào)：111521-201809）、蘆丁對(duì)照品（批號(hào)：100080-201610）、牡荊素對(duì)照品（批號(hào)：11687-201704）、山楂對(duì)照藥材（批號(hào)：121138-201606）均采購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。大山楂顆粒樣品、藥材及試劑由貴州省生物技術(shù)研究開(kāi)發(fā)基地提供。

2.方法和結(jié)果

2.1 大山楂顆粒的TLC定性鑒別

取大山楂顆粒研細(xì)，稱取3g，加入50%乙醇2ml潤(rùn)濕，再加入乙酸乙酯10ml，超聲30min，過(guò)濾，濾液揮干，加入乙酸乙酯1ml溶解，得供試品溶液；取山楂對(duì)照藥材3g，同法制得山楂對(duì)照藥材溶液；取缺山楂陰性樣品研細(xì)，稱取3g，同法制得缺山楂陰性樣品溶液。吸取上述三種溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜板上，以乙酸乙酯—環(huán)己烷—甲酸（10:3:1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出晾干，噴以0.1%溴甲酚綠（溴甲酚綠0.1g，溶于100ml乙醇中，加1%NaOH溶液至藍(lán)色即可），吹至斑點(diǎn)清晰，結(jié)果見(jiàn)圖1。TLC圖譜顯示，大山楂顆粒在與山楂對(duì)照藥材相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，且顯色斑點(diǎn)清晰，陰性無(wú)干擾。

取15批大山楂顆粒研細(xì)，各稱取3g，同法測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，十五批大山楂顆粒供試品在與山楂對(duì)照藥材相應(yīng)的位置上，顯相同的黃色斑點(diǎn)，且斑點(diǎn)清晰，陰性無(wú)干擾。

圖1 山楂TLC色譜圖

圖2 十五批大山楂顆粒的TLC色譜圖

2.2 高效液相色譜法

2.2.1 色譜適應(yīng)性條件

依利特C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相為乙腈-1%醋酸水（5:95）；流速0.9ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)260nm；柱溫30℃；進(jìn)樣量10μL。結(jié)果表明，在此色譜條件下，原兒茶酸峰形較好，約9min左右出峰，理論塔板數(shù)高于3000。

2.2.2 樣品制備方法

取大山楂顆粒磨成細(xì)粉，稱取樣品1.0g，置于具塞錐形瓶中，加入0.1mol/L鹽酸2ml潤(rùn)濕，再加入20ml甲醇-1%醋酸水（7:3），超聲提取30min，過(guò)濾，加甲醇-1%醋酸水（7:3）定容到25ml，得樣品溶液。

2.2.3 對(duì)照品制備方法

精密稱取原兒茶酸對(duì)照品9.82mg，置于10ml容量瓶中，加入甲醇-1%醋酸水（7:3）溶液定容至刻度線；再?gòu)闹芯芰咳?ml于50ml容量瓶中，加入甲醇-1%醋酸水（7:3）溶液定容至刻度線，得到原兒茶酸對(duì)照品溶液（19.64μg/ml）。

2.2.4 指標(biāo)性成分篩選實(shí)驗(yàn)

按上述色譜條件對(duì)大山楂顆粒中原兒茶酸進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果表明在大山楂顆粒中檢出原兒茶酸，但在炒麥芽藥材中沒(méi)有檢測(cè)出，故選擇原兒茶酸作為指標(biāo)性成分。

2.2.5 方法學(xué)考察

（1）線性關(guān)系。精密配制6種濃度的原兒茶酸對(duì)照品溶液：2.455μg/ml、4.91μg/ml、9.82μg/ml、19.64μg/ml、39.28μg/ml、78.56μg/ml，分別進(jìn)樣 10μL，以原兒茶酸濃度為X軸，峰面積為Y軸，得線性回歸方程。結(jié)果表明，線性回歸方程為y=42756x+16583（r=0.9999），原兒茶酸在2.455μg/mL～78.56μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

（2）精密度實(shí)驗(yàn)。按2.2.1項(xiàng)下色譜條件，取同一濃度的原兒茶酸對(duì)照品溶液（19.64μg/ml），進(jìn)樣6次，每次10μL，以原兒茶酸對(duì)照品溶液（19.64μg/ml）為參照，計(jì)算樣品中原兒茶酸的含量。結(jié)果顯示，RSD=0.78%，符合中國(guó)藥典要求（RSD＜2%），表明HPLC儀器精密性良好。

