李文桂,陳雅棠

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 傳染病寄生蟲病研究所，重慶 400016

水皰性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus，VSV）所致的水皰性口炎是一種蟲媒介導(dǎo)的人獸共患病，主要感染家畜和野生嚙齒類動(dòng)物，常用滅活疫苗和弱毒苗等進(jìn)行免疫預(yù)防。VSV是一種負(fù)鏈RNA病毒，基因組大小為11 kb，可以插入4.5 kb的外源基因，研究發(fā)現(xiàn)插入的外源基因較穩(wěn)定，可高水平表達(dá)外源蛋白[1-2]。采用基因重排或刪除技術(shù)可以使VSV減毒，從而改造成理想的疫苗載體[3-4]。pVSV-GFP和pVSV-EGFP等重組質(zhì)粒可以表達(dá)綠色熒光蛋白（GFP）或增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP），這為篩選水皰性口炎病毒提供了方便[5-6]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者報(bào)道了大量重組水皰性口炎病毒疫苗，以水皰性口炎病毒為載體的病原體疫苗包括：埃博拉病毒（rVSV-GP）、馬爾堡病毒（rVSV-G）、Ⅰ型人類免疫缺陷病毒（rVSV-env/gag）、猴免疫缺陷病毒（rVSV-Gag）、猴逆轉(zhuǎn)錄病毒2型（rVSV-env）、嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒（rVSV-St19）、豬流行性腹瀉病毒（rVSV-St19）、呼吸道合胞病毒（rVSV-G/F）、尼帕病毒（rVSV-G/F）、拉沙病毒（rVSV-GPC）、淋巴細(xì)胞脈絡(luò)膜炎病毒（rVSV-GP）、柯薩奇病毒B3型（rVSV-VP1）、腸道病毒 71型（rVSV-VP1）、口蹄疫病毒（rVSVVP1）、人乳頭瘤病毒16型（rVSV-E7）、棉尾兔乳頭瘤病毒（rVSV-L1/E7）、漢坦 病毒（rVSVGPC）、辛諾柏病毒（rVSV-GPC）、安第斯病毒（rVSV-GPC）、克里米亞-剛果出血熱病毒（rVSVGPC）、巨細(xì)胞病毒（rVSV-gB）、單純皰疹病毒2型（rVSV-gD）、禽流感病毒（rVSV-HA/NP）、乙型肝炎病毒（rVSV-MS）、基孔肯雅病毒（rVSV-E2）、諾如病毒（rVSV-VP1）、藍(lán)舌病毒8型（rVSV-VP2）、博爾納病病毒（rVSV-GPC）、牛痘病毒（rVSVL1R/B5R）、結(jié)核分支桿菌（rVSV-Ag85A/TFP846）、潰瘍分枝桿菌（rVSV-Mu13720）、鼠疫耶爾森菌（rVSV-LcrV）和曼氏血吸蟲（rVSV-SmHSP70）等。本文將綜述這些水皰性口炎病毒介導(dǎo)的病原體疫苗的研制現(xiàn)狀。

1 重組水皰性口炎病毒抗病毒

1.1 絲狀病毒

1.1.1 埃博拉病毒 埃博拉病毒（Ebola virus，EBOV）感染可導(dǎo)致埃博拉出血熱。EBOV通常有5種基因型，即扎伊爾型、蘇丹型、科特迪亞型、萊斯頓型和本迪布焦型，其中扎伊爾型和蘇丹型EBOV的致死率可高達(dá)50%～90%。其基因組的ORF1和ORF2分別編碼GP1和GP2蛋白，它們組成異二聚體GP1/GP2蛋白，主要參與病毒的復(fù)制。將GP1/GP2蛋白的DNA疫苗注射小鼠可誘導(dǎo)一定的保護(hù)力[7]。邵鈺等[8]以EBOV基因組的DNA為模板擴(kuò)增GP基因，插入pCI-R2-VSV-FL得pCI-R2-VSVΔG-GP，加入pBS-N、pBS-L和pBS-N等輔助質(zhì)粒后，共同轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，對(duì)重組病毒進(jìn)行陽性篩選，Western印跡表明重組病毒呈現(xiàn)的53 kD的GP53蛋白可被陽性血清所識(shí)別，免疫電鏡證實(shí)重組病毒的粒子外觀呈子彈樣狀態(tài)。Wong等[9]將2×104PFU的rVSV-GP疫苗腹腔注射BALB/c鼠，第一次注射后6.5、9和12個(gè)月分別腹腔注射103LD50埃博拉病毒MA株進(jìn)行攻擊，攻擊后15 d提示第一次接種后6.5、9和12個(gè)月攻擊組的存活率分別為 100%（5/5）、100%（5/5）和 83%（10/12），而對(duì)照組為0（0/5）。接著，他們將2×105PFU的rVSV-GP疫苗腹腔注射豚鼠，分別在第一次注射后7、12和18個(gè)月用103LD50埃博拉病毒GA株進(jìn)行腹腔注射攻擊，攻擊后15 d計(jì)數(shù)存活，提示第一次接種后7、12和18個(gè)月攻擊組的存活率分別為80%（4/5）、100%（6/6）和100%（6/6），而對(duì)照組均為 0（0/4）。Lennemann 等[10]將 2×103、2×104、2×105、2×106和 2×107PFU 的 rVSV-GP 疫苗肌肉注射C57BL/6鼠。第一次注射后3周加強(qiáng)1次，第一次注射后6周顯示106和107PFU接種組的血清IgG升高，此時(shí)借助腹腔注射途徑用103PFU埃博拉病毒GA株進(jìn)行攻擊，攻擊后4周各組的存活率分別為 0（0/10）、0（0/10）、20%（2/10）、80%（8/10）和100%（10/10），而對(duì)照組為0（0/10）。

Geisbert等[11]將1×107PFU的rVSV-GP疫苗肌肉注射恒河猴，注射后30 d肌肉注射103PFU扎伊爾型Kikwrt株進(jìn)行攻擊，攻擊后30 d取血和鼻拭子，熒光定量PCR檢測(cè)提示接種組的病毒負(fù)荷顯著降低，免疫組和對(duì)照組存活率分別為67%（4/6）和0（0/3）。Mire等[12]將2×107PFU重組病毒肌肉注射恒河猴，注射后4周血清IgG升高，滴度為1∶40～1∶80，此時(shí)經(jīng)肌肉注射途徑用1×103PFU本迪布焦型EBOV進(jìn)行攻擊，攻擊后4周免疫組和對(duì)照組存活率分別為 100%（3/3）和0（0/3）。Fal?zarano等[13]將2×107PFU重組病毒肌肉注射恒河猴，注射后3周經(jīng)肌肉注射方法用104TCID50本迪布焦型EBOV進(jìn)行攻擊，攻擊后4周接種組和對(duì)照組存活率分別為100%（4/4）和25%（1/4），接種組的肛門和喉拭子病毒負(fù)荷下降至1/104。Meni?cucci等[14]將5×107PFU重組病毒肌肉注射恒河猴，注射后28 d通過肌肉注射方法用103PFU埃博拉病毒進(jìn)行攻擊，攻擊后1周經(jīng)轉(zhuǎn)錄組學(xué)檢測(cè)接種組的外周血單核細(xì)胞（PBMC）提示其中的B細(xì)胞激活，攻擊后2周呈現(xiàn)大量基因表達(dá)變化，表明存在回憶反應(yīng)。

Regules等[15]將3×106和2×107PFU重組病毒分別肌肉注射13例健康志愿者，發(fā)現(xiàn)血清IgG在注射后2～4周提升，注射后4周提升較高。Henao-Restrepo等[16]從446例感染埃博拉病毒的患者中挑選96例，通過肌肉注射途徑用2×107PFU重組病毒進(jìn)行免疫治療，治療后84 d提示75.1%（72/96）患者的癥狀明顯改善。Regules等[17]將 3×107、2×108和1×109PFU重組病毒分別肌肉注射20例感染埃博拉病毒的患者，28 d加強(qiáng)1次，顯示血清IgG在第一次治療后14～180 d有提升，第一次治療后56 d提升較高，其中3個(gè)治療組的IgG滴度分別達(dá)1∶4222、1∶7352和1∶4079。

1.1.2 馬爾堡病毒 馬爾堡病毒（Marburg virus，MarV）是急性出血熱的病原之一，將重組G蛋白接種豚鼠和恒河猴均可產(chǎn)生有效的保護(hù)力[18]。Daddario等[19]采用肌肉注射方法將103PFU馬爾堡病毒Musoke株感染恒河猴，感染后30 min通過肌肉注射途徑用1×107PFU rVSV-G疫苗進(jìn)行免疫治療，治療后37 d提示血清中和抗體提升，滴度可達(dá)1∶32～1∶32 100，流式細(xì)胞分析（FACS）證實(shí)血PBMC中IFN-γ+/TNF-α+CD4+T細(xì)胞數(shù)有一定程度的增加，治療后80 d免疫組和對(duì)照組存活率分別為100%（4/4）和0（0/4）。Woolsey等[20]通過肌肉注射途徑用50 PFU馬爾堡病毒Angola株感染恒河猴，感染后30 min肌肉注射107PFU rVSV-G疫苗進(jìn)行免疫治療，治療后28 d血清IgG和IgM提升，病毒負(fù)荷降低，免疫組和對(duì)照組存活率分別為78%（7/9）和0（0/4）。Marzi等[21]將1×107PFU的rVSV-G疫苗肌肉注射恒河猴，注射后4周血清IgG提升，F(xiàn)ACS顯現(xiàn)血PBMC中CD29+CD95+記憶性T細(xì)胞、CD28-CD95+記憶性T細(xì)胞和IgD-CD27+B細(xì)胞數(shù)目增加，ELISPOT提示血PBMC中IFN-γ+SFC增加，此時(shí)肌肉注射103PFU馬爾堡病毒Angola株進(jìn)行攻擊，攻擊后5周血清的病毒負(fù)荷明顯降低，免疫組和對(duì)照組存活率分別為100%（6/6）和0（0/4）。

1.2 逆轉(zhuǎn)錄病毒

1.2.1Ⅰ型人類免疫缺陷病毒 Ⅰ型人類免疫缺陷病毒（Humanimmunodeficiencyvirustype1，HIV-1）的Gag基因編碼核衣殼蛋白P24、P7和內(nèi)膜蛋白P14。Cooper等[22]將Gag基因插入pVSV得pVSV-Gag，加輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，對(duì)重組病毒進(jìn)行陽性篩選，Western印跡表明重組病毒呈現(xiàn)的55 kD的P55蛋白和39 kD的P39蛋白可被陽性血清所識(shí)別，將1×107PFU重組病毒肌肉注射或滴鼻接種BALB/c鼠，第一次接種后8周加強(qiáng)1次，第一次接種后12周血清IgG升高，脾CTL反應(yīng)增強(qiáng)，ELISPOT顯現(xiàn)脾IFN-γ+SFC增多，流式細(xì)胞儀提示脾CD8+T細(xì)胞增加。HIV-1的env基因編碼前體蛋白gp160，gp160可分解為gp120和gp41。Wu 等[23]將 env基因插入 pTV-VSVNJ得 pTVVSVNJ-env，加入輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，對(duì)重組病毒進(jìn)行陽性篩選，Western印跡表明重組病毒呈現(xiàn)的160 kD的gp160蛋白、120 kD的gp120蛋白和41 kD的GP41蛋白可被陽性血清所識(shí)別。Haglund等[24]以pBSgpⅡa為模板擴(kuò)增1.98 kb的Gag基因，插入 pVSV-MXA2得 pVSV-Gag，與pVSV-GP160重組得 pVSV-GagEnV，與 pVSV-89.6G重組得pVSV-GagEnVG，加入輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，對(duì)重組病毒進(jìn)行陽性篩選，Western印跡表明重組病毒呈現(xiàn)的55kD的P55蛋白和120 kD的gp120蛋白可被陽性血清所識(shí)別。Fuchs等[25]將 4.6×103、4.6×104、4.8×105、4.2×106和3.4×107PFU重組病毒分別肌肉注射10例健康志愿者，第一次注射后8周加強(qiáng)1次，血清中和抗體在第一次注射后2～10周提升，第一次注射后10周提升較高，第一次注射后10周經(jīng)ELISPOT提示血PBMC中IFN-γ+SFCS增加，F(xiàn)ACS表明血PBMC中IFN-γ+、IL-2+、CD4+T細(xì)胞以及CD40L+CD4+T細(xì)胞增多，以3.4×107PFU接種組的效果較好。

Tsuruno等[26]以pSGP34-1為模板擴(kuò)增OX40L基因，插入pVSVΔG-CC4得pVSVΔG-CC4XL，加輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，對(duì)重組病毒進(jìn)行陽性篩選，免疫熒光顯示重組病毒可以表達(dá)融合蛋白分子。體外試驗(yàn)表明用重組病毒處理HIV-1感染的molt-4/ⅢB/OX40細(xì)胞可增加細(xì)胞的融合，降低細(xì)胞內(nèi)的病毒負(fù)荷。Okuma等[27]將CD4/CCR5基因插入pVSVΔG得pVSVΔG-CD4/CCR5，加輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，對(duì)重組病毒進(jìn)行陽性篩選，免疫熒光顯示重組病毒可以表達(dá)融合蛋白分子。將1×107人PBMC腹腔注射BALB/cARag2-RC-鼠，2 d后腹腔注射5 ng的HIV-1JRCSF病毒進(jìn)行感染，3 d后腹腔注射4×106PFU重組病毒進(jìn)行免疫治療，治療后7 d后取腹腔灌洗液，分離巨噬細(xì)胞，F(xiàn)ACS提示HIV-1感染CD4+CD8+T細(xì)胞下降9%，而對(duì)照組下降61%。