（3）中間精密度實(shí)。按2.2.1項(xiàng)下色譜條件，取同一濃度的原兒茶酸對(duì)照品溶液（19.64μg/ml），進(jìn)樣6次，每次10μL，以原兒茶酸對(duì)照品溶液（19.64μg/ml）為參照，計(jì)算樣品中原兒茶酸的含量。結(jié)果顯示RSD=1.06%，符合《中國(guó)藥典》要求（RSD＜2%），表明中間精密度良好。

圖3 原兒茶酸HPLC色譜圖

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

（4）重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。取大山楂顆粒磨成細(xì)粉，精密稱取6份，每份1.0g。按2.2.2項(xiàng)下制備方法，得到樣品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣6次，每次10μL，以原兒茶酸對(duì)照品溶液（19.64μg/ml）為參照，計(jì)算樣品中原兒茶酸的含量。結(jié)果顯示RSD=0.33%，符合《中國(guó)藥典》要求（RSD＜2%），表明實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。

（5）穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。取大山楂顆粒磨成細(xì)粉，精密稱取1.0g。按2.2.2項(xiàng)下制備方法，得樣品溶液，間隔1h進(jìn)樣一次，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣6次，每次10μL，以原兒茶酸對(duì)照品溶液（19.64μg/ml）為參照，計(jì)算樣品中原兒茶酸的含量。結(jié)果顯示RSD=0.66%，符合中國(guó)藥典要求（RSD＜2%），表明供試品在6h內(nèi)穩(wěn)定。

（6）加樣回收率實(shí)驗(yàn)。取大山楂顆粒磨成細(xì)粉，精密稱取9份，每份1.0g，分為3組。每組按取樣量的50%、100%、150%分別加入原兒茶酸對(duì)照品，按2.2.2項(xiàng)下制備方法，得樣品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣9次，每次10μL，以原兒茶酸對(duì)照品溶液（19.64μg/ml）為參照，計(jì)算樣品中原兒茶酸的含量，結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果顯示，平均加樣回收率結(jié)果為102.55%，RSD=0.83%，符合《中國(guó)藥典》要求（RSD＜2%），表明實(shí)驗(yàn)可行性良好，該方法可用于大山楂顆粒的含量測(cè)定。

2.2.6 含量測(cè)定

取15個(gè)不同批次的大山楂顆粒磨成細(xì)粉，每份稱取1.0g，按2.2.2項(xiàng)下制備方法，得樣品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣6次，每次10μL，以原兒茶酸對(duì)照品溶液（19.64μg/ml）為參照，計(jì)算樣品中原兒茶酸的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明：大山楂顆粒中原兒茶酸的平均含量為0.0653mg/g，最低為0.0265mg/g。

3.結(jié)論與討論

由于大山楂顆粒是通過(guò)水煎煮而得的，且炒麥芽與六神曲中存在許多酶類(lèi)，所以在煎煮過(guò)程中，許多的成分都通過(guò)酶反映了在煎煮過(guò)程中有許多成分可能會(huì)發(fā)生變化。通過(guò)多次的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在處方藥材中能夠檢測(cè)出來(lái)的許多成分在樣品中不能被檢測(cè)出來(lái)，而樣品中能被檢測(cè)出的成分在藥材中有不能被檢測(cè)出來(lái)。在高效液相色譜法測(cè)定山楂含量中，對(duì)已有山楂報(bào)道中的很多成分檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，在樣品中都不能被檢測(cè)出來(lái)，經(jīng)過(guò)很多次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)原兒茶酸在藥材和樣品中都被檢測(cè)出來(lái)，通過(guò)試驗(yàn)得出藥材與樣品的轉(zhuǎn)化率均大于100%（三批樣品的轉(zhuǎn)化率分別是113%、137%、146%），說(shuō)明原兒茶酸在煎煮的過(guò)程中由于酶的作用生成了更多的原兒茶酸。因此，最低限量不是通過(guò)轉(zhuǎn)移率來(lái)計(jì)算，而是通過(guò)15批最低量再低一點(diǎn)來(lái)確定。

表2 含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對(duì)15批大山楂顆粒樣品的含量測(cè)定發(fā)現(xiàn)，大山楂顆粒的平均含量為0.0653mg/g，最低含量為0.0265mg/g，考慮到藥材每年含量會(huì)有所不同，因此將大山楂顆粒中的原兒茶酸的限量定為：大山楂顆粒每包含原兒茶酸不得少于50μg。另外，大山楂顆粒的薄層色譜鑒別中還有六神曲和炒麥芽都沒(méi)有被鑒別出來(lái)。含量測(cè)定方面，本研究沒(méi)能找出單一的一味藥的含量測(cè)定，只是控制了大山楂顆粒中原兒茶酸的總含量。穩(wěn)定性研究方面，也只是做了初步的研究，對(duì)于大山楂顆粒還需要做更長(zhǎng)期的穩(wěn)定性研究。