1.2.2 猴免疫缺陷病毒 猴免疫缺陷病毒（Simi?an immunodeficiency virus，SIV）與HIV的核苷酸序列相似度較高，對(duì)CD4+T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞均具有親嗜性。Egan等[28]將5×106PFU的rVSV-Gag疫苗肌肉注射或滴鼻接種恒河猴，第一次接種后8、16周加強(qiáng)2次，血清IgG和中和抗體在第一次接種后2～18周提升，第一次接種后18周提升較高。ELISPOT顯現(xiàn)血PBMC中IFN-γ+SFC在免疫后2～18周增多，第一次接種后10周提升較高，F(xiàn)ACS提示血PBMC中CD3+CD8+T細(xì)胞在第一次接種后2～18周提升，第一次接種后10周提升較快，在第一次接種后21周陰道內(nèi)滴入600 TCID50猴免疫缺陷病毒SHIV896PD株進(jìn)行攻擊，攻擊后98 d血清的病毒負(fù)荷下降至1/105，F(xiàn)ACS證實(shí)免疫組血PBMC中CD4+T細(xì)胞丟失50%，而對(duì)照組丟失90%。Okuma等[29]以pCD-CCR5為模板擴(kuò)增CCR5基因，插入 pVSVΔG 得 pVSVΔG-CCR5，與 pBSCD4重組得pVSV-CCR5-CD4，與pCD-DC-SIGN重組得pVSV-CCR5-CD4-DC-SIGN，加輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，對(duì)重組病毒進(jìn)行陽性篩選，Western印跡表明重組病毒呈現(xiàn)的60 kD的CD4蛋白可被陽性血清所識(shí)別。體外試驗(yàn)提示重組病毒可殺死SIV感染的細(xì)胞株，降低感染細(xì)胞內(nèi)的病毒負(fù)荷。

1.2.3 猴逆轉(zhuǎn)錄病毒2型 猴逆轉(zhuǎn)錄病毒2型（Simian retrovirus type 2，SRV-2）可感染恒河猴和豬尾猴，主要引起免疫抑制疾病。將重組Env蛋白免疫豬尾猴可產(chǎn)生一定的保護(hù)力[30]。Gautam等[31]以SRV-2總RNA為模板擴(kuò)增Env基因，插入p3X-FLAG得 p3X-env，與 pVSV-XN2重組得pVSV-EnV，加入輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，對(duì)重組病毒進(jìn)行陽性篩選，Western印跡表明重組病毒呈現(xiàn)的75 kD的Env蛋白可被陽性血清所識(shí)別。將1×107PFU疫苗滴鼻接種恒河猴，第一次接種后1個(gè)月加強(qiáng)1次，第一次接種后2個(gè)月經(jīng)FACS提示血PBMC中CD20+B細(xì)胞增加，但CD4+T細(xì)胞無變化，此時(shí)靜脈注射2×106PFU猴逆轉(zhuǎn)錄病毒2型有毒株進(jìn)行攻擊，攻擊后3個(gè)月接種組血清的病毒負(fù)荷顯著降低，接種組和對(duì)照組存活率分別為100%（4/4）和0（0/4）。

1.3 冠狀病毒

1.3.1 嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒 嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒（Severe acute respiratory syn?drome coronavirus，SARS-CoV）的棘突蛋白（S蛋白）是一種結(jié)構(gòu)蛋白，St19是刪除了C端19個(gè)氨基酸殘基的S蛋白，將其DNA疫苗接種小鼠可誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生[32]。Fukushi等[33-34]以SARS-CoV的cDNA為模板擴(kuò)增St19基因，插入pVSVΔG得pVSVΔG-St19，加入輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，對(duì)重組病毒進(jìn)行陽性篩選，Western印跡表明重組病毒呈現(xiàn)的180 kD的St19蛋白可被陽性血清所識(shí)別。體外試驗(yàn)提示33/34份SARS-CoV患者的血清可中和重組病毒的活性。Ge等[35]以SARS-CoV的cDNA為模板擴(kuò)增S基因，插入pCAGGS得pCAGGS-S，加輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，對(duì)重組病毒進(jìn)行陽性篩選，免疫熒光顯示重組病毒可以表達(dá)融合蛋白，體外試驗(yàn)表明SARS-CoV感染的患者血清可阻斷重組病毒感染Vero E6細(xì)胞株。Kapadia等[36]以pVSV-S為模板擴(kuò)增S基因，插入pVSV-XN2得pVSVXN2-S，加輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，對(duì)重組病毒進(jìn)行陽性篩選，Western印跡表明重組病毒呈現(xiàn)的180 kD的S蛋白可被陽性血清識(shí)別。將5×105PFU疫苗肌肉注射BALB/c鼠，血清IgG在第一次注射后4～13周提升，第一次注射后5周提升較高，滴度可達(dá)1∶906。

1.3.2 豬流行性腹瀉病毒 豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）感染是豬流行性腹瀉的病因之一。病毒的棘突蛋白（S蛋白）主要參與病毒的黏附和融合，St19是刪除C端19個(gè)氨基酸殘基的S蛋白，可誘導(dǎo)仔豬產(chǎn)生一定的保護(hù)力[37]。Ke等[38]以PEDV的基因組DNA為模板擴(kuò)增St19基因，插入pVSVMT得pVSV-St19，加輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，對(duì)重組病毒進(jìn)行陽性篩選，Western印跡表明重組病毒呈現(xiàn)的170 kD的St19蛋白可被陽性血清識(shí)別。將1×107PFU重組病毒肌肉注射仔豬，第一次注射后2和4周加強(qiáng)2次，第一次注射后6周血清中和抗體提升，此時(shí)口服100 TCID50豬流行性腹瀉病毒SH2012株進(jìn)行攻擊，攻擊后10 d直腸拭子的病毒負(fù)荷顯著降低，免疫組和對(duì)照組存活率分別為100%（10/10）和 0（0/10）。

1.4 副粘病毒

1.4.1 呼吸道合胞病毒 呼吸道合胞病毒（Respi?ratory syncytial virus，RSV）感染主要引起嬰幼兒毛細(xì)支氣管炎和支氣管肺炎，重組G/F蛋白在RSV的黏附和融合中起作用，它們可誘導(dǎo)棉鼠產(chǎn)生一定的保護(hù)力[39]。Kahn等[40-41]將G/F基因插入pVSVΔG得pVSVΔG-G/F，加輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，對(duì)重組病毒進(jìn)行陽性篩選，Western印跡表明重組病毒呈現(xiàn)的90 kD的G蛋白和140 kD的二聚體F蛋白可被陽性血清識(shí)別。將1.25×103PFU重組病毒滴鼻接種BALB/c鼠，第一次接種后4周加強(qiáng)1次，第一次接種后6周血清IgG和中和抗體提升，第一次接種后8周用1.2×105PFU呼吸道合胞病毒進(jìn)行滴鼻攻擊，攻擊后4 d，rVSV-G接種組、rVSV-F接種組和對(duì)照組每克肺組織的病毒負(fù)荷分別為106、50和106PFU，提示rVSV-F疫苗可產(chǎn)生較好的保護(hù)力。Johnson等[42]以p5039為模板擴(kuò)增F基因，插入pVSV-Gstem得pVSV-F，加輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，對(duì)重組病毒進(jìn)行陽性篩選，Western印跡表明重組病毒呈現(xiàn)的70 kD的F蛋白可被陽性血清識(shí)別。將107PFU重組病毒肌肉注射BALB/c鼠，第一次注射后4周加強(qiáng)1次，第一次注射后8周血IgG、IgG1和IgG2a提升，IgG2a和IgG1比值大于1，此時(shí)用106PFU呼吸道合胞病毒A2株進(jìn)行滴鼻攻擊，攻擊后7 d接種組肺組織的病毒負(fù)荷下降至1/103，F(xiàn)ACS證實(shí)肺和脾IFN-γ+/IL-2+/TNF-α+CD8+T細(xì)胞及CD62LCD44+記憶性T細(xì)胞增加。Wilmschen等[43]人工合成密碼子優(yōu)化的Fsyn基因，將其插入pVSVΔG得pVSVΔG-Fsyn，加入輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，對(duì)重組病毒進(jìn)行陽性篩選，Western印跡表明重組病毒呈現(xiàn)的140 kD的二聚體F蛋白可被陽性血清識(shí)別。將106PFU重組病毒肌肉注射BALB/c鼠，第一次注射后4和8周加強(qiáng)2次，第一次注射后12周血清IgG提升，第一次注射后16周用106PFU呼吸道合胞病毒進(jìn)行滴鼻攻擊，攻擊后5 d免疫組肺組織的病毒負(fù)荷下降至1/103。

1.4.2 尼帕病毒 尼帕病毒（Nipah virus，NiV）主要引起呼吸道感染，重癥常伴有病毒性腦炎等并發(fā)癥。糖蛋白（G）和融合蛋白（F）是病毒包膜的主要成分，將它們接種貓可抵抗尼帕病毒的致死攻擊[44]。Lo等[45]將1×106感染粒子（infectious parti?cles，IP）的rVSV-G/F疫苗肌肉注射倉鼠，注射后4周血清中和抗體提升，滴度為1∶2560～1∶5160，此時(shí)腹腔注射105TCID50尼帕病毒Malaysia株進(jìn)行攻擊，攻擊后4周，rVSV-G接種組、rVSV-F接種組和對(duì)照組的存活率分別為100%（10/10）、100%（10/10）和0（0/10）。DeBuysscher等[46]將 1×105PFU的rVSV-G疫苗腹腔注射倉鼠，第一次注射后4和6 d加強(qiáng)2次，第一次注射后9 d腹腔注射103LD50尼帕病毒Malaysia株進(jìn)行攻擊，攻擊后6周血清中和抗體提升，肺組織病變減輕，肺組織的病毒負(fù)荷降低，免疫組和對(duì)照組存活率分別為100%（6/6）和 0（0/6）。Mire等[47-48]將1×107PFU 的rVSV-G/F疫苗皮下注射雪貂，注射后4周血清IgG和中和抗體提升，此時(shí)用5×103PFU尼帕病毒進(jìn)行滴鼻攻擊，攻擊后4周腦、肺和脾組織的病毒負(fù)荷均顯著降低。隨后將1×107PFU的rVSV-G/F疫苗肌肉注射非洲綠猴，注射后4周血清中和抗體提升，滴度為1∶640，此時(shí)氣管內(nèi)注射5×105PFU尼帕病毒B株進(jìn)行攻擊，攻擊后4周接種組和對(duì)照組存活率分別為100%（3/3）和0（0/3）。Prescott等[49]將1×107PFU的rVSV-G疫苗肌肉注射非洲綠猴，注射后2周血清IgG提升，F(xiàn)ACS顯示血PBMC中IFN-γ+CD8+T細(xì)胞增加，此時(shí)氣管內(nèi)注射105TCID50尼帕病毒Malaysia株進(jìn)行攻擊，攻擊后2周肺組織的病毒負(fù)荷下降至1/104。

1.5 沙粒病毒

1.5.1 拉沙病毒 拉沙病毒（Lassa virus，LasV）感染是病毒性出血熱的病因之一，其基因組的S片段編碼核蛋白（NP）和糖蛋白前體（GPC），它們均是有希望的免疫分子[50-51]。Satronetz等[52]以LasV的總RNA為模板擴(kuò)增NP基因，插入pVSV4.1得pVSV4.1-NP，加入輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，對(duì)重組病毒進(jìn)行陽性篩選，免疫熒光顯示重組病毒可以表達(dá)融合蛋白。將1×106PFU重組病毒腹腔注射豚鼠，注射后4周用104TCID50拉沙病毒Z-132株進(jìn)行腹腔注射攻擊，攻擊后45 d血、肝、肺和脾組織的病毒負(fù)荷降低，免疫組和對(duì)照組存活率分別為 100%（9/9）和0（0/5）。Stein等[53]將 1×106PFU的rVSV-GPC腹腔注射豚鼠，注射后4周用104TCID50拉沙病毒Soromba-R株進(jìn)行攻擊，攻擊后42 d肺和脾組織的病毒負(fù)荷降低，免疫組和對(duì)照組存活率分別為100%（6/6）和16.7（2/6）。

1.5.2 淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒 淋巴細(xì)胞脈絡(luò)膜炎病毒（Lymphocytic choriomeningitis virus，LCMV）的糖蛋白gP具有嗜神經(jīng)性[54]。Muik等[55]以LCMV基因組的DNA為模板擴(kuò)增gP基因，插入pVSVΔG得pVSVΔG-GP，加輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，對(duì)重組病毒進(jìn)行陽性篩選，免疫熒光顯示重組病毒可以表達(dá)融合蛋白。

1.6 腸道病毒

1.6.1 柯薩奇病毒B3型 柯薩奇病毒B3型（Cox?sackievirus type 3，CVB3）感染是病毒性心肌炎的病因之一。VP1蛋白是一種結(jié)構(gòu)蛋白，可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生一定的保護(hù)力[56]。Wu等[57-58]以CVB3的基因組DNA為模板擴(kuò)增VP1基因，插入pVSV-XN2得pVSVXN2-VP1，加輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，對(duì)重組病毒進(jìn)行陽性篩選，Western印跡表明重組病毒呈現(xiàn)的VP1蛋白可被陽性血清識(shí)別。將1×105PFU重組病毒滴鼻接種BALB/c鼠，接種后2周血清IgG、糞SIgA升高，脾細(xì)胞CTL反應(yīng)增強(qiáng)，F(xiàn)ACS顯現(xiàn)脾IFN-γ+/IL-2+/TNF-α+CD4+T細(xì)胞增加，此時(shí)肌肉注射3 LD50柯薩奇病毒B3型進(jìn)行攻擊，攻擊后2周接種組和對(duì)照組存活率分別為50%（6/12）和0（0/12），接種組的心肌炎癥減輕。

1.6.2 腸道病毒71型 腸道病毒71型（Enterovi?rus type 71，EV71）感染可導(dǎo)致幼兒手足口病，VP1蛋白是一種有效的疫苗候選分子。Yan等[59]以pCD-EV71為模板擴(kuò)增VP1基因，插入pVSVXN2得pVSV-VP1，加輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，對(duì)重組病毒進(jìn)行陽性篩選，Western印跡表明重組病毒呈現(xiàn)的VP1蛋白可被陽性血清識(shí)別。將107PFU重組病毒肌肉注射BALB/c鼠，第一次注射后3周加強(qiáng)1次，第一次注射后5周血清IgG提升，脾細(xì)胞產(chǎn)生大量IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-10等細(xì)胞因子，此時(shí)腹腔注射106PFU腸道病毒71型進(jìn)行攻擊，攻擊后13 d接種組和對(duì)照組存活率分別為100%（5/5）和20%（1/5）。

1.6.3 口蹄疫病毒 口蹄疫病毒（Foot-andmouth disease virus，F(xiàn)MDV）感染可引起口蹄疫。將VP1蛋白的DNA疫苗接種小鼠可誘導(dǎo)一定的抵抗力[60]。Capozzo等[61]以口蹄疫病毒C3株的基因組DNA為模板擴(kuò)增VP1基因，插入pVSV得pVSV-VP1，加輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，對(duì)重組病毒進(jìn)行陽性篩選，Western印跡表明重組病毒呈現(xiàn)的60 kD的VP1蛋白可被陽性血清識(shí)別。將5×107PFU重組病毒肌肉注射5月齡小牛，血清IgG在第一次注射后2～14周提升，第一次注射后14周血清IFN-γ升高。

1.7 乳頭瘤病毒

1.7.1 人乳頭瘤病毒16型 人乳頭瘤病毒16型（Human papillomavirus type 16，HPV-16）可導(dǎo)致宮頸癌和生殖器感染。重組E6E7蛋白具有一定的抗瘤活性[62]。Liao等[63]以HPV16的基因組DNA為模板擴(kuò)增E7基因，插入pVSV-XN1得pVSVE7，加輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，對(duì)重組病毒進(jìn)行陽性篩選，Western印跡表明重組病毒呈現(xiàn)的20 kD的E7蛋白可被陽性血清識(shí)別。將5×104TC-1癌細(xì)胞株皮下注射C57BL/6鼠建立腫瘤模型，建模后1周肌肉注射5×106PFU重組病毒進(jìn)行免疫治療，治療后1周脾CTL反應(yīng)增加，F(xiàn)ACS顯現(xiàn)脾IFN-γ+CD8+T細(xì)胞增多，治療后4周接種組的腫瘤數(shù)目減少，腫瘤體積縮小。

1.7.2 棉尾兔乳頭狀瘤病毒 棉尾兔乳頭瘤病毒（Cottontail rabbit papillomavirus，CRPV）感染可導(dǎo)致兔乳頭瘤。L1蛋白和E7蛋白在病毒復(fù)制和致病過程中起作用，是有效的免疫分子[64]。Reuter等[65]以pLAⅡ-CRPV為模板擴(kuò)增L1基因，插入pVSVMXA2XN2得PVSV-L1，加輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，對(duì)重組病毒進(jìn)行陽性篩選，Western印跡表明重組病毒呈現(xiàn)的55 kD的L1蛋白可被陽性血清識(shí)別。將5×105PFU重組病毒滴鼻接種新西蘭大白兔，第一次接種后7周加強(qiáng)1次，第一次接種后13周血清中和抗體提升，滴度為1∶6400～1∶12 800，此時(shí)用5×105PFU棉尾兔乳頭瘤病毒進(jìn)行滴鼻攻擊，攻擊后8周接種組和對(duì)照組的 保 護(hù) 力 分 別 為 100%（10/10）和 0（0/12）。Brandsma等[66]以pShuttle-E7為模板擴(kuò)增E7基因，插入pVSV-XN2得pVSV-E7，加輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，對(duì)重組病毒進(jìn)行陽性篩選，免疫熒光顯示重組病毒可以表達(dá)融合蛋白。首先將5×105PFU棉尾兔乳頭瘤病毒感染新西蘭大白兔，隨后皮下注射4×107PFU重組病毒進(jìn)行免疫治療，治療后11周血清中和抗體升高，滴度為1∶640～1∶1813，治療組的腫瘤數(shù)目和體積減少。

1.8 布尼亞病毒

1.8.1 漢坦病毒 漢坦病毒（Hantavirus）感染可導(dǎo)致流行性出血熱，其基因組M片段編碼的包膜糖蛋白前體（GPC）具有較強(qiáng)的免疫原性[67]。Ogino等[68]以漢坦病毒的總RNA為模板擴(kuò)增GPC基因，插入pCAGGSmcs得pCAGGS-GPC，加輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，對(duì)重組病毒進(jìn)行陽性篩選，免疫熒光顯示重組病毒可以表達(dá)融合蛋白。Lee等[69]將1×107PFU重組病毒皮下注射BALB/c鼠，第一次注射后3和6周加強(qiáng)2次，第一次注射后7周血清IgG和中和抗體提升，F(xiàn)ACS顯示脾IFN-γ+CD8+T細(xì)胞增加，此時(shí)腹腔注射4個(gè)病灶形成單位（fo?cus-forming units，F(xiàn)FU）漢坦病毒 76-118株進(jìn)行攻擊，攻擊后3周接種組和對(duì)照組存活率分別為100%（8/8）和0（0/8）。

1.8.2 辛諾柏病毒和安第斯病毒 辛諾柏病毒（Sin Nombre virus，SNV）和安第斯病毒（Andes vi?rus，ANDV）都是新型漢坦病毒，可引起漢坦病毒心 肺 綜 合 征（Hantaviruscardiopulmonary syn?drome，HCPS）。重組GPC蛋白可裂解為G1和G2蛋白，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生一定的保護(hù)力[70]。Warner等[71]以SNV/ANDV的總RNA為模板擴(kuò)增GPC基因，插入pVSVΔG得pVSVΔG-GPC，加輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Vero E6細(xì)胞，對(duì)重組病毒進(jìn)行陽性篩選，免疫熒光顯示重組病毒可以表達(dá)融合蛋白。將105PFU重組病毒腹腔注射倉鼠，注射后4周血清中和抗體提升，此時(shí)腹腔注射2×105PFU辛諾柏病毒進(jìn)行攻擊，攻擊后1周血、肝、脾和肺組織的病毒負(fù)荷下降至1/103，接種組和對(duì)照組存活率分別為100%（6/6）和16.7%（1/6）。Brown等[72]將105PFU重組病毒腹腔注射倉鼠，注射后4周血清IgG和中和抗體升高，此時(shí)腹腔注射100 LD50安第斯病毒進(jìn)行攻擊，攻擊后2周接種組和對(duì)照組存活率分別為100%（12/12）和0（0/9）。

1.8.3 克里米亞-剛果出血熱病毒 克里米亞-剛果出血熱病毒（Crimean-Congo haemorrhagic fe?ver virus，CCHFV）感染可引起克里米亞-剛果出血熱，該病的主要癥狀是發(fā)熱、頭痛、出血和低血壓休克等。其基因組M節(jié)段編碼的GPC蛋白可裂解為Gn和Gc蛋白，含有中和抗體表位[73]。Ro?driguez等[74]以CCHFV的總RNA為模板擴(kuò)增GPC基因，插入pVSVΔG得pVSV-GPC，加輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，對(duì)重組病毒進(jìn)行陽性篩選，Western印跡表明重組病毒呈現(xiàn)的80 kD的GPC蛋白可被陽性血清識(shí)別。將1×107PFU重組病毒腹腔注射STAT-/-鼠，第一次注射后3周加強(qiáng)1次，第一次注射后5周血清中和抗體提升，此時(shí)腹腔注射100PFU克里米亞-剛果出血熱病毒Ibar10200株進(jìn)行攻擊，攻擊后5周接種組和對(duì)照組存活率分別為100%（10/10）和0（0/10）。

1.9 皰疹病毒

1.9.1 巨細(xì)胞病毒 巨細(xì)胞病毒（Cytomegalovi?rus，CMV）感染是胎兒先天性畸形的病因之一。其基因組的UL55編碼150 kD的糖蛋白B（gB）可誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生[75]。Wilson等[76]以pCMV-gB為模板擴(kuò)增gB基因，插入pVSV-XN2得pVSV-gB，加輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，對(duì)重組病毒進(jìn)行陽性篩選，免疫熒光顯示重組病毒可以表達(dá)融合蛋白。將5×106PFU重組病毒滴鼻接種BALB/c鼠，接種后4周血清中和抗體提升，滴度為1∶42 000～1∶84 000，脾細(xì)胞產(chǎn)生大量IFN-γ，此時(shí)腹腔注射2.25×103PFU巨細(xì)胞病毒Smith株進(jìn)行攻擊，攻擊后10 d肺、脾和唾液腺組織的病毒負(fù)荷明顯減少。

1.9.2 單純皰疹病毒2型 單純皰疹病毒2型（Herpes simplex virus type 2，HSV-2）感染可引起生殖器皰疹。糖蛋白D（gD）是一種結(jié)構(gòu)蛋白，具有較強(qiáng)的免疫原性[77]。Natuk等[78]以HSV-2的基因組DNA為模板擴(kuò)增gD基因，插入pVSV1得pVSV-gD，加輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，對(duì)重組病毒進(jìn)行陽性篩選，Western印跡表明重組病毒呈現(xiàn)的50 kD的gD蛋白可被陽性血清識(shí)別。將105PFU重組病毒滴鼻接種BALB/c鼠，第一次接種后3周加強(qiáng)1次，第一次接種后6周血清IgG提升，脾CTL反應(yīng)增強(qiáng)，脾細(xì)胞產(chǎn)生大量TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-5等細(xì)胞因子，F(xiàn)ACS顯示脾IFN-γ+CD4+T細(xì)胞增加，此時(shí)陰道內(nèi)注入100 LD50單純皰疹病毒2型186株進(jìn)行攻擊，攻擊后4周接種組和對(duì)照組的保護(hù)力分別為100%（10/10）和20%（2/10）。

1.10 其他病毒

1.10.1 禽流感病毒 禽流感病毒（Avian influen?za virus，AIV）感染可導(dǎo)致禽流感。AIV的HA蛋白DNA疫苗免疫小鼠可低抗H5N1株的攻擊[79]。Roberts等[80]將5×107PFU的rVSV-HA疫苗滴鼻接種BALB/c鼠，第一次接種后3周加強(qiáng)1次，第一次接種后5周血清IgG提升，滴度為1∶1024，血清中和抗體升高，滴度為1∶2560，此時(shí)用10 LD100禽流感病毒A/WSN株進(jìn)行滴鼻攻擊，攻擊后2周接種組和對(duì)照組存活率分別為100%（10/10）和60%（6/10）。Kalhoro等[81]以pTM1-HA為模板擴(kuò)增HA基因，插入pVSVΔG得pVSVΔG-HA，加輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，對(duì)重組病毒進(jìn)行陽性篩選，Western印跡表明重組病毒呈現(xiàn)的50 kD的HA1和25 kD的HA2蛋白可被陽性血清識(shí)別。將2×107PFU重組病毒肌肉注射3周齡仔雞，第一次注射后3周加強(qiáng)1次，第一次注射后5周血清中和抗體提升，此時(shí)用107EID50禽流感病毒H7N1株進(jìn)行點(diǎn)眼滴鼻攻擊，攻擊后3周口咽拭子和泄殖腔拭子無病毒負(fù)荷，接種組和對(duì)照組存活率分別為100%（10/10）和0（0/10）。

Barefoot等[82-83]以禽流感病毒PR8株的基因組DNA為模板擴(kuò)增HA和NP基因，插入pVSV-XN2得pVSV-HA/NP基因，加輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，對(duì)重組病毒進(jìn)行陽性篩選，Western印跡表明重組病毒呈現(xiàn)的60 kD的HA蛋白和NP蛋白可被陽性血清識(shí)別。將2.5×106PFU的rVSV-HA和2.5×106PFU的rVSV-NP組成混合疫苗后滴鼻接種C57BL/6鼠，第一次接種后1周FACS顯示脾和支氣管肺泡灌洗液（BALF）中CD8+T細(xì)胞增加，第一次接種后5周血清中和抗體提升，此時(shí)用100 MLD50禽流感病毒PR8株進(jìn)行滴鼻攻擊，攻擊后2周免疫組和對(duì)照組存活率分別為100%（10/10）和 0（0/10）。然后用 100 MLD50禽流感病毒PR8株滴鼻感染BALB/c鼠，隨后通過肌肉注射途徑用5×108PFU的rVSV-HA疫苗進(jìn)行免疫治療，治療后10 d血清中和抗體提升，F(xiàn)ACS顯示血PBMC中CD8+T細(xì)胞增加，但肺組織的病毒負(fù)荷無明顯減少，接種組和對(duì)照組存活率分別為100%（10/10）和20%（2/10）。

Schwartz等[84-86]以禽流感病毒H5N1株的總RNA為模板擴(kuò)增HA基因，插入pBSK得pBS-HA，與pVSV-XN2重組得pVSV-HA，加輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，對(duì)重組病毒進(jìn)行陽性篩選，Western印跡表明重組病毒呈現(xiàn)的50 kD的HA蛋白可被陽性血清識(shí)別。將106PFU重組病毒肌肉注射BALB/c鼠，第一次注射后4周加強(qiáng)1次，第一次注射后3個(gè)月血清中和抗體提升，分別于第一次注射后3、5.5和7.5個(gè)月用100 LD50禽流感病毒H5N1株進(jìn)行滴鼻攻擊，攻擊后2周，3個(gè)接種組的存活率均為100%（13/13）、100%（6/6）和100%（7/7），而相應(yīng)對(duì)照組的存活率均為0（0/13）、0（0/6）和0（0/7）。接著將107PFU重組病毒肌肉注射BALB/c鼠，第一次注射后2～5個(gè)月加強(qiáng)1次，第一次注射后3～5個(gè)月血清中和抗體提升，此時(shí)用100 LD50禽流感病毒H1N1異源株或H5N1同源株進(jìn)行攻擊，攻擊后3 d，H5N1攻擊組的肺病毒負(fù)荷下降至1/103，而H1N1攻擊組則下降至1/10。隨后將4×107PFU重組病毒滴鼻接種恒河猴，第一次接種后2個(gè)月加強(qiáng)1次，第一次接種后3個(gè)月血清中和抗體提升。Ryder等[87]將2×105PFU重組病毒滴鼻接種BALB/c鼠，第一次接種后4周加強(qiáng)1次，第一次接種后2個(gè)月血清中和抗體提升，此時(shí)用10 LD50禽流感病毒H1N1異源株或H5N1同源株進(jìn)行滴鼻攻擊，攻擊后2周，H1N1異源攻擊組、H5N1同源攻擊組和對(duì)照組的存活率分別為100%（12/12）、67%（8/12）和0（0/12）。

1.10.2 乙型肝炎病毒 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）基因組的S和preS2基因分別編碼P33和P36蛋白，組成中等分子包膜表面蛋白（middle envelope surface protein，MS），將 MS的DNA疫苗注射小鼠可誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答[88]。Co?bleigh等[89-90]將MS基因插入pVSV-XN2得pVSVMS，加輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，對(duì)重組病毒進(jìn)行陽性篩選，免疫熒光顯示重組病毒可以表達(dá)融合蛋白。將1×106PFU重組病毒滴鼻接種CB6F1鼠，第一次接種后3周加強(qiáng)1次，第一次接種后4周FACS顯示脾IFN-γ+/IL-2+/TNF-α+CD8+T細(xì)胞增加，第一次接種后8周肌肉注射10 μg PT-HBV1-3進(jìn)行攻擊，攻擊后1周肝臟的病毒負(fù)荷降低。接著，將50 μg pCMV-S2/S肌肉注射HBV+CB6F1轉(zhuǎn)基因鼠，第一次注射后3周用1×106PFU重組VSV-MS疫苗進(jìn)行滴鼻加強(qiáng)，第一次注射后4周血清IgG升高，脾CTL活性增強(qiáng)，ELISPOT證實(shí)脾IFN-γ+SFC增加。Chiale等[91]將20 μg pCD-core肌肉注射C57BL/6鼠，第一次注射后4和8周用1×106PFU的rVSV-core疫苗滴鼻加強(qiáng)2次，第一次注射后10周FACS顯示脾IFN-γ+CD8+T細(xì)胞增多，此時(shí)肌肉注射1×106PFU的rAAV-core進(jìn)行攻擊，攻擊后2周血清病毒負(fù)荷明顯降低。

1.10.3 基孔肯雅病毒 基孔肯雅病毒（Chikungu?nya virus，CHIKV）感染可引起基孔肯雅熱，該病常伴有關(guān)節(jié)痛和皮疹。包膜蛋白E2是一種有效的免疫分子[92]。Chattopadhyay等[93]以CHIKV的總RNA為模板擴(kuò)增E2基因，插入pVSVΔG得pVSVΔG-E2，加輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，對(duì)重組病毒進(jìn)行陽性篩選，Western印跡表明重組病毒呈現(xiàn)的50 kD的E2蛋白可被陽性血清識(shí)別。將1×107PFU重組蛋白肌肉注射BALB/c鼠，第一次注射后5周加強(qiáng)1次，第一次注射后60 d血清中和抗體提升，滴度為1∶200，此時(shí)皮下注射104PFU基孔肯雅病毒進(jìn)行攻擊，攻擊后2周接種組和對(duì)照組存活率分別為100%（4/4）和0（0/4）。

1.10.4 諾如病毒 諾如病毒（Rorovirus）感染是病毒性胃腸炎的病因之一。將重組VP1蛋白接種小鼠可誘導(dǎo)較好的免疫應(yīng)答[94]。Ma等[95]以諾如病毒基因組DNA為模板擴(kuò)增VP1基因，插入pVSV（+）得pVSV-VP1，加輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BSRTT細(xì)胞，對(duì)重組病毒進(jìn)行陽性篩選，Western印跡表明重組病毒呈現(xiàn)的60 kD的VP1蛋白可被陽性血清識(shí)別。將106PFU重組病毒滴鼻注射BALB/c鼠，注射后5周血清IgG提升，糞SIgA升高，脾細(xì)胞增殖。Zhu等[96]將5×107PFU重組病毒肌肉注射下蛋的母雞，第一次注射后2周加強(qiáng)1次，第一次注射后4周雞蛋黃內(nèi)的IgY抗體升高。

1.10.5 藍(lán)舌病毒8型 藍(lán)舌病毒8型（Blue?tongue virus serotype 8，BTV-8）是藍(lán)舌病的病原，主要感染家畜和野生嚙齒動(dòng)物。BTV-8基因組含有10個(gè)節(jié)段，其中L2節(jié)段編碼的VP2蛋白可誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生[97]。Kochinger等[98]以BTV-8的基因組DNA為模板擴(kuò)增VP2基因，插入pVSVΔG得pVSVΔG-VP2，加輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，對(duì)重組病毒進(jìn)行陽性篩選，免疫熒光顯示重組病毒可以表達(dá)融合蛋白。將1×108感染單位（infec?tious units，IU）重組病毒肌肉注射ALP綿羊，第一次注射后3周加強(qiáng)1次，第一次注射后6周血清中和抗體提升，此時(shí)靜脈注射5×106PFU藍(lán)舌病毒8型進(jìn)行攻擊，攻擊后2周血清病毒負(fù)荷降低。

1.10.6 博爾納病病毒 博爾納病病毒（Borna disease virus，BDV）具有嗜神經(jīng)性，主要感染馬、羊的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引起腦病。G基因編碼的GPC蛋白可裂解為GP1和GP2蛋白，在病毒侵襲神經(jīng)元的過程中起作用[99]。Perez等[100]以BDV基因組DNA為模板擴(kuò)增GPC基因，插入pVSVΔG得pVSVΔG-GPC，加輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，對(duì)重組病毒進(jìn)行陽性篩選，Western印跡表明重組病毒呈現(xiàn)的56 kD的GPC蛋白可被陽性血清識(shí)別。

1.10.7 牛痘病毒 牛痘病毒（Vaccinia virus，VV）存在2種感染形式，即胞內(nèi)成熟的病毒體（intra?cellular mature virions，IMV）和胞外包被的病毒體（extracellular enveloped virion，EEV），其中L1R和B5R是IMV和EEV的主要抗原，均含有中和抗體表位[101-102]。Braxton等[103]以VV基因組DNA為模板擴(kuò)增L1R和B5R基因，插入pVSV.XK4.1得pVSVL1R/B5R，加輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，對(duì)重組病毒進(jìn)行陽性篩選，Western印跡表明重組病毒呈現(xiàn)的35 kD的B5R蛋白和21 kD的L1R蛋白可被陽性血清識(shí)別。將1×105PFU重組病毒滴鼻接種BALB/c鼠，第一次接種后4周加強(qiáng)1次，第一次接種后7周血清IgG和中和抗體升高，此時(shí)用1.7×106PFU牛痘病毒W(wǎng)R株進(jìn)行滴鼻攻擊，攻擊后12 d接種組和對(duì)照組的存活率分別為100%（10/10）和0（0/10）。

2 重組水皰性口炎病毒抗細(xì)菌

2.1 結(jié)核分支桿菌

結(jié)核分支桿菌（Mycobacteria tuberculosis）感染引起的結(jié)核病可累及全身多個(gè)臟器，但以肺結(jié)核最為常見。將Ag85A蛋白的DNA疫苗注射小鼠可產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答[104]。Roediger等[105]以pJW23為模板擴(kuò)增Ag85A基因，插入pVSV-XNDG得pVSV-Ag85A，加輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞株，對(duì)重組菌進(jìn)行陽性篩選，Western印跡表明重組菌呈現(xiàn)的40 kD的Ag85A蛋白可被陽性血清識(shí)別。將1×107PFU重組腺病毒Ad5-Ag85A肌肉注射BALB/c鼠，第一次注射后3周用1×107PFU的rVSV-Ag85A疫苗滴鼻加強(qiáng)，第一次注射后5周取氣道腔、肺和脾，F(xiàn)ACS發(fā)現(xiàn)3種組織中IFN-γ+CD4+CD8+T細(xì)胞分別增加100、10和6倍，此時(shí)皮下注射1.5×104CFU結(jié)核分支桿菌H37RV株進(jìn)行攻擊，攻擊后4周肺和脾的細(xì)菌負(fù)荷分別下降至1/5和1/10左右。

TFP846是結(jié)核分支桿菌RV3615C、RV2660C和Mtb10.4抗原的融合蛋白，其DNA疫苗可誘導(dǎo)較強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答[106]。Zhang等[107]人工合成TFP848基因，插入pVSV-XN2得pVSV-TFP848，加輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，對(duì)重組菌進(jìn)行陽性篩選，Western印跡表明重組菌呈現(xiàn)的30 kD的TFP848蛋白可被陽性血清識(shí)別。將106PFU重組菌滴鼻接種BALB/c鼠，接種后2周脾細(xì)胞增殖，分泌高水平的INF-γ，接種后24周FACS顯示CD44+CD6ILlowCD25-CD4+記憶性細(xì)胞及CD44+CD6ILlowCD45R-CD8+記憶性細(xì)胞增加，此時(shí)用1×107CFU的卡介苗進(jìn)行滴鼻攻擊，攻擊后6周肺組織的細(xì)菌負(fù)荷下降至1/50左右。

2.2 潰瘍分枝桿菌

潰瘍分枝桿菌（Mycobacterium ulcerans）感染是Buruli潰瘍的病因。Mu13720是一種肽聚糖蛋白，具有較強(qiáng)的免疫原性[108]。Bolz等[109]以潰瘍分枝桿菌Agy99株的基因組DNA為模板擴(kuò)增Mul3720基因，插入 pUC57得pUC57-Mul3720，與pVSVΔG 重組得pVSVΔG-Mul3720，加輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，對(duì)重組菌進(jìn)行陽性篩選，Western印跡表明重組菌呈現(xiàn)的21 kD的Mul3720蛋白可被陽性血清識(shí)別。將107PFU重組菌肌肉注射BALB/c鼠，第一次注射后3周皮下注射30 μg重組Mul3720蛋白進(jìn)行加強(qiáng)，第一次注射后7周血清IgG提升，脾細(xì)胞產(chǎn)生大量INF-γ、IL-2和IL-10等細(xì)胞因子，此時(shí)足墊注射8.4×103CFU潰瘍分枝桿菌S1013株進(jìn)行攻擊，攻擊后60 d接種組的足墊病變明顯減輕，足墊的細(xì)菌負(fù)荷下降至1/104左右。

2.3 鼠疫耶爾森菌

鼠疫耶爾森菌（Yersinia pestis）感染可導(dǎo)致鼠疫。低鈣反應(yīng)蛋白V（low calcium reactive pro?tein V，LcrV）是一種毒力抗原，接種小鼠可產(chǎn)生有效的保護(hù)力[110]。Palin等[111]以pBS-LcrV為模板擴(kuò)增LcrV基因，插入pVSV-XN2得pVSV-LcrV，加輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，對(duì)重組菌進(jìn)行陽性篩選，Western印跡表明重組菌呈現(xiàn)的37 kD的LcrV蛋白可被陽性血清識(shí)別。將1×106PFU重組菌滴鼻接種BALB/c鼠，第一次接種后4周加強(qiáng)1次，血清IgG在第一次接種后4～18周提升，第一次接種后18周提升較高，第一次接種后5個(gè)月皮下注射104CFU鼠疫耶爾森菌C092株進(jìn)行攻擊，攻擊后2周接種組和對(duì)照組存活率分別為80%（4/5）和0（0/5）。SsLcrV是含有一個(gè)信號(hào)肽序列（SS）的LcrV。Chattopadhyay等[112]以 pBS-LcrV 為模板擴(kuò)增ssLcrV基因，插入pVSV1XN得pVSV1-ssLcrV，加輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，對(duì)重組菌進(jìn)行陽性篩選，免疫熒光顯示重組菌可以表達(dá)融合蛋白。將107、108和109PFU重組菌分別肌肉注射BALB/c鼠，血清IgG在注射后82 d升高，IgG2a與IgG1比值大于1，注射后3個(gè)月皮下注射1×104CFU鼠疫耶爾森菌C092株進(jìn)行攻擊，攻擊后2周，107、108、109PFU接種組和對(duì)照組的存活率分別為12.5%（1/8）、50%（4/8）、87.5%（7/8）和0（0/8）。

3 重組水皰性口炎病毒抗曼氏血吸蟲

曼氏血吸蟲（Schistosoma mansoni，Sm）感染可導(dǎo)致曼氏血吸蟲病，其熱激蛋白70（SmHSP70）具有一定的免疫原性[113]。Kines等[114]將SmHSP70基因插入pLNHX-EGFP得pLNHX-EGFP-SmHSP70，加輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞，對(duì)重組菌進(jìn)行陽性篩選，免疫熒光顯示重組菌可以表達(dá)融合蛋白，Southern印跡提示SmHSP70基因插入VSV的基因組中，保護(hù)力實(shí)驗(yàn)尚在進(jìn)行。

4 結(jié)語

重組水皰性口炎病毒具有下述優(yōu)點(diǎn)：VSV是一種負(fù)鏈RNA病毒，不具有感染性，必須以全長(zhǎng)cDNA的正鏈為模板轉(zhuǎn)錄基因組RNA，裸露的基因組正鏈RNA與N蛋白結(jié)合完成衣殼化，在L/P聚合酶的輔佐下作為轉(zhuǎn)錄模板，開啟VSV感染粒子的復(fù)制；VSV含有自身的RNA聚合酶，當(dāng)外源基因插入VSV載體后，能夠在聚合酶的作用下達(dá)到高水平轉(zhuǎn)錄，從而表達(dá)目的蛋白；插入的外源基因可作為一個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄單元，其轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒位于VSV的轉(zhuǎn)錄起始和終止信號(hào)，表達(dá)外源蛋白的效率較高；借助反向遺傳操作技術(shù)可人工缺失VSV囊膜G糖蛋白，使其完全被外源病毒相應(yīng)功能的囊膜蛋白取代，裝配于病毒粒子表面，形成偽型病毒，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答；VSV無反轉(zhuǎn)錄活性，不可能整合入宿主細(xì)胞的基因組中，感染后可被宿主細(xì)胞清除，生物安全性較高；VSV很少感染人體，幾乎沒有預(yù)先存在的免疫；VSV可以自然感染機(jī)體黏膜，可進(jìn)行黏膜免疫；VSV接種劑量小，小劑量足以誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生較好的免疫應(yīng)答。

重組水皰性口炎病毒存在下述不足：非復(fù)制型機(jī)理的研究尚不深入；表達(dá)載體缺乏高效啟動(dòng)子或增強(qiáng)子，導(dǎo)致表達(dá)效率較低；載體抗原和靶抗原可能存在競(jìng)爭(zhēng)；母源抗體的干擾可影響重組VSV的接種效果。

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，人們將對(duì)病毒、細(xì)菌和寄生蟲的基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)以及表觀遺傳學(xué)等進(jìn)行深入的探索，從而闡明病原蛋白的抗原結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，篩選新的抗原分子，構(gòu)建由各期抗原分子組成的多期多價(jià)疫苗。在重組水皰性口炎病毒的構(gòu)建過程中，要深入了解各個(gè)啟動(dòng)子的特性，弄清啟動(dòng)子之間的相互作用是否影響外源基因的表達(dá)；選用不同的啟動(dòng)子構(gòu)建載體能否提高重組水皰性口炎病毒的遺傳穩(wěn)定性；不同啟動(dòng)子的反向串聯(lián)能否減少目的基因在轉(zhuǎn)錄水平上的干擾，促進(jìn)目的基因的表達(dá)；重組水皰性口炎病毒共表達(dá)多種病原蛋白的探索；新型佐劑和疫苗載體的研制。相信隨著這些問題的闡明，必將推動(dòng)重組水皰性口炎病毒疫苗的研究躍上一個(gè)新的臺(tái)階。